Name: Un meilleur assougo de fluorescence verte à base de protéines pour étudier la croissance de la neurite dans les neurones primaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Découvrez une méthode de co-transfection avec EGFP pour étudier la croissance des neurites dans les neurones corticaux de rat embryonnaire. Ce protocole améliore l'efficacité de transfection et permet d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies neurodégénératives.

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Ce travail a été soutenu par des fonds du Research Grants Council Hong Kong, du Health and Medical Research Fund (Hong Kong), du programme de subventions directes de la CUHK, du fonds de dotation du United College et du TUYF Charitable Trust.

Toutes les procédures suivies étaient conformes aux normes éthiques du comité d'éthique de l'expérimentation animale de l'Université chinoise de Hong Kong.
1. Préparation des fiches de couverture
<ol><li>Placez un bordereau circulaire stérile de 18 mm dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire de 12 puits.</li>
	<li>Enrober la couverture d'une solution poly-Lysine de 5 g/mL dans un incubateur humidifié de 37 oC pendant au moins 1 h.</li>
	<li>Aspirez la solution poly-D-lysine de la plaque de culture tissulaire et rincez les couvertures enduites une fois avec de l'eau stérile.</li>
</ol>2. Dissection embryonnaire de neurone de rat
<ol><li>Sacrifiez un rat Sprague-Dawley au moment où il est enceinte à l'âge gestationnel de 18 jours (E18) par luxation cervicale ou asphyxie au CO2. REMARQUE: S'il vous plaît vérifier les règlements locaux pour le sacrifice des rats enceintes.</li>
	<li>Ouvrez la cavité abdominale du rat enceinte avec des ciseaux disséquants et transférez l'utérus dans un plat Petri de 10 cm.</li>
	<li>Ouvrez soigneusement l'utérus et le sac amniotique avec de petits ciseaux disséquants et retirez le placenta de l'embryon de rat à l'aide de petits ciseaux disséquants. Transférer l'embryon entier dans un plat Petri de 10 cm avec du phosphate tamponné préréfrigéré, complété par du glucose (PBS-glucose, 10 mM de phosphates de sodium, 2,68 mM de chlorure de potassium, 140 mm de chlorure de sodium et 3 g/L de glucose) à l'aide d'une paire de petits forceps.</li>
	<li>Couper le long de la suture sagittale du crâne et l'ouvrir soigneusement avec une paire de petits ciseaux disséquants. Transférer le cerveau embryonnaire à l'eau avec une petite spatule plate dans un plat Petri de 10 cm avec du PBS-glucose glacé.</li>
	<li>Séparez les deux hémisphères cérébraux du cervelet et du tronc cérébral à l'aide de deux pinces #5 sous un microscope à dissection. REMARQUE: Veuillez consulter la référence12 pour la structure du cerveau du rat.</li>
	<li>Retirer les méninges à l'aide de la pince à épiler #5.</li>
	<li>Isolez le cortex des hémisphères cérébraux avec deux pinces #5 droites.</li>
	<li>Transférer le cortex isolé au PBS-glucose glacé dans un tube centrifugeur de 15 ml.</li>
</ol>3. Culture primaire de neurones corticales
REMARQUE: Toutes les procédures aux étapes 3 et 4 sont effectuées à l'intérieur d'un coffret de biosécurité de classe II.
<ol><li>Régler le cortex isolé par gravité à 4 oC pendant 5 min et aspirer le PBS-glucose.</li>
	<li>Ajouter 1 ml de 0,05 % de trypsine-EDTA au cortex isolé et mélanger délicatement en tapant et incuber le tissu dans un bain d'eau de 37 oC pendant 10 min pour permettre une digestion enzymatique. Appuyez doucement sur le tube pour mélanger toutes les 2 minutes.</li>
	<li>Ajouter 4 ml de milieu d'entretien (p. ex., Neurobasal Medium) au mélange tissu/trypsine. REMARQUE: Tout le support d'entretien utilisé dans ce protocole est complété par la pénicilline-Streptomycine et B-27 supplément13.</li>
	<li>Dissocier doucement le tissu par trituration à l'aide d'une pipette de 1 ml.</li>
	<li>Pelleter les cellules dissociées par centrifugation à 200 x g pendant 5 min. Aspirez le supernatant.</li>
	<li>Répétez les étapes 3,5 à 3,7 deux fois.</li>
	<li>Resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de milieu d'entretien.</li>
	<li>Ajouter 10 L de 0,4% de solution Trypan Blue à 10 l de suspension cellulaire pour le comptage des cellules viables par un hémocytomètre.</li>
	<li>Plaquer les neurones à une densité de 65 000/cm2 (cellules viables) dans 1 ml de milieu d'entretien par puits dans une plaque de 12 puits.</li>
</ol>4. Transfection et fixation cellulaires
<ol><li>À 2 jours in vitro (DIV2), transfect 0.5 'g de la construction d'EGFP (pEGFP-C1) aux neurones ensemble avec ou sans de 0.5 'g de POI en utilisant 1 'L de réactif de transfection (par exemple, Lipofectamine 2000). Utilisez les instructions du fabricant. REMARQUE: Des constructions d'expression de mammifères ont été préparées en utilisant un kit libre de préparation de plasmide d'endotoxine. Le traitement avec des produits chimiques/molécules (dans ce manuscrit cytochalasin D (Cyto D) et facteur de croissance de nerf (NGF) ont été employés) peut être fait à 6 h après transfection.</li>
	<li>Aspirer le milieu de culture 24 h après la transfection et laver les cellules transfectées une fois avec 37 OC de PBS (10 mM de phosphates de sodium, 2,68 mM de chlorure de potassium, 140 mM de chlorure de sodium).</li>
	<li>Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde en PBS pendant 10 min dans l'obscurité à température ambiante.</li>
	<li>Laver les cellules fixes trois fois avec DU PBS.</li>
	<li>Ajouter un minimum de milieu de montage de fluorescence sur une lame de verre de microscope. Transférer délicatement la plaque de couverture de la plaque de 12 puits sur le support de montage avec l'échantillon face à la glissière de verre. REMARQUE: Scellez le bord de la glissière avec du vernis à ongles si un milieu de montage aqueux est utilisé.</li>
</ol>5. Mesure de la croissance neurite
<ol><li>Utilisez un objectif 40x pour capturer des images à l'aide d'un microscope épifluorescent.</li>
	<li>Capturez des images d'au moins 40 neurones intacts avec le signal EGFP par transfection.</li>
	<li>Ouvrez l'image capturée dans le logiciel ImageJ avec le plugin NeuronJ11 pour mesurer la longueur de la plus longue neurite, du corps cellulaire à la pointe du cône de croissance, de chaque neurone image.</li>
	<li>Analyser les données obtenues avec le logiciel pour déterminer l'effet des protéines ciblées dans la croissance neurite.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun conflit d'intérêts avec le contenu de cet article.

Comme indiqué précédemment, PC12 et ses sous-clones sont largement utilisés pour étudier l'extension de neurite parce qu'ils ont une excellente efficacité de transfection2,3. En revanche, les neurones primaires ont un faible taux de transfection, qui est un obstacle majeur pour l'étude des régulateurs de croissance neurite par transfection7. Ici, nous décrivons un protocole commode pour quantifier la croissance de neurite dans les neurones...

Les neurites, y compris les axones et les dendrites, sont les projections des neurones impliqués dans l'établissement des réseaux neuronaux. La croissance dynamique des neurites est essentielle au neurodéveloppement. Cependant, les mécanismes de réglementation sous-jacents restent flous. En particulier, des dommages de neurite sont souvent observés dans diverses maladies neurodegenerative et après des dommages de cerveau1. Par conséquent, l'étude des rôles des molécules putatives dans diverses voies réglementaires de croissance neurite améliorerait notre compréhension du processus. En outre, il peut révéler de nouvelles cibles thérapeutiques pour divers désordres neurologiques. Les lignées cellulaires neuronales sont des modèles précieux pour l'étude des processus neuronaux, y compris la croissance neurite car ils sont faciles à manipuler et transfect2,3. Cependant, la dérive génétique a été rapportée pour se produire dans quelques lignées de cellules couramment utilisées, qui pourraient mener aux variations dans leurs réponses physiologiques4. En outre, l'expression différentielle de protéine a été montrée entre des lignes neuronales de cellules et des neurones primaires. Par exemple, PC12, une lignée cellulaire neuronale dérivée de la glande surrénale rat qui est largement utilisé pour étudier la croissance neurite2,3, n'exprime pas les récepteurs NMDA5. En outre, il a été proposé que la réactivité réduite de la ligne de neuroblastome de souris neuro-2a aux neurotoxines par rapport aux neurones primaires est due au manque d'expression de certains récepteurs de membrane et canaux d'ion6. Par conséquent, les neurones primaires sont un modèle plus souhaitable et représentatif pour l'étude de la croissance neurite. Cependant, l'utilisation des neurones primaires est entravée par leur faible efficacité de transfection7.
Ici, nous décrivons une méthode qui implique la co-transfection de la protéine d'intérêt (POI) et de l'EGFP aux neurones corticaux primaires de rat. L'EGFP agit comme un marqueur morphologique pour l'identification des neurones transfectés avec succès et permet de mesurer les neurites. Nous avons validé cette méthode en utilisant des composés/molécules qui ont été rapportés pour moduler la croissance de neurite. En outre, FE65, une protéine adaptatrice neuronale qui a été montrée pour stimuler la croissance neurite, a été employée pour illustrer cette approche8,9. Ce protocole implique (1) l'isolement des neurones corticaux primaires des embryons embryonnaires de rat 18 (E18), (2) la co-transfection des neurones avec EGFP et le POI (FE65 dans cette étude) et (3) l'imagerie et l'analyse des neurones en utilisant le traitement de l'image logiciel ImageJ avec le plugin NeuronJ10,11.

<table><tbody><tr><td>#5 pince à épiler</td><td>Regine</td><td>5-COB</td><td></td></tr><tr><td>18 mm Circle Cover Slips</td><td>Thermo Scientific CB00180RA</td><td></td><td>Stériliser avant utilisation</td></tr><tr><td>Supplément de B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasine D</td><td>Invitrogen</td><td>PHZ1063</td><td>Dissous dans du DMSO</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection, 10 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection, 12,5 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Montage de fluorescence moyen</td><td>Dako</td><td>S302380</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Milieu neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF 2.5S Protéine de souris native</td><td>Gibco</td><td>13257019</td><td></td></tr><tr><td>Nugent Pince utilitaire, 10 mm, pointe droite</td><td>World Precision Instruments</td><td>504489</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>#6084-1</td><td></td></tr><tr><td>pCI FE65</td><td></td><td></td><td>Veuillez consulter les références 8 et 15</td></tr><tr><td>Comprimés PBS</td><td>Gibco</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydromymide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Spatule</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4147</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0.05 %), phénol rouge</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4 %</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

un meilleur assougo de fluorescence verte à base de protéines pour étudier la croissance de la neurite dans les neurones primaires

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

La croissance neurite est un événement fondamental dans la formation des circuits neuronaux pendant le développement du système nerveux. Les dommages graves de neurite et le dysfonctionnement synaptique se produisent dans diverses maladies neurodegenerative et dégénérescence relative à l'âge. L'étude des mécanismes qui règlent la croissance de neurite jetterait non seulement la lumière valable sur des processus développementals de cerveau mais également sur de tels désordres neurologiques. En raison de la faible efficacité de transfection, il est actuellement difficile d'étudier l'effet d'une protéine spécifique sur la croissance neurite chez les neurones mammifères primaires. Ici, nous décrivons une méthode simple pour l'étude de la croissance de neurite par la co-transfection des neurones corticaux primaires de rat avec EGFP et une protéine d'intérêt (POI). Cette méthode permet d'identifier les neurones transfectés POI par le signal EGFP, et ainsi l'effet de l'IPI sur la croissance neurite peut être déterminé avec précision. Cet exemple d'EGFP fournit une approche pratique pour l'étude des voies régulant la croissance neurite.

Pour tester cette méthodologie, nous avons utilisé Cyto D et facteur de croissance nerveuse NGF, qui ont été montrés pour inhiber et stimuler la croissance neurite respectivement14,15,16. La longueur neurite des neurones transfectés avec EGFP ont été mesurées après traitement avec Cyto D ou NGF. L'efficacité de transfection de l'EGFP aux neurones était de 2,7 % (1 068 neurones comptés). Comme le ...

Dans ce rapport, nous décrivons un protocole simple pour étudier la croissance neurite dans les neurones corticaux embryonnaires de rat en co-transfectant avec l'EGFP et la protéine d'intérêt.

Un meilleur assougo de fluorescence verte à base de protéines pour étudier la croissance de la neurite dans les neurones primaires

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

Une faible efficacité de transfection est un obstacle majeur à la détermination de la façon dont les protéines réactivent la prolifération des neurites dans les neurones primaires. Notre protocole a surmonté ce problème par co-transfection de l’EGFP pour identifier avec succès les cellules transfected. Le taux élevé de co-transfection de l’EGFP et les protéines d’intérêt assure l’exactitude de l’analyse.Et par conséquent, la coloration d’immunofluorescence est maintenant exigée. Comme l’excroissance neurite se produit pendant la régénération neuronale, cette méthode peut être appliquée à l’identification de nouvelles cibles pour restaurer le réseau neuronal endommagé dans les traumatismes cérébraux ou les maladies neurodégénératives. Avant de commencer l’intervention, placez un couvercle circulaire stérile de 18 millimètres dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 12 puits et enduire chaque coverslip de cinq microgrammes par millimètre de solution Poly-D-Lysine dans un incubateur humidifié de 37 degrés Celsius pendant au moins une heure.À la fin de l’incubation, aspirer la solution Poly-D-Lysine et rincer les couvercles à l’eau stérile. Le jour embryonnaire 18, place

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Imagerie des cellules vivantes est d'une utilité particulière lorsque l'on étudie la dynamique du trafic des organelles. Nous décrivons ici un protocole d'imagerie en temps réel du noyau dense vésicules dans des neurones cultivés en utilisant la microscopie à fluorescence à champ large. Ce protocole est flexible et peut être adaptée aux organites autre image tels que les mitochondries, les endosomes, et les peroxysomes.

Imagerie en temps réel du noyau dense de vésicules cultures primaires neurones de l&#39;hippocampe

Cet article décrit un nouveau protocole et de réactif mis conçu pour la mesure sensibles des effets neurotoxiques de composés et de traitements sur les co-cultures de neurones et les astrocytes en utilisant l'analyse à haute teneur. Les résultats démontrent que l'analyse de contenu de haute technologie représente un roman passionnant pour l'évaluation de la neurotoxicité.

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

FRAP a été utilisée pour quantifier la mobilité des protéine de fluorescence verte (GFP)-protéines étiquetées dans les cellules cultivées. Nous avons examiné les fractions mobiles / immobiles de la GFP en analysant le pourcentage de recouvrement de fluorescence après photoblanchiment. Dans cette étude, le FRAP a été réalisée à épines des neurones de l'hippocampe.

Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) de fluorescence protéines marquées dans les épines dendritiques des neurones de l&#39;hippocampe de culture

Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode basée sur la luminescence pour évaluer la neurotoxicité des composés à petites molécules favorisant la croissance des neurites sur la viabilité des neurones dérivés de hNPC. Le test mesure le niveau d’ATP intracellulaire, un indicateur de la viabilité cellulaire, afin d’évaluer la neurotoxicité après le traitement du composé testé.

Dosage basé sur la luminescence pour évaluer la neurotoxicité des composés testés sur les neurones

Dans cette vidéo, nous démontrons un test d’immunofluorescence basé sur EGFP pour identifier l’efficacité des protéines cibles sur la croissance neuritaire des neurones corticaux primaires. Les neurones primaires sont transfectés avec une protéine fluorescente, EGFP, et une protéine cible, puis un immunodosage est effectué pour étudier l’effet de la protéine cible sur la croissance des neurites.

Test d’immunofluorescence pour évaluer l’effet des protéines cibles sur la croissance des neurites

Morphogenèse neuronale et la migration sont des événements cruciaux qui sous-tendent le développement normal du cerveau. Ici, nous décrivons des méthodes pour manipuler génétiquement les neurones granulaires du cervelet en culture et le cervelet en développement pour l'évaluation de la morphologie et les caractéristiques de migration des neurones.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Nous décrivons une analyse optique des vésicules synaptiques (SV) recyclage dans les neurones en culture. Alliant ce protocole de transfection double pour exprimer un marqueur présynaptique et la protéine d’intérêt permet de localiser les sites présynaptiques, leur Vésicule synaptique capacité de recyclage et déterminer le rôle de la protéine d’intérêt.

Une analyse optique pour le recyclage de vésicule synaptique dans les neurones en culture surexprimant protéines présynaptiques

Le protocole présenté décrit une méthode pour un test d’excroissance de neurite et l’évaluation de neurotoxicité des composés de petites molécules.

Un test d’excroissance de neurite et évaluation de neurotoxicité avec des neurones neuronaux progéniteurs humains dérivés des cellules

Deux méthodes connexes sont décrites pour visualiser les événements subcellulaires nécessaires à la transmission synaptique. Ces protocoles permettent de surveiller en temps réel la dynamique de l’afflux de calcium présynaptique et de la fusion de la membrane des vésicules synaptiques à l’aide de l’imagerie cellulaire vivante de neurones cultivés in vitro .

Mesure fluorescente en temps réel des fonctions synaptiques dans les modèles de sclérose latérale amyotrophique

À l’aide de souris fluorescentes transgéniques, des protocoles détaillés sont décrits pour évaluer le transport axonal in vivo des endosomes de signalisation et des mitochondries dans les axones moteurs et sensoriels du nerf sciatique intact chez les animaux vivants.

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Découvrez une méthode de co-transfection avec EGFP pour étudier la croissance des neurites dans les neurones corticaux de rat embryonnaire. Ce protocole améliore l'efficacité de transfection et permet d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies neurodégénératives.

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