Name: Adaptation semi-haute débit de lanalyse ATPase couplée au NADH pour le dépistage des petits inhibiteurs des molécules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Découvrez un test ATPase couplé au NADH pour le dépistage semi-haute débit d'inhibiteurs de la myosine non musculaire II. Cette méthode optimise le criblage de molécules pour la recherche clinique.

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Ce travail a été soutenu par une subvention du National Institute of Neurological Disorders and Stroke et du National Institute on Drug Abuse NS096833 (CAM).

1. Préparation de solutions de stock et de réactifs
<ol><li>Préparer la solution de stock de dithiothreitol (TNT) en dissolvant la TNT cristalline dans de l'eau distillée à une concentration finale de 1000 mM. Ajuster le pH à 7,0 avec une solution NaOH de 1 M. Aliquot et magasin à -20 oC.</li>
	<li>Préparer la solution de stock ATP en dissolvant l'ATP cristallin dans de l'eau distillée à une concentration finale de 100 mM. Ajuster le pH à 7,0 avec une solution NaOH de 1 M. Aliquot et magasin à -20 oC.</li>
	<li>Préparer 10x tampon NADH contenant 70 mM 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS), 10 mM MgCl2, 0,9 mM d'éthylène glycol-bis (ether aminoéthyle)-N,N,N,N,Nô,N'-tétraacetic acid (EGTA), et 3 mM NaN3. Ajuster le pH à 7,0 avec une solution NaOH de 1 M. Conserver à 4 oC.</li>
	<li>Préparer 1x tampon de myosine contenant 10 mM MOPS et 0,1 mM EGTA. Ajuster le pH à 7,0 avec une solution NaOH de 1 M. Conserver à 4 oC. Ajouter l'albumine de sérum bovin (BSA) et la TNT à une concentration finale de 0,1 % (w/v%) et 1 mm, respectivement, avant utilisation.</li>
	<li>Préparer 1x tampon d'actine contenant 4 mM MOPS, 0,1 mM EGTA, 2 mM MgCl2, et 3 mM NaN3. Ajuster le pH à 7,0 avec une solution NaOH de 1 M. Conserver à 4 oC. Ajouter bSA et TNT à une concentration finale de 0,1 % (w/v%) et 1 mm, respectivement, avant utilisation.</li>
	<li>Préparer la solution de stock NADH en dissolvant le NADH cristallin dans le tampon 10x NADH à une concentration finale de 5,5 mM. Aliquot et magasin à -20 oC.</li>
	<li>Préparer la solution de stock PEP en dissolvant le PEP cristallin dans un tampon NADH 10x jusqu'à une concentration finale de 50 mM. Aliquot et magasin à -20 oC.</li>
	<li>Préparer la solution de stock LDH en dissolvant la poudre lyophilisée LDH dans un mélange de glycérol et de tampon NADH 10x (50%:50%) à une concentration finale de 2000 U/mL. Centrifuger la solution pour éliminer toute protéine non dissoute présente (7 197 x g, 20 oC, 10 min). Transférer soigneusement le supernatant dans un tube de centrifugeuse propre. Aliquot et magasin à -20 oC.</li>
	<li>Préparer la solution de stock PK en dissolvant la poudre de PK lyophilisée dans un mélange de glycérol et de tampon NADH 10x (50%:50%) à une concentration finale de 10000 U/mL. Centrifuger la solution pour éliminer toute protéine non dissoute présente (7 197 x g, 20 oC, 10 min). Transférer soigneusement le supernatant dans un tube de centrifugeuse propre. Aliquot et magasin à -20 oC.</li>
	<li>Reconstituer les échantillons de myosine du muscle cardiaque et squelettique lyophilisé en ajoutant 100 échantillons d'eau distillée ll pour obtenir des solutions de stock de 10 mg/mL correspondant respectivement à 37,9 m et 40,8 millions de myosines (monomeric). Pour plus de détails, consultez les instructions du fabricant.</li>
	<li>Préparer F-actin à partir de poudre d'acétone musculaire de lapin tel que décrit par Pardee et Spudich25.</li>
</ol>2. Mesurer les activités atpases et les effets inhibiteurs des inhibiteurs des petites molécules
<ol><li>Préparer la plaque composée.<ol>
<li>Dissoudre les composés d'intérêt dans le diméthylsulfoxide (DMSO) de haute qualité.</li>
		<li>Créez des dilutions en série 1:2 en 15 étapes à partir de 10 mM de concentration composée dans DMSO.</li>
		<li>Transférer les échantillons dans une plaque de polypropylène de 384 puits dans des tripliciats (12,5 l chacun) à l'aide d'une pipette multicanal. Utilisez deux rangées sur la plaque composée pour un composé (au lieu de trois colonnes) pour minimiser le nombre de puits potentiellement affectés par les effets de bord. Utilisez les trois derniers puits de la deuxième rangée pour chaque composé comme contrôle négatif (DMSO seulement). N'utilisez pas la première et la dernière rangée sur la plaque pour les dilutions composées.</li>
		<li>Transférer d'un DMSO pur dans les puits de la première rangée (réservé à l'étalonnage NADH).</li>
		<li>Utilisez la dernière rangée pour un contrôle positif. REMARQUE: Para-aminoblebbistatin à 4 mM de concentration dans DMSO a été utilisé ici.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer 4500 l de 20 m de solution d'actine diluée pour chaque plaque d'analyse (384 puits microplaque de polystyrène à parois noires) en diluant la solution de stock d'actine dans le tampon d'actine. Mélanger la solution à fond en faisant monter et descendre 30x à l'aide d'une pipette de 5 ml pour réduire la viscosité et l'hétérogénéité en cassant les filaments d'actine. Centrifuger la solution pour éliminer toute protéine précipitée présente (7 197 x g, 20 oC, 10 min). Transférer délicatement le supernatant dans un tube de centrifugeuse propre.</li>
	<li>Préparer le mélange maître contenant des enzymes LDH et PK (« mélange d'enzymes »). Pour chaque plaque d'essai, combinez 171,4 L de solution LDH, 171,4 L de solution PK et 3189,3 L ou 3252,9 L de tampon de myosine pour des analyses impliquant des myosines cardiaques ou squelettiques, respectivement, dans un tube de centrifugeuse conique de 15 ml. N'ajoutez pas de myosine à ce stade pour éviter l'agrégation et les précipitations.</li>
	<li>Préparer le mélange maître contenant tous les substrats (« mélange de substrat »). Pour chaque assiette, combiner 162,1 L d'ATP, 162,1 l de PEP et 324,1 L de solution NADH dans un tube conique de centrifugeuse de 15 ml. N'ajoutez pas d'actine à ce stade pour éviter l'agrégation et les précipitations.</li>
	<li>Créez des dilutions en série 1:2 en sept étapes de NADH pour l'étalonnage à partir de 250 M.<ol>
<li>Mélanger 12,3 L de solution de stock NADH avec 257,7 l de tampon de myosine dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.</li>
		<li>Aliquot 135 l de tampon de myosine en sept tubes microcentrifuges de 1,5 ml.</li>
		<li>Transférer 135 l de solution du premier tube dans le second et mélanger par pipetting. Répéter l'opération jusqu'à ce qu'elle atteigne le tube de 7 e.</li>
		<li>Utilisez le dernier tube comme contrôle sans NADH (tampon seulement).</li>
	</ol></li>
	<li>À l'aide d'une pipette à 8 canaux, transférer 20 L des solutions d'étalonnage NADH dans la première rangée de la plaque d'assay dans des tripliciats.</li>
	<li>Ajouter 68 l de myosine cardiaque ou 4,2 l de myosine du muscle squelettique II au mélange d'enzymes. Vortex brièvement.</li>
	<li>À l'exception de la première rangée, distribuez 8,4 l du mélange de myosine-enzyme préparé dans chaque puits de la plaque d'essai à l'aide d'un distributeur automatisé.</li>
	<li>Transférer 100 nL de solutions de la plaque composée à la plaque d'essai contenant un mélange d'enzymes à l'aide d'un système automatisé de manipulation liquide équipé d'une tête d'outil de broche de 100 nL.</li>
	<li>Agiter la plaque d'analyse pendant 1 min à température ambiante à 1200 tr/min à l'aide d'un shaker microplaque.</li>
	<li>Ajouter 4 052 L de la solution d'actine centrifugeau au mélange de substrat. Vortex brièvement.</li>
	<li>Distribuer 11,6 L de mélange actin-substrat dans chaque puits de la plaque d'analyse (sauf première rangée) pour démarrer la réaction enzymatique à l'aide d'un distributeur automatisé.</li>
	<li>Agiter la plaque d'analyse pendant 1 min à température ambiante à 1200 tr/min à l'aide d'un shaker microplaque.</li>
	<li>Centrifuger la plaque d'assay à 101 x g pour 30 s.</li>
	<li>Assurez-vous que la température intérieure du lecteur de plaque a été stabilisée à 25 oC. Chargez la plaque et secouez pendant encore 30 s. Cette étape de secousse est nécessaire pour rendre la forme de la surface liquide similaire dans chaque puits et laisse le temps à la plaque d'atteindre la température de mesure.</li>
	<li>Enregistrez la fluorescence NADH pendant 30 min en scannant la plaque en 45 s intervalles. Utilisez un filtre d'excitation de bande passante de 380 nm, 10 nm et un filtre d'émission de bande passante de 470 nm et 24 nm en conjonction avec un miroir dichroïque coupé de 425 nm. Exécutez la mesure en mode haute concentration. Optimisez le nombre de flashs, le gain du détecteur, les dimensions de la plaque et la hauteur de mesure avant d'exécuter les essais. REMARQUE : Les conditions finales d'essais sont 300 nM cardiaque/20 nM myosine de muscle squelettique II, 10 'M actin, 40 U/mL LDH, 200 U/mL PK, 220 'M NADH, 1 mM PEP, 1 mM ATP dans un tampon contenant 10 mM MOPS (pH '7.0), 2 m MgCl2 , 0,15 mM EGTA, 0,1 mg/mL BSA, 0,5 % (v/v) DMSO et 1 mM DTT. Le volume total est de 20 l/puits. La concentration composée finale la plus élevée est de 50 M. 20 m para-aminoblebbistatin dans 0,5% DMSO sert de contrôle positif et 0,5% DMSO seul est le contrôle négatif. Toutes les mesures sont effectuées en tripliques.</li>
</ol>3. Analyse des données
<ol><li>Tracer l'intensité de fluorescence observée contre le temps pour chaque puits.</li>
	<li>Effectuer une régression linéaire simple pour déterminer la pente et intercepter les réponses de fluorescence pour chaque puits. La pente est proportionnelle au taux de consommation de l'ATP (NADH), tandis que l'interception est proportionnelle à la concentration de NADH au début de la mesure (t ' 0 s).</li>
	<li>Construire une courbe d'étalonnage pour NADH en traçant les interceptions obtenues pour la première rangée de la plaque contre la concentration de NADH. Assurez-vous que les interceptions dépendent linéairement de la concentration nADH. REMARQUE : Les interceptions estiment les intensités réelles de fluorescence à t ' 0 s avec beaucoup plus de confiance que la moyenne de l'intensité de fluorescence brute se lit à t - 0 s.</li>
	<li>Effectuer une simple régression linéaire pour obtenir la pente et intercepter la ligne d'étalonnage NADH. REMARQUE : L'interception décrit le signal de fond de fluorescence (aucun NADH présent), alors que la pente correspond à l'intensité extrapolée/théorique de fluorescence d'une solution de 1 M NADH dans cette expérience particulière.</li>
	<li>Divisez la pente de la réponse de fluorescence obtenue pour le reste des puits par la pente de la ligne d'étalonnage NADH pour convertir les changements de fluorescence aux taux de consommation d'ATP.</li>
	<li>Tracer les taux de consommation d'ATP par rapport à la concentration de l'inhibiteur.</li>
	<li>Pour déterminer les constantes inhibitrices, utilisez un logiciel statistique approprié pour adapter les données dose-réponse à l'équation quadratique suivante correspondant à un modèle d'équilibre contraignant simple : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60017/60017eq01.jpg" style="opacity: 0.9;"> où Y est le taux de consommation ATP, Ymin est le taux de consommation ATP int l'absence d'inhibiteur, Ymax est le taux théorique de consommation ATP à 100% d'inhibition, KI est la constante inhibitrice , [E]t et [i]t sont la concentration totale de l'enzyme (myosine) et de l'inhibiteur, respectivement.</li>
</ol>

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<li>Motulsky, H. J., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+binding+data%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Analyzing binding data.</a> Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).</li>
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<li>Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+protein+stimulates+heteroduplex+DNA+formation+in+the+synaptic+phase+of+DNA+strand+exchange+via+specific+interactions+with+the+presynaptic+Rad51+nucleoprotein+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).</li>
<li>Banik, U., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+fluorimetric+assay+for+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Journal%22%5BJournal%5D)">A continuous fluorimetric assay for ATPase activity.</a> Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).</li>
<li>Xiao, Y. X., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIFC1%3A+a+promising+chemotherapy+target+for+cancer+treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?</a> Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).</li>
<li>See, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Dynein+Antagonists+with+Improved+Potency+and+Isoform+Selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity.</a> ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).</li>
<li>Datta, A., Brosh, R. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+Into+DNA+Helicases+as+Druggable+Targets+for+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59(2018).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Étapes critiques du protocole
Optimisez la disposition des plaques en exécutant plusieurs plaques avec un contrôle négatif seulement (réaction ATPase sans inhibiteur). Inspectez soigneusement les résultats pour les tendances des taux de réaction. Par exemple, ceux-ci peuvent résulter d'effets de bord et/ou d'imperfections dans le revêtement hydrophile de surface des plaques « non contraignantes ». Si un modèle est observé, changez le type de plaque et/ou la disposition de la p...

Les myosines sont des transducteurs d'énergie mécanochimique qui hydrolysent l'adénosine triphosphate (ATP) pour générer un mouvement directionnel le long des filaments du cytosquelette d'actine chez les eucaryotes1,2. Ils se sont adaptés structurellement et kinétiquement à leurs différentes fonctions intracellulaires, telles que le transport d'organites, la contraction musculaire ou la génération de tension cytosquelettique1,2. La superfamille de myosine est représentée par 40 gènes de myosine appartenant à 12 classes distinctes de myosine dans le génome humain3,4. Les membres des classes de myosine jouent divers rôles dans un ensemble très divers de désordres, tels que plusieurs cancers, désordres neurologiques, myopathies squelettiques, et cardiomyopathie hypertrophique5,6. Étant donné le grand nombre de fonctions physiologiques et pathologiques de ces moteurs moléculaires, il n'est pas surprenant qu'ils soient de plus en plus reconnus comme cibles médicamenteuses pour une variété de conditions7. Des progrès significatifs ont été réalisés récemment dans la découverte de nouveaux inhibiteurs de la myosine8,9,10 et activateurs11, et d'améliorer les propriétés des existants12, 13 (en) , 14 (en) , 15.
L'analyse ATPase couplée à la nicotinamide adenine (NADH) a longtemps été utilisée pour mesurer l'activité ATPase de diverses enzymes, telles que le réticulum sarcoplasmique Ca2 pompe ATPase16, la réparation de l'ADN ATPase Rad5417, l'AAA ATPase p9718 ou la kinésine moteur microtubule19. L'analyse utilise un cycle de régénération ATP. L'adénosine diphosphate (ADP) généré par l'ATPase est régénéré en ATP par pyruvate kinase (PK), qui transforme une molécule de phosphoenolpyruvate (PEP) en pyruvate en parallèle. Par la suite, le pyruvate est réduit au lactate par la déshydrogénase de lactate (LDH). Cela, à son tour, oxyde une molécule de NADH à NAD. Par conséquent, la diminution de la concentration de NADH en fonction du temps équivaut au taux d'hydrolyse atp. Le cycle de régénération de l'ATP maintient la concentration d'ATP presque constante et la concentration ADP faible tant que le PEP est disponible. Il en résulte des cours de temps linéaires, ce qui rend simple de déterminer les taux de réaction initiaux et aide à éviter l'inhibition du produit par ADP19. Bien que l'assay ATPase couplé au NADH ait déjà été adapté à un format de 96 puits20, les volumes de réaction élevés (150 l) le rendent relativement cher en raison de la forte demande de réactifs, ce qui le rend moins propice à un dépistage rapide d'un grand nombre de Composés. D'autres méthodes, telles que l'essai vert malachite19,21, qui repose sur la détection du phosphate produit par l'enzyme ATPase, se sont avérées plus appropriées pour la miniaturisation et le dépistage à haut débit22 , 23 Ans, états-unis , 24. Cependant, un point de terminaison est plus susceptible d'être affecté par plusieurs artefacts (discutés ci-dessous), qui peuvent rester inconnus en l'absence de cours à temps plein.
Ici, l'analyse ATPase couplée nADH a été optimisée pour le criblage semi-haut de débit des inhibiteurs de petite molécule. La myosine des muscles squelettiques et cardiaques II et les inhibiteurs de la myosine blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 et para-nitroblebbistatin12 sont utilisés pour démontrer la puissance de l'avertissement, qui repose sur NADH fluorescence comme une lecture. Ce protocole est propice aux projets de dépistage axés sur les enzymes productrices d'ADP.

<table><tbody><tr><td>Microplaque NBS en polystyrène NBS noir à bride basse 384 puits</td><td>Corning</td><td>3575</td><td></td></tr><tr><td>ATP (adénosine 5&prime ;-hydrate de sel disodique triphosphate</td>)<td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Aurora FRD-IB Distributeur</td><td>Aurora Discovery, Inc.</td><td></td><td></td>00017425</tr><tr><td>Biomek NXP Station de travail d’automatisation de laboratoire multicanal</td><td>Beckman Coulter</td><td>A31841</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>AMRI</td><td>N/A</td><td>Synthèse personnalisée</td></tr><tr><td>BSA (Albumine sérique bovine, sans protéase)</td><td>Akron Biotech</td><td>AK1391&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5430 R, réfrigérée, avec rotor FA-35-6-30</td><td>Eppendorf</td><td>022620663</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5430, non réfrigérée, avec rotor A-2-MTP</td><td>Eppendorf</td><td>022620568</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (diméthylsulfoxyde)</td><td>&nbsp ; Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td><td>&nbsp ; Sigma</td><td>D5545</td><td></td></tr><tr><td>E1 Pipette multicanaux ClipTip ; format 384 ;</td><td></td> Pipette multicanaux <td>Thermo Scientific</td> 4672010 <td></td></tr><tr><td>E1 ClipTip à 8 canaux ; format 96 ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>4672080</td><td></td>EGTA à 8 canaux</tr><tr><td>(Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&prime ;,N&prime ;-acide tétraacétique)</td><td>&nbsp ; Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>EnVision 2104 Lecteur de plaques multi-étiquettes</td><td>PerkinElmer</td><td>2104-0010</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>&nbsp ; Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>LDH (L-Lactic déshydrogénase du muscle de lapin)</td><td>Sigma</td><td>L1254</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O (Chlorure de magnésium hexahydraté)</td><td>&nbsp ; Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur de microplaques</td><td>VWR</td><td>&nbsp ; 12620-926&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Microplaque, puits 384, PP, petit volume, puits profond,</td><td>Greiner naturel Bio-One</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>MOPS (acide 3-(N-Morpholino)propanesulfonique)</td><td>&nbsp ; Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>Myosine Motor Protein (pleine longueur) (muscle cardiaque bovin)</td><td>Cytosquelette&nbsp ;</td><td>MY03</td><td></td></tr><tr><td>Protéine motrice de la myosine (pleine longueur) (muscle squelettique du lapin)</td><td>Cytosquelette&nbsp ;</td><td>MY02</td><td></td></tr><tr><td>NADH (&beta ;-Nicotinamide adénine dinucléotide, sel disodique réduit)</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>NaN3 (Azoture de sodium)</td><td>&nbsp ; Sigma</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (hydroxyde de sodium)</td><td>&nbsp ; Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Filtre optique CFP 470/24nm (émission)</td><td>PerkinElmer</td><td>2100-5850</td><td>Code-barres 240</td></tr><tr><td>Filtre optique Fura2 380/10nm (excitation)</td><td>PerkinElmer</td><td>2100-5390</td><td>Code-barres 112</td></tr><tr><td>Module optique : Beta Lactamase</td><td>PerkinElmer</td><td>2100-4270 Code-barres</td><td>418</td></tr><tr><td>Logiciel OriginPro 2017 OriginLab</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>para-Aminoblebbistatin</td><td>AMRI</td><td>N/A</td><td>Synthèse personnalisée</td></tr><tr><td>para-Nitroblebbistatin</td><td>AMRI</td><td>N/A</td><td>Synthèse personnalisée</td></tr><tr><td>PEP (Phospho(énol)Acide pyruvique Monopotassique sel)</td><td>Sigma</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>PK (Pyruvate Kinase du muscle de lapin)</td><td>Sigma</td><td>P9136</td><td></td></tr><tr><td>Muscle de lapin Acétone Powder</td><td>Pel Produits biologiques Freez</td><td>41995-2</td><td></td></tr></tbody></table>

adaptation semi-haute débit de l'analyse atpase couplée au nadh pour le dépistage des petits inhibiteurs des molécules

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Les enzymes ATPase utilisent l'énergie libre stockée dans le triphosphate d'adénosine pour catalyser une grande variété de processus biochimiques endergoniques in vivo qui ne se produiraient pas spontanément. Ces protéines sont cruciales pour essentiellement tous les aspects de la vie cellulaire, y compris le métabolisme, la division cellulaire, les réponses aux changements environnementaux et le mouvement. Le protocole présenté ici décrit un nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-couplé ATPase-assay qui a été adapté au criblage semi-haut de débit des inhibiteurs de petite molécule d'ATPase. L'analyse a été appliquée à la myosine du muscle cardiaque et squelettique II, deux ATPases à base d'actine, comme preuve de principe. L'hydrolyse de l'ATP est couplée à l'oxydation de NADH par des réactions enzymatiques dans l'effort. Tout d'abord, l'ADP généré par l'ATPase est régénéré en ATP par pyruvate kinase (PK). PK catalyse la transition du phosphoenolpyruvate (PEP) à la pyruvate en parallèle. Par la suite, le pyruvate est réduit au lactate par la déshydrogénase de lactate (LDH), qui catalyse l'oxydation du NADH en parallèle. Ainsi, la diminution de la concentration d'ATP est directement corrélée à la diminution de la concentration de NADH, qui est suivie du changement à la fluorescence intrinsèque de NADH. Tant que la PPE est disponible dans le système de réaction, la concentration d'ADP reste très faible, évitant l'inhibition de l'enzyme ATPase par son propre produit. En outre, la concentration atp reste presque constante, donnant des cours de temps linéaires. La fluorescence est surveillée en permanence, ce qui permet d'estimer facilement la qualité des données et aide à filtrer les artefacts potentiels (p. ex., résultant de précipitations composées ou de changements thermiques).

La carte typique de mise en page des plaques utilisée pour les expériences de dépistage est illustrée dans la figure 1. Les première et dernière rangées sont réservées à l'étalonnage et au contrôle positif du NADH (20 M para-aminoblebbistatin, 0,5% de DMSO), respectivement. Les lignes restantes (B à O) sont utilisées pour tester l'activité inhibitrice des composés. Ici, les dilutions en série 1:2 en quinze étapes à partir de 10 mM de concentration c...

Un test ATPase couplé à la nicotinamide adenine (NADH) a été adapté au dépistage semi-élevé de la myosine par petite molécule. Cet essai cinétique est exécuté dans un format microplate de 384 puits avec des volumes de réaction totaux de seulement 20 L par puits. La plate-forme devrait s'appliquer à pratiquement n'importe quelle enzyme productrice d'ADP.

Adaptation semi-haute débit de l'analyse ATPase couplée au NADH pour le dépistage des petits inhibiteurs des molécules

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Ce protocole s’applique à un large éventail de projets de dépistage visant à mettre au point des inhibiteurs de l’ATPase, soit à titre de sondes pour la recherche fondamentale, soit pour des composés cliniques potentiels. Cette méthode a été optimisée pour les applications de criblage semi-haut débit. Il a également été conçu pour éviter plusieurs artefacts communs et il ne nécessite pas la manipulation de matières dangereuses.Dans notre laboratoire, nous avons utilisé cet essai pour développer de nouveaux inhibiteurs spécifiques de la myosine II non musculaire pour le traitement du trouble d’utilisation de la méthamphétamine. En théorie, cette méthode peut facilement être appliquée à toutes les enzymes produisant de l’ATP. La démonstration visuelle permet de clarifier tous les détails techniques importants.Pour commencer, préparez 4 500 microlitres de 20 micromolaires dilués solution d’actine pour chaque microplaque de polystyrène noir de 384 puits en diluant la solution concentrée de stock d’actine dans le tampon d’actine. Mélangez la solution à fond en pipetage de haut en bas 30 fois pour briser les filaments d’actine pour réduire la viscosité et l’hétérogénéité. Puis centrifugeuse la solution pour éliminer toute protéine précipitée présente.Transférer délicatement le supernatant dans un tube de centrifugeuse propre. Préparez le mélange principal d’enzyme dans un tube conique de centrifugeuse de 15 millilitres pour chaque plaque d’essai en combinant 3, 252.9 microlitres de tampon de myosine pour l’essai impliquant la myosine ii de muscle squelettique, 171.4 microlitres de solution de LDH, et 171.4 microlitres de solution de PK. Préparez le mélange principal de substrat dans un tube conique de centrifugeuse de 15 millilitres pour chaque plaque en combinant 162,1 microlitres d’ATP, 162,1 microlitres de PEP et 324,1 microlitres de solution NADH.N’ajoutez pas d’actine à ce stade pour éviter l’agrégation et les précipitations. Pour créer des dilutions en série en sept étapes de NADH pour étalonnage, préparez huit tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Mélangez 12,3 microlitres de solution de stock NADH avec 257,7 microlitres de tampon de myosine dans le premier tube pour faire une solution de 250 micromolaires.Puis aliquot 135 microlitres de tampon de myosine dans chacun des sept tubes restants. Transférer 135 microlitres de la solution du premier tube dans le second et mélanger par pipetting. Répéter jusqu’à atteindre le septième tube.Utilisez le dernier tube comme contrôle no-NADH avec seulement tampon. Incluez toujours des contrôles positifs et négatifs sur les plaques composées, et des dilutions NADH pour l’étalonnage sur les plaques d’essai. Ces contrôles sont extrêmement importants pour identifier les artefacts lors de l’analyse des données.À l’aide d’une pipette à huit canaux, transférez 20 microlitres des solutions d’étalonnage NADH dans la première rangée en triplicates dans une plaque d’essai. Maintenant ajouter 4,2 microlitres de myosine ii muscle squelettique au mélange d’enzymes. Vortex brièvement.Ajouter la myosine au mélange d’enzymes juste avant la distribution. Une longue incubation de solutions de myosine diluée peut entraîner une perte d’activité due aux précipitations et une liaison non spécifique aux surfaces en plastique. Chargez le mélange d’enzymes de myosine préparé dans l’un des contenants d’échantillon d’un distributeur automatique.Dans la plaque, à l’exception de la première rangée, distribuer 8,4 microlitres de l’enzyme de la myosine se mélanger dans chaque puits de la plaque d’essai. Ensuite, placez la plaque d’analyse et la plaque composée sur les positionneurs labware d’un système automatisé de manipulation des liquides qui est équipé d’une tête d’outil à broches de 100 nanolitres. Ensuite, exécutez la méthode appropriée dans le logiciel pour transférer 100 nanolitres de solutions de la plaque composée préparée à la plaque d’essai.Ensuite, placez la plaque d’essai sur un shaker microplaqué pour secouer pendant une minute à température ambiante à 1200 rpm. Ajouter 4052 microlitres de la solution centrifugée d’actine au mélange de substrat et au vortex brièvement. Pour commencer la réaction enzymatique, distribuez 11,6 microlitres de substrat d’actine dans chaque puits de la plaque d’essai à l’aide d’un distributeur automatique, à l’exception de la première rangée.Sur un shaker microplaqué, agiter la plaque d’essai pendant une minute à température ambiante à 1200 rpm. Centrifugeuse de la plaque d’essai à 101 fois g pendant 30 secondes. Utilisez un filtre d’excitation de 380 nanomètres, une largeur de bande de 10 nanomètres et un filtre d’émission de 24 nanomètres de largeur de bande de 425 nanomètres pour les analyses.Optimisez le nombre de flashs, le gain de détecteur, les dimensions des plaques et la hauteur de mesure avant d’exécuter les analyses. Exécutez la mesure en mode haute concentration. Assurez-vous que la température intérieure du lecteur de plaque s’est stabilisée à 25 degrés Celsius.Chargez la plaque dans le lecteur de plaque et secouez pendant encore 30 secondes pour rendre la forme de la surface liquide similaire dans chaque puits et permettre à la plaque d’atteindre la température de mesure. Numérisez la plaque à intervalles de 45 secondes et enregistrez la fluorescence nadh pendant 30 minutes. Avec les données exportées, tracez l’intensité de fluorescence observée par rapport au temps pour chaque puits.Effectuez une régression linéaire simple pour déterminer la pente et intercepter les réponses de fluorescence pour chaque puits. La pente est proportionnelle au taux de consommation de NADH qui peut être utilisé comme une très bonne approximation du taux de consommation atp. L’interception est proportionnelle à la concentration de NADH au début de la mesure.Ensuite, construisez une courbe d’étalonnage pour NADH en traçant les interceptions obtenues pour la première rangée de la plaque contre la concentration de NADH. Les interceptions estiment les intensités réelles de fluorescence au début avec beaucoup plus de confiance que la moyenne de l’intensité brute de fluorescence lit au début. Effectuez une régression linéaire simple pour obtenir la pente et intercepter la ligne d’étalonnage NADH.Ici, les interceptions décrivent le signal de fond de fluorescence sans NADH présent, alors que la pente correspond à l’intensité théorique extrapolée de fluorescence d’une solution nadh molaire. Pour convertir les changements de fluorescence en taux de consommation d’ATP diviser la pente de la réponse de fluorescence obtenue pour le reste des puits par la pente de la ligne d’étalonnage NADH. Ensuite, tracer les taux de consommation ATP par rapport à la concentration de l’inhibiteur.Pour déterminer les constantes inhibitrices, utilisez n’importe quel logiciel statistique approprié capable de raccorder la courbe non ligneaire, comme Origin 2017. Sélectionnez courbe non linéaire adaptée aux données dose-réponse à une équation quadratique correspondant à un simple modèle d’équilibre de liaison en un à un. Y est le taux de consommation atp.Y-minimum est le taux de consommation ATP en l’absence d’inhibiteur. Y-maximum est le taux théorique de consommation ATP à 100% inhibition. t et t sont la concentration totale de l’enzyme et de l’inhibiteur de la myosine, respectivement.Ki est la constante inhibitrice. Dans cette étude, les réactions squelettiques et cardiaques de myosine II ATPase de muscle ont montré des traces linéaires d’intensité de fluorescence indépendamment de la myosine utilisée ou de la présence des inhibiteurs. Les taux basaux et actin-activés d’ATPase ont montré une dépendance linéaire à la concentration de myosine ii.A de fenêtre de criblage squelettique ou cardiaque ou facteur de Z de 0,78 a indiqué un essai fiable avec des contrôles positifs et négatifs très bien séparés.Blebbistatin, para-Aminoblebbistatin, et para-Nitroblebbistatin ont montré des courbes régulières de dose-réponse à ou au-dessous de leurs valeurs rapportées de solubilité. Des constantes inhibitrices pour les IIs cardiaques et squelettiques de myosine de muscle ont été déterminées en adaptant une équation quadratique représentant un modèle simple de liaison d’équilibre aux données. Les traces d’intensité de fluorescence pour la blebbistatine obtenues dans un essai d’ATPase utilisant la myosine II de muscle squelettique ont montré le signal linéairement décroissant normal selon la quantité d’inhibiteur présent.Cependant, au-dessus de la solubilité de blebbistatin une augmentation inattendue du signal a été observée très probablement due à la formation des cristaux brillamment florescents de blebbistatin. Dans le cas du para-Nitroblebbistatin avec des traces normales d’intensité de fluorescence brute, les taux de réaction obtenus au-dessus de la solubilité divergeaient de la courbe dose-réponse déterminée due aux précipitations. En utilisant cette méthode, nous avons développé de nouveaux inhibiteurs puissants et sélectifs de la myosine qui pourraient être utilisés comme outils scientifiques dans la recherche fondamentale ou comme candidats directs à l’avenir.Il est toujours recommandé d’utiliser un ATPase différent ou un autre test fonctionnel spécifique à l’enzyme d’intérêt pour distinguer entre les coups réels et faux positifs. Toutes les protéines lient les surfaces en plastique. Ce problème peut fortement affecter les résultats, surtout si la protéine est présente à de faibles concentrations.Évitez toujours la manipulation inutile des liquides et utilisez des tubes non contraignants. D’autres analyses ATPase nécessitent généralement la manipulation d’acide sulfurique, de substances toxiques ou de matières radioactives. En revanche, l’analyse ATPase liée à la NADH exige des réaccentrages sans toxicité ou très faible seulement.

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