Un meilleur assougo de fluorescence verte à base de protéines pour étudier la croissance de la neurite dans les neurones primaires

Une faible efficacité de transfection est un obstacle majeur à la détermination de la façon dont les protéines réactivent la prolifération des neurites dans les neurones primaires. Notre protocole a surmonté ce problème par co-transfection de l’EGFP pour identifier avec succès les cellules transfected. Le taux élevé de co-transfection de l’EGFP et les protéines d’intérêt assure l’exactitude de l’analyse.

Et par conséquent, la coloration d’immunofluorescence est maintenant exigée. Comme l’excroissance neurite se produit pendant la régénération neuronale, cette méthode peut être appliquée à l’identification de nouvelles cibles pour restaurer le réseau neuronal endommagé dans les traumatismes cérébraux ou les maladies neurodégénératives. Avant de commencer l’intervention, placez un couvercle circulaire stérile de 18 millimètres dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 12 puits et enduire chaque coverslip de cinq microgrammes par millimètre de solution Poly-D-Lysine dans un incubateur humidifié de 37 degrés Celsius pendant au moins une heure.

À la fin de l’incubation, aspirer la solution Poly-D-Lysine et rincer les couvercles à l’eau stérile. Le jour embryonnaire 18, placez l’utérus récolté à partir d’un rat Sprague Dawley enceinte dans une boîte de Pétri de 10 centimètres et utilisez de petits ciseaux disséquants pour ouvrir l’utérus et le sac amniotique. Utilisez les ciseaux pour enlever le placenta et utiliser des forceps pour transférer un embryon entier dans une nouvelle boîte de Pétri de 10 centimètres contenant du glucose PBS réfrigéré.

Utilisez les ciseaux pour couper le long de la suture sagittale du crâne et utilisez une petite spatule plate pour transférer le cerveau embryonnaire dans une nouvelle boîte petri de 10 centimètres contenant du glucose PBS froid et glacé frais. À l’aide de deux pinces à épiler numéro cinq et d’un microscope à dissection, séparer les deux hémisphères cérébraux du cervelet et du tronc cérébral et enlever les méninges. Puis isoler le cortex des hémisphères cérébraux et placer le cortex dans un tube de 15 millilitres contenant du glucose PBS froid de glace fraîche.

Pour la culture corticale primaire de neurone, dans une armoire de biosécurité de classe II, permettent au cortex de s’installer par gravité pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius avant de remplacer le glucose de PBS par 0.05%trypsin EDTA. Mélanger avec des taraudages doux et incuber le tissu dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 10 minutes avec des écoutes douces supplémentaires toutes les deux minutes. À la fin de l’incubation, arrêter la digestion avec quatre millilitres de milieu d’entretien et utiliser une pipette d’un millilitre pour dissocier le tissu avec trituration douce.

Sédimenter les cellules par centrifugation et resuspendre la pastille dans un millilitre de milieu d’entretien pour une deuxième centrifugation. Resuspendez la pastille formée après la deuxième centrifugation en un millilitre de milieu d’entretien frais pour compter et plaquer les neurones isolés à 6,5 fois 10 à la quatrième cellule viable par centimètre de concentration carrée en un millilitre de milieu d’entretien par puits dans une plaque de puits de 12 puits. Après deux jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, diluer l’EGFP et cibler les ADN plasmides protéiques et le réaccente de transfection dans deux tubes distincts de 1,5 millilitre, puis les mélanger ensemble.

Transfect les cellules avec EGFP construire en ajoutant le mélange de transfection aux puits. Après 24 heures, laver les cellules avec 37 degrés Celsius PBS et les fixer avec 4% de paraformaldéhyde dans PBS pendant 10 minutes dans l’obscurité à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les cellules fixes trois fois avec du PBS frais par lavage et ajouter un volume minimal de fluorescence moyenne de montage sur une diapositive de verre microscope par échantillon.

Ensuite, transférez soigneusement les couvre-toits enduits sur le support de montage avec les échantillons faisant face aux glissières de verre. Pour imager la croissance du neurite, sélectionnez l’objectif 40X sur un microscope épifluorescent et cliquez sur commencer à capturer des images à partir d’au moins 40 neurones positifs EGFP intacts par transfection. Lorsque tous les neurites ont été photographiés, ouvrez les images capturées dans ImageJ avec le plugin NeuronJ et mesurez la longueur du plus long neurite de chaque neurone du corps cellulaire jusqu’à la pointe du cône de croissance.

Ensuite, analyser les données obtenues avec le logiciel pour déterminer l’effet des protéines ciblées sur la croissance du neurite. Cytochalasin D supprime l’extension de neurite d’une manière dose-dépendante tandis que l’excroissance de neurite est augmentée dans les neurones traités avec le facteur de croissance de nerf. En outre, la protéine d’adaptateur de croissance neuronale FE65 stimule significativement la croissance neurite double par rapport aux neurones non infectés.

En dépit d’une faible efficacité de transfection, l’analyse d’immunofluorescence indique que plus de 80% d’une culture cellulaire de deux jours peut être avec succès co-transfected avec EGFP et FE65. L’expression EGFP est détectée à six heures après transfection tandis que FE65 est détectée pour la première fois à l’heure 12 et que les deux signaux sont détectés jusqu’à sept jours après la transfection. La transfection des neurones corticals primaires de rat avec différentes quantités de l’ADN plasmide fe65 indique une augmentation dose-dépendante de l’extension de neurite avec 0 à 0.5 microgrammes de plasmide FE65.

Cependant, aucune différence significative dans la croissance n’est observée dans les neurones transfectés avec 0,5 ou un microgramme du plasmide. Lorsque vous essayez le protocole, il est important d’isoler la région appropriée du cerveau embryonnaire. Cette technique peut également être appliquée à l’étude de la croissance neuronale chez les neurones humains dérivés de l’iPSC qui ont des outils précieux pour la médecine régénérative.