Adaptation semi-haute débit de l'analyse ATPase couplée au NADH pour le dépistage des petits inhibiteurs des molécules

Ce protocole s’applique à un large éventail de projets de dépistage visant à mettre au point des inhibiteurs de l’ATPase, soit à titre de sondes pour la recherche fondamentale, soit pour des composés cliniques potentiels. Cette méthode a été optimisée pour les applications de criblage semi-haut débit. Il a également été conçu pour éviter plusieurs artefacts communs et il ne nécessite pas la manipulation de matières dangereuses.

Dans notre laboratoire, nous avons utilisé cet essai pour développer de nouveaux inhibiteurs spécifiques de la myosine II non musculaire pour le traitement du trouble d’utilisation de la méthamphétamine. En théorie, cette méthode peut facilement être appliquée à toutes les enzymes produisant de l’ATP. La démonstration visuelle permet de clarifier tous les détails techniques importants.

Pour commencer, préparez 4 500 microlitres de 20 micromolaires dilués solution d’actine pour chaque microplaque de polystyrène noir de 384 puits en diluant la solution concentrée de stock d’actine dans le tampon d’actine. Mélangez la solution à fond en pipetage de haut en bas 30 fois pour briser les filaments d’actine pour réduire la viscosité et l’hétérogénéité. Puis centrifugeuse la solution pour éliminer toute protéine précipitée présente.

Transférer délicatement le supernatant dans un tube de centrifugeuse propre. Préparez le mélange principal d’enzyme dans un tube conique de centrifugeuse de 15 millilitres pour chaque plaque d’essai en combinant 3, 252.9 microlitres de tampon de myosine pour l’essai impliquant la myosine ii de muscle squelettique, 171.4 microlitres de solution de LDH, et 171.4 microlitres de solution de PK. Préparez le mélange principal de substrat dans un tube conique de centrifugeuse de 15 millilitres pour chaque plaque en combinant 162,1 microlitres d’ATP, 162,1 microlitres de PEP et 324,1 microlitres de solution NADH.

N’ajoutez pas d’actine à ce stade pour éviter l’agrégation et les précipitations. Pour créer des dilutions en série en sept étapes de NADH pour étalonnage, préparez huit tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Mélangez 12,3 microlitres de solution de stock NADH avec 257,7 microlitres de tampon de myosine dans le premier tube pour faire une solution de 250 micromolaires.

Puis aliquot 135 microlitres de tampon de myosine dans chacun des sept tubes restants. Transférer 135 microlitres de la solution du premier tube dans le second et mélanger par pipetting. Répéter jusqu’à atteindre le septième tube.

Utilisez le dernier tube comme contrôle no-NADH avec seulement tampon. Incluez toujours des contrôles positifs et négatifs sur les plaques composées, et des dilutions NADH pour l’étalonnage sur les plaques d’essai. Ces contrôles sont extrêmement importants pour identifier les artefacts lors de l’analyse des données.

À l’aide d’une pipette à huit canaux, transférez 20 microlitres des solutions d’étalonnage NADH dans la première rangée en triplicates dans une plaque d’essai. Maintenant ajouter 4,2 microlitres de myosine ii muscle squelettique au mélange d’enzymes. Vortex brièvement.

Ajouter la myosine au mélange d’enzymes juste avant la distribution. Une longue incubation de solutions de myosine diluée peut entraîner une perte d’activité due aux précipitations et une liaison non spécifique aux surfaces en plastique. Chargez le mélange d’enzymes de myosine préparé dans l’un des contenants d’échantillon d’un distributeur automatique.

Dans la plaque, à l’exception de la première rangée, distribuer 8,4 microlitres de l’enzyme de la myosine se mélanger dans chaque puits de la plaque d’essai. Ensuite, placez la plaque d’analyse et la plaque composée sur les positionneurs labware d’un système automatisé de manipulation des liquides qui est équipé d’une tête d’outil à broches de 100 nanolitres. Ensuite, exécutez la méthode appropriée dans le logiciel pour transférer 100 nanolitres de solutions de la plaque composée préparée à la plaque d’essai.

Ensuite, placez la plaque d’essai sur un shaker microplaqué pour secouer pendant une minute à température ambiante à 1200 rpm. Ajouter 4052 microlitres de la solution centrifugée d’actine au mélange de substrat et au vortex brièvement. Pour commencer la réaction enzymatique, distribuez 11,6 microlitres de substrat d’actine dans chaque puits de la plaque d’essai à l’aide d’un distributeur automatique, à l’exception de la première rangée.

Sur un shaker microplaqué, agiter la plaque d’essai pendant une minute à température ambiante à 1200 rpm. Centrifugeuse de la plaque d’essai à 101 fois g pendant 30 secondes. Utilisez un filtre d’excitation de 380 nanomètres, une largeur de bande de 10 nanomètres et un filtre d’émission de 24 nanomètres de largeur de bande de 425 nanomètres pour les analyses.

Optimisez le nombre de flashs, le gain de détecteur, les dimensions des plaques et la hauteur de mesure avant d’exécuter les analyses. Exécutez la mesure en mode haute concentration. Assurez-vous que la température intérieure du lecteur de plaque s’est stabilisée à 25 degrés Celsius.

Chargez la plaque dans le lecteur de plaque et secouez pendant encore 30 secondes pour rendre la forme de la surface liquide similaire dans chaque puits et permettre à la plaque d’atteindre la température de mesure. Numérisez la plaque à intervalles de 45 secondes et enregistrez la fluorescence nadh pendant 30 minutes. Avec les données exportées, tracez l’intensité de fluorescence observée par rapport au temps pour chaque puits.

Effectuez une régression linéaire simple pour déterminer la pente et intercepter les réponses de fluorescence pour chaque puits. La pente est proportionnelle au taux de consommation de NADH qui peut être utilisé comme une très bonne approximation du taux de consommation atp. L’interception est proportionnelle à la concentration de NADH au début de la mesure.

Ensuite, construisez une courbe d’étalonnage pour NADH en traçant les interceptions obtenues pour la première rangée de la plaque contre la concentration de NADH. Les interceptions estiment les intensités réelles de fluorescence au début avec beaucoup plus de confiance que la moyenne de l’intensité brute de fluorescence lit au début. Effectuez une régression linéaire simple pour obtenir la pente et intercepter la ligne d’étalonnage NADH.

Ici, les interceptions décrivent le signal de fond de fluorescence sans NADH présent, alors que la pente correspond à l’intensité théorique extrapolée de fluorescence d’une solution nadh molaire. Pour convertir les changements de fluorescence en taux de consommation d’ATP diviser la pente de la réponse de fluorescence obtenue pour le reste des puits par la pente de la ligne d’étalonnage NADH. Ensuite, tracer les taux de consommation ATP par rapport à la concentration de l’inhibiteur.

Pour déterminer les constantes inhibitrices, utilisez n’importe quel logiciel statistique approprié capable de raccorder la courbe non ligneaire, comme Origin 2017. Sélectionnez courbe non linéaire adaptée aux données dose-réponse à une équation quadratique correspondant à un simple modèle d’équilibre de liaison en un à un. Y est le taux de consommation atp.

Y-minimum est le taux de consommation ATP en l’absence d’inhibiteur. Y-maximum est le taux théorique de consommation ATP à 100% inhibition. t et t sont la concentration totale de l’enzyme et de l’inhibiteur de la myosine, respectivement.

Ki est la constante inhibitrice. Dans cette étude, les réactions squelettiques et cardiaques de myosine II ATPase de muscle ont montré des traces linéaires d’intensité de fluorescence indépendamment de la myosine utilisée ou de la présence des inhibiteurs. Les taux basaux et actin-activés d’ATPase ont montré une dépendance linéaire à la concentration de myosine ii.A de fenêtre de criblage squelettique ou cardiaque ou facteur de Z de 0,78 a indiqué un essai fiable avec des contrôles positifs et négatifs très bien séparés.

Blebbistatin, para-Aminoblebbistatin, et para-Nitroblebbistatin ont montré des courbes régulières de dose-réponse à ou au-dessous de leurs valeurs rapportées de solubilité. Des constantes inhibitrices pour les IIs cardiaques et squelettiques de myosine de muscle ont été déterminées en adaptant une équation quadratique représentant un modèle simple de liaison d’équilibre aux données. Les traces d’intensité de fluorescence pour la blebbistatine obtenues dans un essai d’ATPase utilisant la myosine II de muscle squelettique ont montré le signal linéairement décroissant normal selon la quantité d’inhibiteur présent.

Cependant, au-dessus de la solubilité de blebbistatin une augmentation inattendue du signal a été observée très probablement due à la formation des cristaux brillamment florescents de blebbistatin. Dans le cas du para-Nitroblebbistatin avec des traces normales d’intensité de fluorescence brute, les taux de réaction obtenus au-dessus de la solubilité divergeaient de la courbe dose-réponse déterminée due aux précipitations. En utilisant cette méthode, nous avons développé de nouveaux inhibiteurs puissants et sélectifs de la myosine qui pourraient être utilisés comme outils scientifiques dans la recherche fondamentale ou comme candidats directs à l’avenir.

Il est toujours recommandé d’utiliser un ATPase différent ou un autre test fonctionnel spécifique à l’enzyme d’intérêt pour distinguer entre les coups réels et faux positifs. Toutes les protéines lient les surfaces en plastique. Ce problème peut fortement affecter les résultats, surtout si la protéine est présente à de faibles concentrations.

Évitez toujours la manipulation inutile des liquides et utilisez des tubes non contraignants. D’autres analyses ATPase nécessitent généralement la manipulation d’acide sulfurique, de substances toxiques ou de matières radioactives. En revanche, l’analyse ATPase liée à la NADH exige des réaccentrages sans toxicité ou très faible seulement.