Name: Une méthode détude de novo Formation des Domaines chromatine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Découvrez une méthode CRISPR pour suivre la formation dynamique des domaines chromatine PRC2 dans les cellules souches embryonnaires de souris. Ce système permet de mettre en pause l'analyse pour étudier les processus cellulaires en temps réel.

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Nous remercions les Drs L. Vales, D. Ozata et H. Mou pour la révision du manuscrit. Le Laboratoire D.R. est soutenu par le Howard Hughes Medical Institute et les National Institutes of Health (R01CA199652 et R01NS100897).

Génération de MESC de sauvetage EED inductibles
1. Culture cellulaire
<ol><li>Utilisez des cellules souches embryonnaires C57BL/6 sans mangeoire (MESC) possédant un transgène CreERT2 intégré de façon stable, qui peut se transposer au noyau sur l'administration de 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)13.</li>
	<li>Cultivez des MESC dans le milieu ESC conventionnel14,15, complété par 1000 U/mL LIF, 1 inhibiteur ERK PD0325901 et 3 inhibiteur sGSK3 CHIR99021. Pour le milieu ESC conventionnel, utilisez le DMEM knock-out contenant 15 % de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine, 1X pénicilline/streptomycine et 0,1 mM 2-mercaptoéthanol.</li>
	<li>Utilisez des plaques enduites d'une solution de gélatine de 0,1 % pour la culture des MESC.</li>
</ol>2. Génération de cils EED knock-out (KO) mESCs
<ol><li>Guide de conception RNAs (gRNAs) pour supprimer Exon 10 et Exon 11 de copie endogène de l'EED dans les MESCs en utilisant l'outil de conception CRISPR dans Benchling16. EED-KO-gRNA-1 cible l'intron immédiatement en amont de l'exon 10 et EED-KO-gRNA-2 cible l'intron immédiatement en aval d'Exon 11. L'application simultanée de ces gRNAs supprime à la fois Exon 10 et Exon 11 par jointure de fin non-homologue (NHEJ).</li>
	<li>Clone gRNAs in pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) using instructions in Ran et al., 201317.</li>
	<li>Dans un format de plaque de 6 puits, transfect 2 x 105 mESC s'il y a 1 mg de chaque EED-KO-gRNA-1 et EED-KO-gRNA-2 (voir Tableau des matériaux)en utilisant un réactif de transfection en suivant les instructions du fabricant. Changer les médias 24 h après la transfection.</li>
	<li>Deux jours après la transfection, isoler les cellules positives GFP à l'aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Attendez-vous à ce que l'efficacité de la transfection varie autour de 10-30 %. Triez environ 5 x 105 cellules pour capturer suffisamment de cellules positives GFP pour le placage.</li>
	<li>Déposer les MESC positifs gFP isolés dans des plaques de 15 cm pré-enduites de 0,1 % de gélatine (10-20 x103 cellules par assiette) pour la cueillette des colonies.</li>
	<li>Cultivez les cellules dans le milieu ESC pendant environ une semaine jusqu'à ce que les colonies simples soient visibles. Changez les médias tous les 2 jours.</li>
	<li>Choisissez un minimum de 48 colonies à l'aide d'une pointe micropipette de 20 l. Gratter la colonie tout en s'envolant dans la pointe de la micropipette. Ne pas briser la colonie en cellules individuelles. Transférer la colonie dans une plaque de puits contenant de l'accutase (20 ml) 96.</li>
	<li>Incuber les colonies pendant 10 min à 37 oC jusqu'à ce que toutes les cellules soient dissociées.</li>
	<li>Ajouter 200 ml de support ESC dans chaque puits à l'aide d'une pipette multicanal.</li>
	<li>Bien mélanger et plaquer les cellules en deux plaques de puits séparées de 96 à l'aide d'une pipette multicanal.</li>
	<li>Utilisez l'une des 96 plaques de puits pour le génotypage et gardez l'autre en croissance jusqu'à ce que le génotypage soit conclu. Utilisez la solution d'extraction d'ADN pour extraire l'ADN de la plaque de puits 96 en suivant les instructions du fabricant.</li>
	<li>Utilisez les amorces de génotypage Gnt-EED-KO-up et Gnt-EED-KO-down, qui couvrent le site supprimé et effectuent le génotypage PCR avec la polymérase d'ADN Taq suivant les instructions du fabricant. REMARQUE: D'autres types de polymères d'ADN peuvent également être utilisés pour le génotypage, cependant, la polymérase d'ADN de Taq offre la convenance car la réaction de PCR peut être directement chargée sur un gel quand son tampon coloré de réaction est employé.<ol>
<li>Observez un produit d'ADN de poids moléculaire inférieur dans les cellules avec une suppression homozygote par rapport au cas sauvage-type (WT). REMARQUE: Pour générer des cellules nulles PRC2, la suppression homozygote des exons 10 et 11 est nécessaire pour déstabiliser et dégrader EED, une sous-unité essentielle de base PRC213. L'efficacité du ciblage CRISPR est d'environ 10 %.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Valider la suppression de l'exon EED 10 et 11 et la perte de protéines EED par le séquençage Sanger et le ballonnement occidental, respectivement.</li>
	<li>Confirmez l'épuisement de l'EED et h3K27me2/me3 de la chromatine dans les cellules EED KO par ChIP-seq en utilisant des anticorps contre H3K27me2/me3 et EED. Utilisez le protocole donné dans Oksuz et al., 201715 pour les expériences ChIP-seq.</li>
</ol>3. Ingénierie de l'EED KO mESCs pour héberger Cre-ERT2 base d'expression EED inductible
<ol><li>Concevoir gRNA (EED-gRNA-inducible) pour introduire une coupe dans l'intron suite à l'exon 9 de l'EED à l'aide de l'outil de conception CRISPR dans Benchling16 (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Clone gRNAs in pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) using instructions in Ran et al., 201317.</li>
	<li>Concevoir un modèle d'ADN de donneur qui comprend la séquence d'ADNc EED après l'exon 9 et une étiquette C-terminal Flag-HA en amont d'une séquence T2A-GFP, le tout en orientation inverse en ce qui concerne la séquence gène endogène.<ol>
<li>Flank la cassette avec un épissage-acceptant et une séquence de polyadenylation niché entre les sites loxP inversés hétérologues (lox66 et lox71)18.</li>
		<li>Inclure au moins 500 bp de bras d'homologie de chaque extrémité. Divisez le modèle de donneur en 2 segments de fragments de gènes gBlocks (voir gBlock-1, gBlock-2-WT « https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI » et gBlock-2-cage-mutant « https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM ») et assemblez-les en PcR Blunt vecteur utilisant le clonage Gibson suivant les instructions du fabricant. REMARQUE: gblock-2 contient un résidu aromatique (Y365) dans la cage de EED qui est important pour l'interaction avec H3K27me312. gBlock-2-Wt contient des résidus de type sauvage, tandis que gblock-2-cage-mutant contient la cage-mutant de EED (Y365A), incapable de se lier à H3K27me3. Le sauvetage inductible de WT EED est désigné comme i-WT-r et le sauvetage inductible d'EED de cage-mutant est désigné comme i-MT-r pour plus de commodité.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dans un format de plaque de 6 puits, transfect 2 x 105 mESC avec 1 mg de gRNA (EED-gRNA-inducible) et 1 mg des modèles de distributeur (i-WT-r ou i-MT-r) utilisant le réactif de transfection et isolez les cellules positives de GFP utilisant DES FACS.</li>
	<li>Suivez les étapes 2.3-2.11 pour isoler les colonies individuelles prêtes à faire du génotypage pour un ciblage réussi.</li>
	<li>Utilisez des amorces de génotypage Inducible-Genotype-FW-1 et Inducible-Genotype-REV-1, qui couvrent la cassette insérée et effectuent le génotypage PCR à l'aide de la polymérase d'ADN Taq. REMARQUE: L'efficacité de ciblage pour CRISPR est d'environ 10 %.<ol>
<li>Confirmer l'intégration correcte de la cassette par PCR à l'aide d'amorces Inducible-Genotype-FW-2 et Inducible-Genotype-REV-2, qui sont en dehors des bras d'homologie. REMARQUE : L'intégration homozygous de la cassette est nécessaire pour accomplir le sauvetage efficace de l'EED. Notez que les cellules avec l'intégration homozygote produiront un produit d'ADN unique de grande taille par rapport à WT EED, qui produira un produit court.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confirmer l'intégration de la cassette par séquençage Sanger.</li>
	<li>Confirmer le retournement de la cassette et l'expression de l'EED et d'autres composants de base de PRC2 (p. ex., EZH2 et SUZ12) sur l'administration 4-OHT par le ballonnement occidental.</li>
	<li>Confirmer l'expression de T2A-GFP et le pourcentage de flip par cytométrie de flux. Notez que l'expression de GFP est indicative du retournement de la cassette et de l'expression de l'EED.</li>
</ol>4. Suite à la nucléation et à la diffusion de l'activité PRC2 sur la chromatine
<ol><li>Confirmez que les mESC i-WT-r et i-MT-r n'ont pas d'expression fuyante de GFP par cytométrie de flux. Dans le cas de l'expression de fuite de GFP, isolez les cellules GFP-négatives par FACS avant de commencer l'expérience.</li>
	<li>Étendre les mESC i-WT-r et i-MT-r en cinq plaques de 15 cm (5x 106 cellules par assiette).</li>
	<li>Induire l'expression de WT ou cage-mutant EED par administration de 0,5 mM 4-OHT pour 0 h, 12 h, 24 h, 36 h et 8 jours (une plaque de 15 cm par condition). Changer le support après 12 h pour les traitements de plus de 12 h. Isoler les cellules recombinées avec succès par FACS à l'aide de GFP. Ajuster le temps des traitements de sorte que toutes les conditions sont recueillies à la fois.</li>
	<li>Effectuer ChIP-seq pour H3K27me2, H3K27me3 pour étudier leur dépôt temporel à la chromatine en réponse à la réexpression de WT ou cage-mutant EED. Utilisez le protocole ChIP-seq, y compris la préparation de la bibliothèque détaillée dans Oksuz et al., 201715.</li>
	<li>Utilisez le contrôle de pointe dans chaque échantillon pour permettre une comparaison quantitative entre les différents points de temps19.<ol>
<li>Pour le contrôle de pointe, utilisez la chromatine de Drosophila melanogaster (dans un rapport de 1:50 à la chromatine dérivée du MESC) ainsi que l'anticorps H2Av spécifique à Drosophila (1 l d'anticorps H2Av par 4 g de chromatine d'origine drosophila selon instructions du fabricant) dans chaque échantillon.</li>
		<li>Préparer la chromatine de Drosophila d'une manière similaire à celle des MESC en utilisant le protocole détaillé dans Oksuz et al., 201715.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cartographier la séquence se lit pour le génome de ChIP-seq à mm10 avec Bowtie 2 en utilisant les paramètres par défaut20.</li>
	<li>Normaliser la souris ChIP-seq lit à pic-in Drosophila lire les comptes21. Calculez le facteur de normalisation à l'aide de la formule suivante : 1 x 106/unique Drosophila lit compte. Attendez-vous à obtenir environ 1 x 106Drosophila compte de lecture et 20 x 106 comptes de lecture de souris par expérience.<ol>
<li>N'incluez pas la chromatine Drosophila lors du séquençage des échantillons d'entrée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilisez l'outil genomecov des outils de lit pour convertir le fichier bam en bedgraph22. Ensuite, convertir le bedgraph en fichier bigwig en utilisant bedGraphToBigWig outil de USCS23,24. Voir le script suivant: gen-"chemin vers le génome mm10" chr '"chemin à mm10 tailles chromosomiques" inp'bam"path to input bam file " multiplier le « calcul du facteur de normalisation » bedtools genomecov -bg -échelle $multiply -ibam $inp-bam -g $gen 'gt; output.bedGraph tri -k1,1 -k2,2n output.bedGraph 'gt; output.sorted.bedGraph bedGraphToBigWig sortie-sorted.bedGraph $chr output.bw
</li>
	<li>Visualisez les densités de lecture ChIP-seq en téléchargeant les fichiers bigwig sur le navigateur du génome USCS24.</li>
</ol>5. Suivi de l'émergence et de la croissance des foyers H3K27me3 dans les noyaux du MES
<ol><li>Plaque 1x 104 mESC s'engouffré à 8 puits de lachambre pré-enduit e de 0,1% de gélatine.</li>
	<li>Le lendemain, commencez à effectuer des inductions consécutives de 4-OHT (0,5 mM) pour recueillir les cellules exprimant l'EED pour les points de temps indiqués (0 h, 12 h, 24 h et 36 h). Changer les médias après 12 h pour les traitements de plus de 12 h.</li>
	<li>Fixer les MESC avec 4% de paraformaldéhyde dans la saline tamponnée de phosphate (PBS) à température ambiante (RT) pendant 10 min.</li>
	<li>Perméabilize les cellules avec PBS/0.25% Triton X-100 à RT pendant 30 min.</li>
	<li>Bloquer les cellules avec PBS/5% sérum d'âne/0,1% Triton X-100 (tampon de blocage) à RT pendant 30 min.</li>
	<li>Diluer l'anticorps primaire H3K27me3 1:500 dans le tampon de blocage et ajouter sur les cellules.</li>
	<li>Incuber les cellules avec l'anticorps primaire pendant la nuit à 4 oC.</li>
	<li>Le lendemain, effectuer 3 lavages avec PBS/0,1% Triton X-100.</li>
	<li>Diluer l'anticorps secondaire (Alexa fluor 595) 1:1000 dans le tampon de blocage et ajouter sur les cellules.<ol>
<li>Effectuez toutes les incubations dans l'obscurité dans les étapes suivantes car les anticorps secondaires conjugués avec Alexa Fluor sont sensibles à la lumière.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incuber l'anticorps secondaire pendant 2 h à RT.</li>
	<li>Effectuer 3 lavages avec PBS/0,1% Triton X-100.</li>
	<li>Diluer DAPI (1 mg/mL) 1:4000 avec PBS/0.1% Triton X-100 et ajouter sur les cellules.</li>
	<li>Incuber les cellules avec DAPI pendant 10 min à RT.</li>
	<li>Montez les cellules avec la monture Aqua.</li>
	<li>Imagez les cellules avec une microscopie confocale au grossissement 63X.</li>
	<li>Processus et pseudo-couleur des images à l'aide d'une distribution de ImageJ, Fidji25.</li>
</ol>

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<li>Højfeldt, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+H3K27+methylation+can+be+established+de+novo+by+SUZ12-directed+PRC2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).</li>
</ol>

D.R. est co-fondateur de Constellation Pharmaceuticals et Fulcrum Therapeutics. Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts contradictoires.

Une approche puissante pour comprendre les détails mécanistes lors de la formation d'un domaine de chromatine donnée, est d'abord perturber le domaine, puis suivre sa reconstruction en cours au sein des cellules. Le processus peut être interrompu à tout moment pendant la reconstruction pour analyser en détail les événements en cours. Les études antérieures sur les domaines de chromatine n'ont pas été en mesure de résoudre de tels événements car ils ont été effectués dans des conditions d'état stable (par exemple, en comp...

Les génomes eucaryotes sont très organisés et les changements dans l'accessibilité de la chromatine contrôlent directement la transcription des gènes1. Le génome contient des types distincts de domaines de chromatine, qui sont en corrélation avec l'activité transcriptionnelle et le calendrier de réplication2,3. Ces domaines de chromatine varient en taille de quelques kilobases (kb) à plus de 100 kb et sont caractérisés par un enrichissement dans les modifications histone s'agit de distincts4. Les questions centrales sont les suivantes : comment ces domaines sont-ils formés et comment se propagent-ils ?
L'un des domaines de chromatine les plus bien caractérisés est favorisé par l'activité du complexe répressif Polycomb 2 (PRC2). PRC2 est un complexe multi-subunit composé d'un sous-ensemble du Groupe Polycomb (PcG) de protéines5,6, et catalyse le mono-, di- et trimethylation de lysine 27 de l'histone H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 sont associés à un état de chromatine répressif, mais la fonction de H3K27me1 n'est pas claire6,11. L'un des composants de base de PRC2, le développement embryonnaire ectoderm (EED), se lie au produit final de la catalyse PRC2, H3K27me3, à travers sa cage aromatique et cette caractéristique se traduit par la stimulation allostérique de PRC212,13. L'activité enzymatique PRC2 est cruciale pour préserver l'identité cellulaire pendant le développement car l'expression inappropriée de certains gènes développementaux qui sont contre-indiqués pour une lignée spécifique, serait préjudiciable5,6 . Par conséquent, démêler les mécanismes par lesquels PRC2 favorise la formation de domaines répressifs de chromatine chez les mammifères est d'une importance fondamentale pour comprendre l'identité cellulaire.
Tous les systèmes expérimentaux antérieurs conçus pour étudier la formation de domaine de chromatine, y compris les domaines de chromatine à médiation PRC2, ont été exécutés dans des conditions d'état stable, qui sont incapables de suivre les événements qui se déroulent de la formation de domaine de chromatine dans Cellules. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour générer un système cellulaire inductible qui surveille le recrutement initial et la propagation des domaines de chromatine. Plus précisément, nous nous concentrons sur le suivi de la formation de domaines de chromatine répressive à médiation PRC2 qui comprennent H3K27me2/3. Ce système qui peut capturer les détails mécanistes de la formation de domaine de chromatine, pourrait être adapté pour intégrer d'autres domaines de chromatine, tels que les domaines largement étudiés comprenant soit H2AK119ub ou H3K9me. Combinée à la génomique et aux technologies d'imagerie, cette approche a le potentiel de répondre avec succès à diverses questions clés en biologie de la chromatine.

<table><tbody><tr><td>(Z)-4-Hydroxytamoxifène (5 mg)</td><td>Sigma</td><td>H7904-5MG</td><td>Pour l’induction de l’expression de l’EED</td></tr><tr><td>Solution aqueuse de paraformaldéhyde à 16 % (10x10 ml)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td>Pour l’immunofluorescence</td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>LifeTechnologies</td><td>21985-023</td><td>Pour la culture de mESC</td></tr> Solution <tr><td>de gélatine à 2 %</td><td>Sigma</td><td>G1393-100ml</td><td>Pour mESC culture</td></tr><tr><td>Accutase 500 ML</td><td>Innovative Cell Tech/FISHER</td><td>AT 104-500</td><td>Pour la culture mESCs</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson immunoresaerch</td><td>711-585-152</td><td>Pour l’immunofluorescence</td></tr><tr><td>Aqua-Mount Montage Medium</td><td>FISHER/VWR</td><td>41799-008</td><td>Pour l’immunofluorescence</td></tr><tr><td>CHAMBRE SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK</td><td>Fisher Sci</td><td>177445PK</td><td>Pour l’immunofluorescence</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, Dichlorhydrate) - 10 mg</td><td>Life Tech</td><td>D1306</td><td>Pour l’inhibiteur d’immunofluorescence</td></tr><tr><td>ERK, PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>Pour la culture de mESCs</td></tr><tr><td>ESGRO Souris recombinante LIF Protein</td><td>Millipore/Fisher</td><td>ESG1107</td><td>Pour la culture de mESCs</td></tr><tr><td>FBS Stem Cell Qualified</td><td>Atlanta</td><td>S10250</td><td>Pour la culture de mESCs</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Pour le clonage de matrice donneuse</td></tr><tr><td>Inhibiteur de GSK3, CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>Pour la culture de mESCs</td></tr><tr><td>H3K27me2 (D18C8) Signalisation cellulaire de lapin mAB</td><td></td><td>9728S</td><td>Anticorps pour ChIP-seq</td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9733S</td><td>Anticorps pour ChIP-seq</td></tr><tr><td>Histone H2Av anticorps (pAb)</td><td>Motif actif</td><td>39715</td><td>Contrôle du pic pour ChIP-seq</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td>Pour la culture de mESCs</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>Pour la culture de mESCs</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>LifeTech</td><td>11668019</td><td>Pour la transfection</td></tr><tr><td>MangoTaq DNA Polymerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21079</td><td>Pour le génotypage PCR</td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal (10 mL)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Pour l’immunofluorescence</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Sigma/Roche</td><td>P0781</td><td>Pour la culture de mESCs</td></tr><tr><td>pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>Pour le clonage d’ARNg Solution d’extraction d’ADN</td></tr><tr><td>QuickExtract</td><td>Lucigen</td><td>QE0905T</td><td>Pour le génotypage PCR</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Kit de clonage PCR Zero Blunt</td><td>Thermo Fisher</td><td>K270020</td><td>Pour le clonage de modèles de donneurs</td></tr><tr><td>Primers/gBlocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EED-KO-gRNA-1</td><td></td><td></td><td>Sequence : ctctggctactgtcaactag. Les ARNg s’apparient pour knock-out EED dans C57BL/6 ESCs pour les systèmes i-WT-r et i-MT-r.</td></tr><tr><td>Séquence EED-KO-gRNA-2</td><td></td><td></td><td>: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. Les ARNg s’apparient pour neutraliser l’EED dans les ESC C57BL/6 pour les systèmes i-WT-r et i-MT-r.</td></tr><tr>Séquence induite <td></td><td></td><td>par l’EED-gRNA</td><td>: atggcaccccgaaattagaa. gRNA et donneur pour générer le système i-WT-r dans le contexte EED-KO.</td></tr><tr><td>i-WT-r Donor</td><td></td><td></td><td>https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA et Donor pour générer le système i-WT-r dans le contexte EED-KO.</td></tr><tr>Séquence induite <td></td><td></td><td>par l’EED-gRNA</td><td>: atggcaccccgaaattagaa. gRNA et donneur pour générer le système i-WT-r dans le contexte EED-KO.</td></tr><tr><td>i-MT-r Donor</td><td></td><td></td><td>https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA et Donor pour générer le système i-MT-r dans le contexte EED-KO.</td></tr><tr><td>Genotyping Primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gnt-EED-KO-FW-1</td><td></td><td></td><td>Séquence : ctgtaggctgccatctgtga. L’allèle de type sauvage produira un produit de 1,9 kb. L’allèle knockout produira un produit de 200 pb.</td></tr><tr><td>Gnt-EED-KO-REV-1</td><td></td><td></td><td>Séquence : agccagggctacacagagaa. L’allèle de type sauvage produira un produit de 1,9 kb. L’allèle knockout produira un produit de 200 pb.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-FW-1</td><td></td><td></td><td>Séquence : tgcagtgaaacaaatttggaa. Lorsque la casette est insérée, les amorces produiront 1863 pb. L’allèle de type sauvage produira un produit de ~200 pb.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-REV-1</td><td></td><td></td><td>Séquence : gagaggggtggcactgtaaa. Lorsque la casette est insérée, les amorces produiront 1863 pb. L’allèle de type sauvage produira un produit de ~200 pb.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-FW-2</td><td></td><td></td><td>Séquence : ccccctctttctctctctttttttct. Lorsque la casette est insérée, les amorces produiront 3200 pb. L’allèle de type sauvage produira un produit de 1560 pb.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-REV-2</td><td></td><td></td><td>Séquence : atgcctgggtgaatgaaaaa. Lorsque la casette est insérée, les amorces produiront 3200 pb. L’allèle de type sauvage produira un produit de 1560 pb.</td></tr></tbody></table>

une méthode d'étude de novo formation des domaines chromatine

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

L'organisation et la structure des domaines de chromatine sont uniques aux lignées cellulaires individuelles. Leur mauvaise réglementation pourrait entraîner une perte de l'identité cellulaire et/ou de la maladie. Malgré d'énormes efforts, notre compréhension de la formation et de la propagation des domaines de la chromatine est encore limitée. Les domaines de chromatine ont été étudiés dans des conditions d'état stable, qui ne sont pas propices à suivre les événements initiaux pendant leur établissement. Ici, nous présentons une méthode pour reconstruire inducibly les domaines de chromatine et suivre leur reformation en fonction du temps. Bien que, d'abord appliqué au cas de la formation de domaine de chromatine répressive à médiation PRC2, il pourrait être facilement adapté à d'autres domaines de chromatine. La modification et/ou la combinaison de cette méthode avec la génomique et les technologies d'imagerie fournira des outils précieux pour étudier en détail l'établissement des domaines de la chromatine. Nous croyons que cette méthode va révolutionner notre compréhension de la façon dont les domaines de chromatine se forment et interagissent les uns avec les autres.

Un régime général du système de sauvetage conditionnel La figure 1 montre le schéma de ciblage pour sauver conditionnellement les cellules EED KO avec WT ou cage-mutant (Y365A) EED qui est exprimé à partir du locus EED endogène. Après avoir éliminé EED, une sous-unité centrale de PRC2 essentielle à sa stabilité et à son activité enzymatique, une cassette dans l'intron suivant l'exon 9 de l'EED est introduite (Figure 1). La cassette se compose...

Cette méthode est conçue pour suivre la formation de domaines de chromatine à médiation PRC2 dans les lignées cellulaires, et la méthode peut être adaptée à de nombreux autres systèmes.

Une méthode d'étude de novo Formation des Domaines chromatine

The organization and structure of chromatin domains are unique to individual cell lineages. Their misregulation might lead to a loss in cellular identity ...

Nous décrivons un système pour évaluer la formation dynamique des domaines de chromatine. Nous utilisons ce système pour suivre le recrutement et la diffusion des domaines de chromatine prc2-2 dans les cellules. Le processus peut être interrompu à tout moment pour analyser les événements en cours.Ce système pourrait être orienté pour surveiller les changements dynamiques dans n’importe quel processus cellulaire donné et ne se limite donc pas au suivi de la formation de domaine chromatine. Commencez par concevoir des ARN guides pour supprimer les exon 10 et 11 d’une copie endogène du développement embryonnaire de l’ectoderme, ou EED, dans les cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de l’outil de conception CRISPR. Cloner le guide ARN dans le plasmide CRISPR/Cas9 selon les instructions manuscrites.Dans un format de plaques de six puits, transfect 200.000 cellules souches embryonnaires de souris, ou mESCs, avec un microgramme de chaque ARN guide en utilisant des réadiants transfection selon les instructions du fabricant. Changez les médias 24 heures après la transfection. Deux jours après la transfection, isoler les cellules GFP-positives à l’aide de FACS.L’efficacité de la transfection varie d’environ 10 à 30%, donc triez environ 500 000 cellules pour capturer suffisamment de cellules GFP positives pour le placage. Plaquez les cellules gfp-positives isolées en plaques de 15 centimètres qui sont pré-enduites de gélatine de 0,1 % pour la cueillette des colonies. Faire croître les cellules dans le milieu ESC pendant environ une semaine jusqu’à ce que les colonies simples soient visibles, en s’assurant de changer les médias tous les deux jours.Choisissez un minimum de 48 colonies à l’aide d’une pointe de pipette de 20 microlitres pour gratter la colonie pendant l’aspiration. Sans décomposer la colonie en cellules individuelles, transférez-la dans une plaque contenant 96 puits contenant de l’Accutase. Incuber les colonies à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes pour dissocier les cellules.Ajoutez ensuite 200 microlitres de supports ESC à chaque puits avec une pipette multicanal. Bien mélanger et plaquer les cellules en deux plaques séparées de 96 puits. Utilisez l’une des plaques pour le génotypage et gardez l’autre en croissance jusqu’à ce que le génotypage soit terminé.Extraire l’ADN de la plaque à l’aide de reagents commerciaux et suivre les instructions du fabricant. Utilisez des amorces génotypage qui couvrent le site supprimé pour effectuer le génotypage PCR avec polymése d’ADN Taq. Observez un produit d’ADN de poids moléculaire inférieur dans les cellules avec une suppression d’homozygote par rapport aux cellules sauvages-type.Guide de conception ARN pour introduire une coupe dans l’intron suivant l’exon 9 de l’EED à l’aide d’un outil de conception CRISPR, et le cloner dans le plasmide CRISPR/Cas9 selon les instructions manuscrites. Concevoir un modèle d’ADN donneur qui inclut la séquence EED cDNA après l’exon 9 et une étiquette Flag-HA en amont d’une séquence T2A-GFP, le tout en orientation inverse par rapport à la séquence du gène endogène. Flanquez la cassette d’un épissage-accepteur et d’une séquence de polyadenylation nichée entre des sites de loxP inversés héterologiques, et incluez au moins 500 paires de base d’armes homologiques de chaque extrémité.Divisez le modèle de donneur en deux segments de fragments de gènes gBlocks et assemblez-les en un vecteur PCR Blunt à l’aide du clonage Gibson suivant les instructions du fabricant. Dans un format de plaques de six puits, transfect 200.000 mESCs avec un microgramme de l’ARN guide et un microgramme des modèles donneurs. Puis isoler les cellules GFP-positives à l’aide de FACS.Isoler les colonies individuelles pour le génotypage selon les instructions manuscrites. Utilisez la cytométrie du débit pour confirmer que les MESC n’ont pas d’expression qui fuit du GFP et, si c’est le cas, isolez les cellules gfp-négatives par FACS avant de commencer l’expérience. Étendre les cellules en cinq plaques de 15 centimètres, et induire l’expression de type sauvage ou cage mutant EED en administrant 5 micromolaires 4-hydroxytamoxifène pour cinq durées différentes allant de zéro heures à huit jours.Changez les médias après 12 heures pour des traitements qui durent plus longtemps que cela. Isoler les cellules recombinées avec succès par FACS à l’aide de GFP, et effectuer ChIP-seq pour H3K27me2 et H3K27me3 pour étudier leur dépôt temporel à la chromatine en réponse à la ré-expression de type sauvage ou cage mutant EED. Pour valider le sauvetage inducible de type sauvage et les systèmes de sauvetage mutants inductibles, la tache occidentale a été exécutée sur des extraits entiers après l’induction de l’EED sauvage-type ou cage-mutant avec le traitement de 4 hydroxytamoxifène.L’analyse de cytométrie de flux a été employée pour confirmer l’efficacité de l’expression de T2A-GFP dans les cellules d’i-WT-r avant et après le traitement de 4-hydroxytamoxifen, qui démontre le flip réussi de la cassette inversée. ChIP-seq de H3K27me3 a été exécuté après ré-expression de type sauvage ou cage-mutant EED. L’émergence du H3K27me3 est observée 12 heures après l’expression de l’EED de type sauvage sur des sites de nucléation discrets, puis à 24 heures dans des régions éloignées des sites de nucléation initiaux.ChIP-seq a également été utilisé pour suivre le dépôt temporel de H3K27me2, qui semble précéder le dépôt H3K27me3. Les foyers H3K27me3 et leur croissance ont également été visualisés par microscopie fluorescence. Après 12 heures d’expression eED de type sauvage, il existe des preuves de formation de foyers H3K27me3.Ces foyers augmentent en nombre et en taille de 24 heures et finissent par se propager à de grandes régions du noyau de 36 heures. La conception précise des constructions d’ADN est très importante pour générer le système de sauvetage inductible désiré. Cette méthode peut fournir un contrôle temporel et spécial des mutations des protéines chez la souris.De cette façon, on pourrait déterminer l’effet des mutations dans un tissu spécifique ou à un stade spécifique de développement. Nous utilisons actuellement ce système pour surveiller l’établissement dynamique d’un autre domaine chromatine, polycomb complexe répressif 1.

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Cette vidéo décrit le protocole de cisaillement de la chromatine à l’aide de la digestion enzymatique des nucléases micrococciques. Le cisaillement de la chromatine est une étape essentielle du flux de travail de l’immunoprécipitation de la chromatine ou ChIP, qui permet d’étudier l’interaction protéine-ADN dans les cellules de leucémie myéloïde chronique humaine. Dans le protocole de fonctionnalité, le cisaillement de la chromatine est effectué à l’aide de la sonication.

Cisaillement de la chromatine : une méthode pour générer des fragments de chromatine à l’aide de la digestion enzymatique

La question de savoir comment les organismes de réglementation et des états de la chromatine chromatine affecte le génome in vivo est essentielle à notre compréhension de la façon dont les premières décisions du destin cellulaire sont faites dans l'embryon en développement. ChIP-Seq-la méthode la plus populaire pour étudier les caractéristiques de la chromatine au niveau-est globale définie ici pour les embryons de xénope.

Snapshot échelle du génome des régulateurs de la chromatine et les États dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryons par Chip-Seq

Sequential extraction du sel de protéines chromatiniennes lié est un outil utile pour déterminer les propriétés de liaison de complexes protéiques importantes. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer le rôle des sous-unités individuelles ou des domaines de l’affinité globale d’une protéine complexe en bloc de la chromatine.

Extractions séquentielles de sels pour l’analyse de la chromatine en vrac, lier des propriétés de la chromatine modification Complexes

Nous présentons une immunoprécipitation de la chromatine native mis à jour le séquençage (ChIP-seq) méthodologie pour la production d’ensembles de données de séquence pour un cadre d’analyse des nucléosomes densité ChIP-seq intégrant l’accessibilité nucléase micrococcique (MNase) avec mesures de modification d’histone.

Génération d’immunoprécipitation de la chromatine Native séquençage des bibliothèques pour l’analyse de densité de nucléosomes

La plasticité d’architecture nucléaire est contrôlée par des mécanismes épigénétiques dynamiques, y compris non codantes ARN, ADN méthylation, repositionnement du nucléosome ainsi que histone composition et modification. Nous décrivons ici un protocole d’isolement Formaldehyde-Assisted des éléments réglementaires (FAIRE) qui permet la détermination de l’accessibilité de la chromatine de façon reproductible, peu coûteuse et simple.

Formaldéhyde-assisted isolement des éléments régulateurs à mesure accessibilité de la chromatine dans les cellules de mammifères

Ce protocole se concentre sur la préparation de la chromatine à partir de tissus congelés et convient à l’immunoprécipitation de la chromatine par réticulation (X-ChIP) suivie d’une analyse PCR quantitative (X-ChIP-qPCR) ou d’approches de séquençage de nouvelle génération (X-ChIP-seq).

Extraction de chromatine à partir de tissu hépatique chimérique congelé pour l’analyse de l’immunoprécipitation de la chromatine

Ce protocole présente une technique de cartographie à haute résolution des sites de réplication dans la chromatine structurellement préservée in situ qui utilise une combinaison de marquage pré-intégration EdU-streptavidin-Nanogold et ChromEMT.

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Obtenir un A avec les 3C: Capture de conformation chromosomique pour les étudiants de premier cycle

Nous présentons un protocole tricolore de microscopie de localisation de la chromatine à molécule unique (SMLM) qui permet une cartographie reproductible de l’euchromatine, de l’hétérochromatine et du RNAP II pour une analyse spatiale. Ce protocole permet un marquage multicolore efficace dans des environnements nucléaires denses, y compris des cibles associées à la chromatine, permettant une détection simultanée fiable.

Un protocole de microscopie de localisation multi-marquage à molécule unique pour l’étude de la chromatine dans un environnement nucléaire dense

Découvrez une méthode CRISPR pour suivre la formation dynamique des domaines chromatine PRC2 dans les cellules souches embryonnaires de souris. Ce système permet de mettre en pause l'analyse pour étudier les processus cellulaires en temps réel.

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