Name: La détection de 5-Hydroxymethylcytosine dans les cellules souches neurales et le cerveau des souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Découvrez la détection de la 5-hydroxyméthylcytosine dans les cellules souches neurales et le cerveau de souris par immunofluorescence et dot-blot. Cette méthode permet d'étudier la régulation épigénétique et les troubles neurologiques.

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XL a été soutenu en partie par le National Key R-D Program of China (2017YFE0196600), et la National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31771395, 31571518). Q.S. a reçu l'appui du National Key Research and Development Program of China (2017YFC1001703) et du Key Research and Development Program of Zhejiang Province (2017C03009). W.X. a reçu le soutien de la Natural Science Foundation of Zhejiang province (LY18H020002) et du Département des sciences technologiques de la province du Zhejiang (2017C37057).

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité d'éthique animale de l'Université du Zhejiang.
1. La culture des cellules souches et neurones neuronaux neuronaux adultes
<ol><li>Isoler les cellules souches neurales adultes du cerveau d'un adulte (8-10 semaines) souris mâle C57/BL6 tel que décrit précédemment31,32.</li>
	<li>Culture cellules souches neurales adultes dans le milieu DMEM/F-12 contenant 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% Supplément B27, 1% antibiotique-antimycotique, et 2 mM L-Glutamine dans un incubateur de CO2 de 5% à 37 oC. Induire la différenciation des cellules souches neurales adultes avec 1 'M d'acide rétinoïque et 5 'M forskolin e pour 48 h comme décrit précédemment31,32.</li>
	<li>Isoler les neurones du jour embryonnaire 17 (E17) hippocampi de la souris et de la culture avec un milieu neurobasal contenant 0,25% de L-Glutamine, 0,125% GlutaMax et 2% Supplément B27 dans un incubateur de 5% CO2 à 37 oC comme décrit précédemment33.</li>
</ol>2. Perfusion transcardique de la souris
<ol><li>Préparer 10 % d'hydrate de chloral, 4 % de paraformaldéhyde (PFA) et de phosphate tamponné salin (PBS) un jour avant l'expérience, et stocker à 4 oC.</li>
	<li>Anesthésiez une souris C57 BL/6J mâle ou femelle adulte avec 10 % d'hydrate de chloral (50 mg/kg, i.p.), et assurez-vous que l'animal est profondément anesthésié en vérifiant la réaction du corps. Fixer chaque membre avec du ruban adhésif sur une planche en plastique (en position face cachée).</li>
	<li>Couper la peau, puis le muscle avec des ciseaux de chirurgie. Ouvrez la cavité thoracique à l'aide d'un ciseau chirurgical. Exposer le cœur et couper une petite partie de l'atrium droit avec un ciseaux chirurgicaux fin.</li>
	<li>Perfuser la souris avec une seringue stérilisée jetable de 10 ml du ventricule gauche avec du PBS froid (environ 30 ml par souris adulte).</li>
	<li>Perfil la souris avec 4% de PFA (environ 30 ml en 10 min par souris adulte) jusqu'à ce qu'elle soit raide.</li>
	<li>Ouvrez le crâne de la souris avec des forceps osseux. Retirer le cerveau et mettre en 5 ml de 4 % de PFA dans un tube de centrifugeuse de 15 ml pour la post-fixation à 4 oC. REMARQUE: Nettoyer la zone chirurgicale après la chirurgie a terminé.</li>
	<li>Au moins 24 h plus tard, transférez les échantillons de cerveau dans une solution de saccharose de 30% pour une déshydratation complète à 4 oC.</li>
</ol>3. Sectionnement du cerveau
<ol><li>Intégrer les échantillons de cerveau dans un composé optimal de température de coupe (OCT) dans un petit récipient, et refroidir à -20 oC pendant au moins 1 h.</li>
	<li>Section des échantillons de cerveau à une épaisseur de 20-40 m avec un microtome de cryostat.</li>
	<li>Recueillir les sections dans le PBS et les stocker à 4 oC.</li>
</ol>4. Staining immunofluorescence
<ol><li>Ramassez les sections avec les régions ciblées du cerveau et mettez-les dans une plaque de 24 puits avec PBS. Pour les cellules cultivées sur un bordereau, allez directement à l'étape 4.2.</li>
	<li>Laver avec du PBS sur le shaker à température ambiante pendant 10 min. Répétez cette double fois de plus.</li>
	<li>Retirer le PBS et traiter avec 1 M HCl préchauffé pendant 30 min à 37 oC. REMARQUE: Préparer 1 M HCl en ajoutant 1 ml d'acide chlorhydrique (36-38%) dans 10 ml d'eau dans une hotte chimique. Préchauffer 1 M HCl dans l'incubateur à 37 oC.</li>
	<li>Laver les échantillons avec du PBS pendant 5 min. Répétez cette fois de plus.</li>
	<li>Bloquer les échantillons avec PBS contenant 3% de sérum de chèvre normal et 0,1% Triton X-100 pour 1 h sur le shaker à température ambiante.</li>
	<li>Incuber les sections avec des anticorps primaires spécifiques pendant la nuit à 4 oC sur le shaker. REMARQUE: Utilisez les anticorps primaires suivants : anticorps polyclonal de lapin anti-5-hydroxymethylcytosine (1:5,000), anticorps monoclonal de souris anti-NeuN (1:500).</li>
	<li>Sortez les échantillons et incubez à température ambiante pendant 1 h.</li>
	<li>Laver les échantillons avec du PBS pendant 10 min. Répétez cette fois de plus.</li>
	<li>Incuber avec des anticorps secondaires correspondant aux anticorps primaires à température ambiante pendant 1 h sur le shaker. Couvrir la plaque d'aluminium. REMARQUE: Utilisez les anticorps secondaires suivants : Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin IgG (1:500), Alexa Fluor 568 chèvre anti-souris IgG (1:500). Counterstain noyaux avec 4-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).</li>
	<li>Laver les échantillons avec du PBS pendant 10 min sur le shaker. Répétez cette répétition deux fois de plus.</li>
	<li>Montez les sections du cerveau sur les diapositives, ajoutez une quantité appropriée de milieu de montage antifade (environ 100-150 l), et recouvrez-la de verre de couverture haut de gamme. Sceller avec du vernis à ongles.</li>
	<li>Prenez des images avec un microscope à fluorescence régulier ou confocal.</li>
</ol>5. Isolement d'ADN génomique
<ol><li>Euthanasier une souris adulte C57 BL/6J (mâle ou femelle) par luxation cervicale et enlever le cerveau.</li>
	<li>Disséquer les tissus de l'hippocampe, du cortex et du cervelet sur un plat refroidi à la glace. Moudre les tissus avec un broyeur de tissu dans 1 ml de tampon de lyse d'ADN et transférer dans le tube propre de microcentrifuge. Ajouter 250 g de protéinase K par 600 l de tampon de lyse. Pour les granulés cellulaires, ajouter directement le tampon de lyse, la protéinase K, et bien mélanger. REMARQUE: Préparer le tampon de lyse d'ADN : 5 mM EDTA, 0,2 % SDS, 200 mM NaCl en 100 mM Tris-HCl, pH 8,5. Laver et autoclaver le broyeur de tissu avant l'expérience.</li>
	<li>Le deuxième jour, ajouter environ 50 g de RNase A par échantillon pendant au moins 12 h à 37 oC.</li>
	<li>Ajouter un volume égal de phénol:chloroform:isoamyl alcool (25:24:1) et mélanger complètement.</li>
	<li>Centrifugeuse à 20 817 x g pendant 15 min, et retirez le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifuge.</li>
	<li>Ajouter 600 l de chloroforme au supernatant pour précipiter l'ADN, et bien mélanger.</li>
	<li>Centrifugeuse à 20 817 x g pendant 15 min, et retirez le supernatant dans un autre nouveau tube.</li>
	<li>Ajouter 500 oL d'isopropanol au supernatant et bien mélanger.</li>
	<li>Centrifugeàeur à 20 817 x g pendant 15 min, et retirez complètement le supernatant.</li>
	<li>Laver les précipitations avec 1 ml d'éthanol à 70 %, la centrifugeuse à 20 817 x g pendant 1 min, et retirer complètement le supernatant. Répétez une fois.</li>
	<li>Séchez complètement la pastille d'ADN.</li>
	<li>Dissoudre le granule d'ADN avec le tampon Tris-HCl (pH 8.5) à la bonne concentration.</li>
</ol>6. Blot de point d'ADN
<ol><li>Préparer les solutions: 2 M NaOH, Tris-HCl tampon (pH 8.5), 6x citrate de sodium salin (SSC).</li>
	<li>Faire le mélange d'échantillon comme tableau 1.</li>
	<li>Dénaturer les échantillons d'ADN à 100 oC pendant 10 min et refroidir sur la glace.</li>
	<li>Couper la bonne taille de la membrane de nylon (p. ex., Hybond-NMD) et rincer à l'adresse 6x SSC.</li>
	<li>Placez la membrane sur l'appareil à points et connectez-vous à la pompe à vide. Spot 6 'L de mélange par point sur la membrane.</li>
	<li>Hybrider pendant 30 min à 80 oC et bloquer la membrane de l'échantillon avec du lait sans gras dans la saline (TBS) tamponnée tris pendant 1 h.</li>
	<li>Incuber avec l'anticorps primaire à 4 oC pendant la nuit. REMARQUE : l'anticorps primaire suivant : lapin polyclonal anti-5-hydroxymethylcytosine (1:5,000).</li>
	<li>Le deuxième jour, incuber les membranes de l'échantillon à température ambiante pendant 1 h. Laver avec le SCT pendant 10 min. Répétez ce lavage deux fois de plus.</li>
	<li>Incuber la membrane avec un anticorps secondaire anti-lapin (1:5 000) pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Laver avec le SCT pendant 10 min. Répétez ce lavage deux fois de plus.</li>
	<li>Visualisez les signaux de chimiluminescence et quantifiez les intensités du signal.</li>
</ol>

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<li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+DNA+methylation%3A+mechanisms%2C+genomics%2C+and+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions.</a> Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).</li>
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</ol>

Il n'existe pas d'intérêts financiers concurrents.

Les modifications épigénétiques jouent des rôles essentiels pendant le développement, la maturation et la fonction du cerveau. Comme marqueur stable pour la modification d'ADN, le 5-hmC dynamique répond à l'adaptation comportementale, à l'activité neuronale, et est positivement corrélé avec l'expression de gène ; ainsi, il est impliqué dans la fonction normale du cerveau et du désordre neurologique4. Pour explorer sa fonction dans les cellules et les tissus, il est nécessaire de détecter l'existen...

Les modifications épigénétiques, y compris la modification de l'ADN, la modification de l'histone et la modification de l'ARN, ont été montrées pour jouer des fonctions essentielles dans divers processus biologiques et maladies1,2,3, 4 ( en plus) , 5 Annonces , 6 Annonces , 7. Pendant longtemps, la méthylation de l'ADN (c.-à-d. 5-méthylcytosine (5-mC)) a été considérée comme un marqueur épigénétique très stable et ne peut pas être modifiée davantage dans le génome. Récemment, il a été constaté que 5-mC pourrait être oxydé à 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) par TET (Ten-eleven translocations) protéines familiales, y compris TET1, TET2, et TET38,9. D'autres études montrent que 5-hmC pourrait servir de marqueur stable et jouer des rôles biologiques en régulant l'expression des gènes4,10,11,12.
Les preuves actuelles indiquent que le 5-hmC est fortement enrichi dans les tissus/cellules neuronaux par rapport à d'autres types de tissus chez les mammifères, et présente des dispositifs dynamiques pendant le développement neuronal13,14. Dans le système neuronal, les modifications épigénétiques négociées 5-hmC jouent un rôle important dans la régulation des cellules souches neurales, de l'activité neuronale, de l'apprentissage et de la mémoire, et sont impliquées dans de multiples troubles neurologiques, y compris le syndrome de Rett, l'autisme, la maladie d'Alzheimer maladie, la maladie de Huntington, etc.2,13,15,16,17,18,19,20.
Il existe plusieurs approches pour détecter 5-hmC dans les cellules et les tissus14,21,22,23,24. Ici, nous décrivons deux méthodes pour détecter l'existence de 5-hmC et quantifier le niveau global de 5-hmC : coloration d'immunofluorescence et point-blot d'ADN. Ces deux méthodes sont pratiques et sensibles, et ont été utilisées avec succès dans les études précédentes25,26,27,28,29,30. Les étapes clés de ces deux méthodes sont la dénaturation de l'ADN. Pour la coloration d'immunofluorescence de 5-hmC, le pré-traitement des échantillons avec 1 M HCl est exigé. Pour 5-hmC dot-blot, la dénaturation de l'ADN est effectuée avec la solution NaOH. Ces deux méthodes ainsi que le séquençage de la prochaine génération sont des outils très utiles pour étudier la fonction de 5-hmC.

<table><tbody><tr><td>4'-6-diamidino-2-phénylindole (DAPI )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Adobe</td><td>Photoshop Adobe Inc.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 chèvre anti-souris IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>anti-5-hydroxyméthylcytosine</td><td>Motif actif</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplément</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Supplément B27</td><td>Gibco</td><td>12580-010</td><td></td></tr><tr><td>Supplément B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Microtome cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 moyen</td><td>OmegaScientific</td><td>DM25</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique</td><td>PeproTech</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Milieu neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Vector Laboratories</td><td>Z0325</td><td></td></tr><tr><td>Membrane en nylon (Hybond&trade ;-N+ )</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td>RPN303B</tr><tr><td>OCT</td><td>Leica</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phénol : chloroforme : alcool isoamylique (25 : 24:1 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516726</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P0899-10</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>VVR</td><td>39450-01-6</td><td></td></tr><tr><td>Acide</td> <td>rétinoïqueSigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>T8210</td><td></td></tr></tbody></table>

la détection de 5-hydroxymethylcytosine dans les cellules souches neurales et le cerveau des souris

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Plusieurs modifications de l'ADN ont été identifiées dans le génome des mammifères. De cela, 5-méthylcytosine et 5-hydroxymethylcytosine-négociés mécanismes épigénétiques ont été intensivement étudiés. 5-hydroxymethylcytosine affiche des caractéristiques dynamiques pendant le développement embryonnaire et postnatal du cerveau, joue une fonction de régulation dans l'expression des gènes, et est impliqué dans de multiples troubles neurologiques. Ici, nous décrivons les méthodes détaillées comprenant la coloration d'immunofluorescence et le point-blot d'ADN pour détecter 5-hydroxymethylcytosine dans les cellules cultivées et les tissus de cerveau de la souris.

Pour révéler la distribution de 5-hmC dans l'hippocampe des souris adultes, nous avons exécuté l'immunofluorescence avec des anticorps contre des cellules neuronales (NeuN) et 5-hmC. Dans l'hippocampe, 5-hmC co-localisé bien avec le marqueur cellulaire neuronal NeuN (Figure 1A-H), suggérant un enrichissement de 5-hmC dans les neurones.
Pour déterminer la dynamique du 5-hmC pendant le développement neuronal, un point-blot a été réalisé la première ...

Ici, nous présentons un protocole pour détecter 5-hydroxymethylcytosine dans les cellules et les tissus cérébraux, utilisant la coloration d'immunofluorescence et les méthodes de point-blot d'ADN.

La détection de 5-Hydroxymethylcytosine dans les cellules souches neurales et le cerveau des souris

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Ici, nous présentons un protocole pour détecter la 5-hydroxyméthylcytosine dans les cellules et les tissus cérébraux utilisant l’immunofluorescence, la nouvelle méthode, et le point-tache d’ADN. La 5-hydroxyméthylcycytosine, c.-à-d. 5hmC, modification épigénétique atténuée, joue la fonction importante en réglementant l’expression de gène et impliquée dans les désordres neurologiques multiples.En fait, nos méthodes peuvent être utilisées pour détecter 5hmC dans plusieurs cellules et les tissus. Il est pratique et peut être effectué avec des équipements communs dans le laboratoire. Commencez par positionner la souris face vers le haut sur une planche en plastique et en fixant chaque membre avec du ruban adhésif.Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper à travers la peau et le muscle, et ouvrez la cavité thoracique. Exposez le cœur et coupez une petite partie de l’atrium droit avec de fins ciseaux chirurgicaux. À l’aide d’une seringue jetable de 10 millilitres et stérilisée, imprènuez la souris du ventricule gauche avec du PBS froid.Ensuite, perfuser la souris avec 4%PFA jusqu’à ce qu’elle soit raide. Ensuite, ouvrez le crâne avec des forceps osseux et retirez le cerveau. Placez le cerveau dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres rempli de cinq millilitres de 4% de PFA et rangez-le à quatre degrés Celsius.Après 24 heures, transférer le cerveau dans une solution de saccharose à 30% et le laisser à quatre degrés Celsius pour une déshydratation complète. Avant la section, imbed le cerveau dans le composé optimal de température de coupe et refroidir à moins 20 degrés Celsius pendant au moins une heure. Échantillons de cerveau de section à une épaisseur de 20 à 40 micromètres utilisant un microtome cryostat.Recueillir les sections dans PBS et stocker à quatre degrés Celsius. Prenez les sections cérébrales d’intérêt et mettez-les dans une plaque de 24 puits avec PBS. Laver les sections avec PBS sur un shaker pendant 10 minutes.Retirer le PBS et traiter avec de l’acide chlorhydrique hydrochlorique préchauffé d’une molaire à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. L’acide chlorhydrique est corrosif et s’il vous plaît le préparer dans la prise chimique. Ensuite, lavez les échantillons trois fois avec PBS pendant cinq minutes et bloquez-les avec PBS contenant 3% sérum de chèvre normal et 0,1%Triton X-100.Laissez les échantillons sur un shaker à température ambiante pendant une heure. Ajouter des anticorps primaires spécifiques aux sections et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius sur un shaker. Le lendemain, sortez les échantillons et laissez-les à température ambiante pendant une heure.Lavez les échantillons trois fois avec du PBS et ajoutez des anticorps secondaires. Couvrir la plaque d’aluminium et la laisser à température ambiante pendant une heure en secouant. Après l’incubation, laver les échantillons trois fois avec du PBS et les monter sur des toboggans.Ajouter 100 à 150 microlitres de support anti-fondu, couvrir d’un verre de couverture haut de gamme et sceller avec du vernis à ongles. Imagez les sections du cerveau avec un microscope régulier ou confocal. Pour isoler l’ADN génomique, commencez par disséquer les tissus de l’hippocampe, du cortex et du cervelet sur un plat refroidi à la glace.Ajouter un millilitre de tampon de lyse d’ADN et moudre les tissus. Transférer l’échantillon dans un tube de microcentrifugeuse propre et ajouter 250 microgrammes de proteinase-K pour chaque 600 microlitres de tampon de lyse. Ajouter ensuite environ 50 microgrammes de RNase A par échantillon et incuber pendant au moins 12 heures à 37 degrés Celsius.Après l’incubation, ajouter un volume égal d’alcool d’isoamyle chloroforme phénol et bien mélanger. Centrifugez le mélange selon les instructions manuscrites et transférez le supernatant dans un nouveau tube. Ajouter 600 microlitres de chloroforme au supernatant, bien mélanger et centrifugeuses selon les directives manuscrites.Transférer le supernatant dans un nouveau tube et ajouter 500 microlitres d’isopropanol. Bien mélanger et centrifugeuser à nouveau pour précipiter l’ADN. Après la centrifugation, jeter le supernatant, et laver la pastille d’ADN avec 70% d’éthanol selon les instructions manuscrites.Séchez complètement la pastille d’ADN, puis, dissolvez-la dans le tampon Tris-HCl. Avant de commencer, préparez les solutions requises et échantillonner le mélange selon les directives manuscrites. Daturez l’échantillon d’ADN en le chauffant à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis placez-le sur la glace.Coupez la taille appropriée d’une membrane en nylon et rincez-la à l’aide de 6X SSC. Placez la membrane sur un appareil à taches point et connectez la pompe à vide. Repérer les points de six microlitres sur la membrane et hybrider pendant 30 minutes à 80 degrés Celsius.Ensuite, bloquez la membrane de l’échantillon avec du lait sans gras et de la solution saline tamponnée tris, ou SCT, pendant une heure. Ajouter l’anticorps polyclonal anti-5-hydroxyméthylcytosine à la membrane et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, laissez la membrane de l’échantillon à température ambiante pendant une heure, puis lavez la membrane trois fois avec le SCT.Incuber la membrane avec l’anticorps secondaire anti-lapin pendant 30 minutes, puis, laver trois fois avec tbs. Visualiser les signaux de chimioluminescence et quantifier leur intensité. Ce protocole peut être utilisé pour visualiser la 5-hydroxyméthylcytosine, ou 5hmC, dans l’hippocampe des souris adultes.Immunofluorescence avec des anticorps contre les cellules neuronales, le 5hmC révèle qu’il ya un enrichissement de 5hmC dans les neurones. La dynamique de 5hmC pendant le développement neuronal peut être déterminée avec un essai de point-tache des échantillons d’ADN isolés des cellules souches neurales adultes proliférantes et différenciées. Les niveaux mondiaux de 5hmC augmentent de manière significative pendant la différenciation et le niveau de 5hmC dans les neurones est plus élevé que dans les cellules souches neurales.L’étape clé de cette méthode est de s’assurer que la dénaturation complète des échantillons d’ADN.

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JoVE Journal

Neuroscience

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Le EpiMark 5-HMC et le kit d'analyse 5-MC peut être utilisé pour analyser et quantifier 5-méthylcytosine et 5-hydroxyméthylcytosine au sein d'un locus de SPE spécifiques. Le kit distingue 5-MC à partir de 5-HMC par l'ajout de glucose pour le groupe hydroxyle de 5-HMC via une réaction enzymatique utilisant β-glucosyltransférase (T4-TBG). Lorsque 5-HMC survient dans le contexte de la CCBG, cette modification convertit un site clivable Mspl à un site non clivable.

Haute Sensibilité 5-hydroxyméthylcytosine détection dans le tissu cérébral des souris Balb / C

Décrit un procédé de marquage en deux étapes à l'aide β-glucosyltransférase (β-GT) pour transférer un azide-glucose à 5-HMC, suivie par click chemistry pour transférer un segment de liaison de biotine pour l'enrichissement facile et indépendante de la densité. Cette méthode d'étiquetage efficace et spécifique permet l'enrichissement de la 5-HMC avec un fond extrêmement faible et la cartographie épigénomique à haut débit via séquençage de prochaine génération.

Capture d&#39;sélectif de 5-hydroxyméthylcytosine partir de l&#39;ADN génomique

Nous décrivons ici un test in vivo de mutagenèse dans des petits nombres de cellules hématopoïétiques purifiées en utilisant le modèle de souris transgénique LacI. Le gène Lacl peut être isolé afin de déterminer la fréquence, le lieu et le type de mutants d'ADN spontanément surgi ou après l'exposition à génotoxines.

Identifier ADN mutations dans purifié hématopoïétiques cellules souches / progénitrices

L'administration de deux analogues de la thymidine, et EdU BrdU, dans des souris gravides permet l'analyse de la progression du cycle cellulaire dans les neurones et les cellules progénitrices dans le cerveau de souris embryonnaire. Cette méthode est utile pour déterminer les effets du stress génotoxique, y compris les rayonnements ionisants, au cours du développement du cerveau.

Évaluation de la progression du cycle cellulaire des cellules souches neurales et progénitrices dans le développement du cerveau de souris après un stress génotoxique

Nous décrivons ici une méthode immunochimique sensible pour cartographier la distribution spatiale des dérivés d’oxydation 5mC basée sur l’utilisation d’anticorps secondaires conjugués à la peroxydase et l’amplification du signal tyramide.

Détection des formes modifiées de Cytosine Utilisation Sensible immunohistochimie

Nouvellement découvert des formes oxydées de la 5-méthylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) et 5-carboxylcytosine (5caC) peut-être représenter des modifications d’ADN distinctes avec des rôles fonctionnels uniques. Un workflow semi quantitatif pour la visualisation de la répartition spatiale des oxi-mCs, profilage d’intensité de signal et colocalisation est décrit ici.

Immunostaining des Modifications de l’ADN : Computational Analysis of Images confocales

Nous présentons une méthode efficace et reproductible pour isoler et de la culture des cellules progénitrices neurales de tissus du cerveau embryonnaire et postnatale pour l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) de l’histone 3 lysine 79 MBD (H3K79me2) - une marque d’histone agrave la domaine globulaire de l’histone 3.

Isolement et culture des progéniteurs neurones suivie par immunoprécipitation de la chromatine de marque d’Histone 3 Lysine 79 MBD

L’objectif de ce rapport est de décrire le protocole pour la détection immunohistochimique robuste de marqueurs épigénétiques, 5-méthylcytosine (5mC) et 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) dans le développement et postmitotiques rétine de souris.

La détection immunohistochimique de la 5-méthylcytosine et 5-hydroxyméthylcytosine dans l’élaboration et de la rétine de souris ici

L’essai méthylé d’immunoprécipitation d’ARN est une méthode anticorps-basée employée pour enrichir pour des fragments méthylés d’ARN. Couplé à un séquençage profond, il conduit à l’identification des transcriptions portant la modification m5C.

Essai méthylé d’immunoprécipation d’ARN pour étudier la modification m5C dans Arabidopsis

La capacité de marquer de façon permanente les cellules souches et leur descendance avec un fluorophore à l’aide d’une lignée transgénique inductible traçant la lignée de souris permet une analyse spatiale et temporelle de l’activation, de la prolifération, de la migration et / ou de la différenciation in vivo. Le traçage de la lignée peut révéler de nouvelles informations sur l’engagement de la lignée, la réponse aux interventions et la multipotence.

Traçage de la lignée des cellules souches inductibles marquées par fluorescence dans le cerveau de souris adulte

Cet article décrit un protocole pour la surveillance spatio-temporelle rapide et efficace de la méthylation normale et aberrante de la cytosine dans des embryons intacts de poisson-zèbre.

Surveillance spatio-temporelle rapide et efficace de la méthylation normale et aberrante de la cytosine dans des embryons intacts de poisson-zèbre

Découvrez la détection de la 5-hydroxyméthylcytosine dans les cellules souches neurales et le cerveau de souris par immunofluorescence et dot-blot. Cette méthode permet d'étudier la régulation épigénétique et les troubles neurologiques.

La détection de 5-Hydroxymethylcytosine dans les cellules souches neurales et le cerveau des souris

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