Génotypage et quantification de l'hybridation in situ Taining in Zebrafish
January 28th, 2020
Les technologies d'édition génétique ont permis aux chercheurs de générer des mutants de poissons zèbres pour étudier la fonction génique avec une relative facilité. Ici, nous fournissons un guide pour effectuer le génotypage d'embryons parallèles et la quantification des signaux d'hybridation in situ chez le poisson zèbre. Cette approche impartiale offre une plus grande précision dans les analyses phénotypiques basées sur l'hybridation in situ.
Les conséquences des mutations sur l’expression des gènes sont souvent évaluées qualitativement par hybridation in situ et généralement notées visuellement, ce qui est subjectif et biaisé par les attentes du chercheur. Cette méthode fournit un moyen plus cohérent de comparer les expériences in situ en quantifiant les intensités d’image et supprime ce biais. Cela peut également être facilement adapté à d’autres systèmes modèles qui utilisent l’hybridation in situ comme lecteur d’une expression génétique.
Commencez par l’imagerie des embryons tachés d’hybridation in situ ou d’ISH. Préparer une solution de glycérol et la mélanger pour homogénéiser. Transférez les embryons à la solution glycérol avec une pipette Pasteur de trois millilitres et laissez-les se contenter d’au moins cinq minutes.
Préparez et étiquetez suffisamment de tubes PCR pour transférer les embryons tachés d’ISH après l’imagerie, puis utilisez une pipette Pasteur de trois millilitres pour ajouter 100% glycérol au fond du puits d’une glissade de dépression de verre. Transférez un seul embryon taché d’ISH sur la lame de verre et orientez-le sous un microscope stéréo équipé d’un appareil photo numérique et d’un éclairage inférieur et supérieur. À l’aide du premier embryon, ajustez l’éclairage et le temps d’exposition au grossissement désiré.
Imagez autant d’embryons que nécessaire et étiquetez chaque image avec un nombre unique. Après l’imagerie, transférer chaque embryon dans un tube PCR étiqueté avec le même nombre et, si nécessaire, aspirer l’excès de glycérol des tubes PCR. Pour extraire l’ADN, ajouter 40 à 75 microlitres d’un tampon de lyse alcaline tel que HoTSHOT à chaque tube.
Incuber les tubes à 95 degrés Celsius pendant environ 30 minutes, puis les refroidir à quatre degrés Celsius. Ajoutez un volume égal de tampon de neutralisation et procédez au génotypage pour la mutation d’intérêt. Pour effectuer l’analyse d’image, sélectionnez et ouvrez l’image aux Fidji et inversionz-la en cliquant sur Modifier puis Inversez, puis convertissez le type d’image en 8 bits en cliquant sur l’onglet Image, en sélectionnant type et en sélectionnant 8 bits.
Sélectionnez l’outil polygone et dessinez manuellement la région d’intérêt ou le retour sur investissement sur l’image autour de la région qui contient le signal ISH à mesurer. Appuyez sur T pour ouvrir le gestionnaire de roi et sélectionner la région d’intérêt, puis cliquez sur Mesurer. Copiez la valeur moyenne de la fenêtre Résultats à une feuille de calcul.
Pour mesurer l’intensité de l’arrière-plan, déplacez le retour sur investissement vers une région de l’embryon sans coloration et cliquez sur Ajouter dans le gestionnaire de retour sur investissement. Sélectionnez la région d’arrière-plan et cliquez sur Mesurer, puis enregistrez la valeur d’intensité moyenne dans la feuille de calcul. Obtenez l’intensité moyenne des pixels du signal d’hybridation NC2 en soustrayant l’intensité moyenne de l’arrière-plan de celle de la région tachée.
Après avoir déterminé l’intensité moyenne des pixels de chaque échantillon, attribuez un génotype à chaque échantillon. Si le génotype ne peut pas être déterminé, exclure l’échantillon de l’analyse ultérieure. Trier les valeurs moyennes d’intensité de l’échantillon en fonction du génotype et procéder à des tests statistiques.
L’utilité de cette technique a été démontrée sur ISH pour dnmt3bb. 1 dans les embryons d’un runx1 hétérozygotes incross. Une diminution de dnmt3bb.
1 expression a été détectée chez les mutants homozygotes runx1 tandis que les embryons hétérozygotes n’ont montré aucune différence significative dans dnmt3bb. 1 expression. En essayant de déterminer l’effet de la mutation lmo4 sur l’expression runx1, cette analyse n’a pas montré de différences significatives dans l’expression entre le type sauvage et les mutants homozygous lmo4.
Cependant, une petite diminution de l’expression runx1 a été détectée par qPCR d’embryon simple. Dans environ 0,4 % des embryons sondés par runx1, l’ISH avait un fond élevé qui a donné lieu à un nombre négatif lorsqu’il a été soustrait du signal. Dans de tels cas, les embryons ont été exclus de l’analyse.
Quatre régions différentes sur les embryons ont été testées pour optimiser les corrections de fond. Bien qu’il y ait eu une différence relativement stable dans l’intensité du retour sur investissement dans l’une ou l’autre des zones de fond, R3 a toujours montré une intensité plus élevée que le retour sur investissement et ne devrait pas être utilisé pour la correction de fond. R1 et R4 se sont avérés être les domaines les plus appropriés pour la correction des antécédents.
Il est important de trouver les meilleures conditions pour l’imagerie et de les garder inchangées tout au long de l’expérience. Nous recommandons également de quantifier l’intensité des pixels avant d’attribuer un génotype à chaque échantillon.
Aperçu
Cet article présente une méthode pour le génotypage parallèle d'embryons et la quantification des signaux d'hybridation in situ chez le poisson zèbre. En utilisant cette approche impartiale, les chercheurs peuvent obtenir une plus grande précision dans les analyses phénotypiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neuroscience
- Génétique
- Biologie du développement
Contexte
- Les technologies d'édition de gènes facilitent la génération de mutants de poisson zèbre.
- L'hybridation in situ est une méthode courante pour évaluer l'expression des gènes.
- Les méthodes de notation traditionnelles peuvent introduire un biais et une subjectivité.
- Cette étude vise à fournir une approche plus cohérente et quantitative.
Objectif de l'étude
- Améliorer la précision des analyses phénotypiques chez le poisson zèbre.
- Fournir une méthode standardisée pour le génotypage d'embryons.
- Quantifier objectivement les signaux d'hybridation in situ.
Méthodes utilisées
- Imagerie des embryons colorés par ISH à l'aide d'un microscope stéréo.
- Préparation de solutions de glycérol pour le transfert des embryons.
- Utilisation d'un tampon de lyse alcaline pour l'extraction de l'ADN.
- Emploi du logiciel Fiji pour l'analyse et la quantification des images.
Résultats principaux
- Démontré une diminution de l'expression de dnmt3bb.1 chez les mutants homozygotes runx1.
- Identifié des zones de correction de fond appropriées pour l'analyse d'images.
- Montré aucune différence significative d'expression entre le type sauvage et les mutants homozygotes lmo4.
- Fourni une méthode fiable pour l'attribution de génotypes basée sur l'intensité des pixels.
Conclusions
- La méthode améliore la fiabilité de l'analyse de l'expression des gènes.
- Elle peut être adaptée pour une utilisation dans d'autres systèmes modèles.
- Le maintien de conditions d'imagerie cohérentes est crucial pour des résultats précis.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Quantitative in situ hybridization analysis reduces subjectivity in gene expression assessment, improving data reliability for target validation in zebrafish models. This approach supports mechanistic de-risking by enabling unbiased correlation of genotype with phenotypic expression patterns. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing standardized, replicable measurements across mixed-genotype samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through unbiased quantification of spatially restricted gene expression signals.
- Operational Value: Provides a consistent workflow for comparing mutant and wild-type phenotypes without observer bias.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing significant expression changes from background noise in genetic models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline expression profiles.
- Reproducibility: Standardizes image acquisition and analysis protocols to minimize inter-experiment variability.
- Quantitative Output: Generates measurable pixel intensity data suitable for statistical comparison across treatment groups.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains consistency from discovery through preclinical validation by using objective phenotypic readouts.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of gene expression changes with genotypic status for translational biomarker development.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables data-driven advancement decisions by reducing false positives in target validation studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by linking genotypic confirmation with quantitative phenotypic assessment, supporting lead identification through mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing quantitative mRNA distribution data to clarify gene function in developmental pathways.
- Screening: Enables assay standardization through reproducible imaging and analysis conditions for reliable compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative intensity measurements and background-subtracted values that enable statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by ensuring consistent phenotypic scoring across model systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genotyping and quantification platform applicable to multiple genes and mutant lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in gene expression data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized embryo handling and image analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective data for capital allocation in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by distinguishing true biological effects from technical variability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, microscopy, and basic genotyping techniques.
- Dependent on stereo microscopy with digital imaging capabilities and Fiji software for analysis.
- Necessitates cross-team standardization of imaging conditions, exposure times, and background correction regions.
- Involves adaptation considerations for different zebrafish strains and developmental stages.
- Includes practical limitations such as background correction optimization and exclusion of samples with indeterminate genotypes or high background noise.
