Préparation d’échantillons pour la spectrométrie de masse d’ionisation de l’électrospray de sonde
19 février 2020
Cet article introduit des méthodes de préparation d’échantillons pour une méthode d’analyse unique en temps réel basée sur la spectrométrie de masse ambiante. Cette méthode nous permet d’effectuer une analyse en temps réel des molécules biologiques in vivo sans aucun prétraitement spécial.
Il s’agit donc d’une spectrométrie de masse ambiante unique, particulièrement adaptée à l’analyse d’échantillons biologiques, in vitro et in vivo. Comme cela ne nécessite pas régulièrement un prétraitement spécial des échantillons, comme le tri cellulaire, la fractionnement et la concentration, il peut analyser un échantillon avec une perte minimale de composants biologiques, en particulier ceux qui existent comme très petite quantité. Cette technique vous permet d’analyser les matières premières directement en une minute par spectrométrie de masse.
La rapidité se détériore dans la robustesse du système, principaux avantages inhérents à cette technique. Tout ce que vous avez à faire est de simplement préparer la silice, 10 milligrammes de tissu spécimen, et 10 microlitres de proliférer. Et mettez-les dans une cartouche jetable.
Il est réglé sur la machine PESI-MS, et vous obtiendrez le résultat en quelques minutes. En choisissant le spectromètre de masse approprié, vous pouvez annoter l’identité moléculaire. Pour commencer, récupérez le foie ou le tissu rénal du congélateur.
Sur une plaque de liège, couper le spécimen de tissu à environ deux par deux par deux millimètres à l’aide d’un scalpel ou d’un couteau. Alternativement, frappez l’échantillon avec le Trepan et coupez la longueur de la colonne à deux millimètres. Si le tissu est contaminé par du sang, lavez-le brièvement avec de la solution saline tamponnée de phosphate glacé.
Placer environ 10 milligrammes de l’échantillon coupé ou perforé dans un microtube en plastique et ajouter 100 microlitres de 50 % d’éthanol. Utilisez un micropestre pour homogénéiser l’échantillon. Ensuite, avec le pipetman, placez 10 microlitres de l’homogénéité dans le puits de la cartouche du spectromètre de masse.
Placez la cartouche dans la chambre d’ionisation du spectromètre de masse d’ionisation de sonde directe et installez la sonde d’aiguille de vol inoxydable qui sera employée pour l’ionisation d’échantillon. Fermez fermement le couvercle de la chambre pour activer automatiquement le dispositif de sécurité. Démarrez l’ordinateur de bord en cliquant sur l’icône de démarrage pour analyser, à l’aide des panneaux à l’écran, appliquer une tension de 2,3 kilovolts à l’aiguille pour générer l’électrospray et s’assurer que la fréquence de l’aiguille est de trois hertz.
Attendez 30 secondes pour que la mesure soit terminée. Après avoir mesuré chaque échantillon, jetez la cartouche et l’aiguille dans un disposer biohazard. Pour analyser les spectres de masse, ouvrez le logiciel associé au spectromètre de masse.
Cliquez sur le fichier L-C-D dans la fenêtre du navigateur de fichiers de données du logiciel. Choisir de cliquer sur un seul pic de la fenêtre de spectre de masse, et de représenter automatiquement un E-I-C. Vérifiez le T-I-C et l’E-I-C, et cliquez sur l’icône moyenne du spectre pour sélectionner la plage de temps pour générer le spectre de masse.
Exportez les données de texte spectral de masse. Pour analyser les fluides corporels, dessinez jusqu’à 10 microlitres de l’échantillon de sérum et distribuez-le dans un microtube de 1,5 millilitre. Ajouter 190 microlitres de 50% d’éthanol au tube, puis vortex pendant deux minutes à température ambiante.
Pour éliminer tous les globules rouges, centrifugez le liquide à 15 000 fois G pendant une à cinq minutes à quatre degrés Celsius. Transférer 10 microlitres du supernatant dans le puits de la cartouche et procéder à mesurer sur le spectromètre de masse comme précédemment. Ce protocole montre la préparation de l’échantillon pour pesi-MS sur l’échantillon solide, l’échantillon liquide, et l’animal vivant.
Le carcinome rénal humain de cellules montre des crêtes caractéristiques des lipides neutres. Il y avait des pics relativement forts dans les spectres au rapport masse-charge de 900 du tissu humain de carcinome rénal de cellules qui n’ont pas été identifiés dans le tissu non cancéreux environnant. Ces pics représentent principalement le triacyl glycérol.
L’exemple des données acquises dans les tissus normaux de foie, a dépeint la lésion néoplastique d’un patient présentant l’hépatite chronique et la cirrhose de foie. Le sérum humain de trois individus a été analysé utilisant PESI-MS, il y avait des différences claires dans les modèles spectraux parmi les individus. Pour les changements métaboliques de 5-FdU injectés par voie intraveineuse dans le vaisseau arrière d’une souris, la détection très rapide et sensible de 5-FdU avec adducteur de sodium a été réalisée dans le foie in situ.
Comme la profondeur de la pointe de l’aiguille à partir du site du tissu, joue le rôle le plus important dans l’ionisation qui lit l’acquisition de données réussie, assurez-vous de suivre les instructions. Vous pouvez identifier les espèces moléculaires en regardant dans la base de données commerciale. C’est une façon de qualifier le mécanisme moléculaire de la maladie.
De nombreux chercheurs se sont intéressés à l’application de cette technique pour prédire la prospérité de la maladie et son pronostic. Surtout en utilisant la biopsie ricket. Assurez-vous juste de ne pas être piqué par l’aiguille de la sonde.
Ceci peut être simplement évité avec un instrument spécifique pour enlever l’aiguille de la machine.
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Aperçu
Cet article présente une méthode originale de spectrométrie de masse en conditions ambiantes pour l'analyse en temps réel d'échantillons biologiques in vivo. Cette technique permet d'analyser des tissus bruts sans traitements préalables particuliers, minimisant ainsi la perte de composants biologiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Spectrométrie de masse
- Analyse biologique
- Chimie analytique
Contexte
- La spectrométrie de masse en conditions ambiantes convient à l'analyse in vitro comme in vivo.
- La méthode ne nécessite pas de traitement préalable intensif des échantillons.
- Elle permet l'analyse d'échantillons avec une perte minimale des composants biologiques.
- L'analyse rapide constitue un avantage majeur de cette technique.
Objectif de l'étude
- Présenter une méthode d'analyse en temps réel des molécules biologiques.
- Démontrer l'efficacité de l'analyse de matériaux tissulaires bruts.
- Mettre en évidence les avantages de l'utilisation de la spectrométrie de masse en conditions ambiantes.
Méthodes utilisées
- Préparation d'échantillons de silice et de tissus.
- Utilisation de cartouches jetables pour l'analyse des échantillons.
- Analyse directe d'échantillons biologiques par spectrométrie de masse.
- Traitement rapide des échantillons en moins d'une minute.
Résultats principaux
- La méthode permet une analyse rapide sans perte importante de composants.
- Elle est efficace pour analyser des échantillons contenant de très faibles quantités de matériel biologique.
- Démontre une robustesse et une fiabilité dans l'analyse en temps réel.
- Facilite l'étude des molécules biologiques dans leur état natif.
Conclusions
- La spectrométrie de masse en conditions ambiantes est un outil précieux pour l'analyse biologique.
- La technique améliore la compréhension des processus biologiques.
- Elle offre une méthode rapide et efficace pour l'analyse en temps réel.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La spectrométrie de masse par ionisation électrospray à sonde (PESI-MS) permet une analyse moléculaire en temps réel d'échantillons biologiques avec un prétraitement minimal, facilitant une validation rapide des cibles et une réduction des risques mécanistiques en phase précoce de découverte. La technique nécessite seulement 10 mg de tissu ou 10 µL de sérum, ce qui la rend adaptée aux échantillons précliniques de faible volume et réduit la perte de composants biologiques. Cette capacité améliore la fiabilité prédictive dans l'identification des candidats-médicaments en fournissant des données directes, in situ, sur les métabolites et la dynamique des médicaments provenant de systèmes vivants.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en détectant les lipides neutres et les métabolites directement à partir de tissus solides comme le carcinome rénal à cellules claires.
- Valeur opérationnelle : Nécessite une préparation minimale des échantillons — simplement une homogénéisation tissulaire dans de l'éthanol à 50 % — réduisant ainsi la complexité et la variabilité du protocole.
- Valeur prédictive : Facilite la caractérisation des mécanismes moléculaires par recoupement avec des bases de données commerciales, contribuant à l'évaluation de la confiance dans la cible.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Permet l'analyse directe du sérum sanguin humain après une simple précipitation à l'éthanol et centrifugation, permettant un criblage de biomarqueurs basé sur les fluides.
- Valeur opérationnelle : Utilise des cartouches jetables et des sondes en acier inoxydable, assurant une standardisation et réduisant le risque de contamination croisée.
- Extensibilité : Facilite un renouvellement rapide des échantillons — résultats obtenus en quelques minutes — favorisant la préparation au criblage à haut débit.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet le suivi en temps réel de la dynamique des métabolites ou des médicaments dans des organes spécifiques d'animaux vivants, comme la détection de 5-FdU dans le foie de souris.
- Déminimisation des risques mécanistiques : Fournit des données moléculaires in situ sans destruction du tissu, préservant ainsi le contexte physiologique pour une meilleure translation préclinique vers clinique.
- Progression ajustée au risque : Détecte les profils spectraux associés à la maladie (par exemple, lésions néoplasiques dans un foie cirrhotique) afin d'éclairer les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La spectrométrie de masse PESI s'inscrit dans la continuité du processus de découverte, allant de la biologie précoce à l'identification de candidats, en offrant des lectures moléculaires rapides et quantitatives qui soutiennent la vérification des hypothèses et la préparation des tests.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses en détectant des signatures moléculaires spécifiques aux tissus (par exemple, les triglycérides dans le carcinome) sans fractionnement.
- Dépistage : Permet l'analyse de fluides et de tissus prêts à être testés grâce à une introduction standardisée des échantillons par cartouche.
- Analytique : Génère des données de spectrométrie de masse (pics m/z, EIC, TIC) pour des comparaisons quantitatives entre différentes conditions et individus.
- Recherche translationnelle : S'intègre à la validation préclinique en surveillant in vivo les métabolites de médicaments, comme le 5-FdU intraveineux dans la veine caudale de souris.
- Réutilisation en entreprise : Utilise un matériel réutilisable (sonde, chambre) avec des consommables jetables, permettant une standardisation entre projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en fournissant des données moléculaires directes à partir de systèmes biologiques intacts.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à une préparation normalisée des échantillons (10 mg de tissu, 10 µL de sérum, 50 % d'éthanol) et à des réglages fixes de tension et de fréquence (2,3 kV, 3 Hz).
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en permettant une détection rapide de métabolites ou de médicaments dans les modèles de maladies.
- Impact sur le portefeuille : Favorise une priorisation ajustée au risque par la détection de pics spécifiques à la maladie (par exemple, m/z 900 dans le carcinome) absents chez les témoins.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en exploitation de la spectrométrie de masse, y compris la préparation du solvant (50 % d'éthanol) et l'utilisation de la centrifugeuse pour le traitement du sérum.
- Requiert un spectromètre de masse à ionisation par sonde directe équipé d'un système de cartouche compatible et d'une sonde en acier inoxydable.
- Exige une standardisation interéquipes des procédures d'échantillonnage — découpage des tissus, homogénéisation et transfert du surnageant — afin d'assurer la cohérence des données.
- Doit tenir compte de la profondeur d'insertion de la pointe de la sonde comme paramètre critique influant sur l'efficacité d'ionisation et la qualité des données en application in vivo.
- Limité aux échantillons compatibles avec l'ionisation en milieu ambiant ; les effets de matrice peuvent nécessiter une optimisation pour les liquides biologiques complexes.
