Name: Purification de lhomme S100A12 et de ses oligomères induits par les ions pour la stimulation cellulaire immunitaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Découvrez la purification de S100A12 et de ses oligomères induits par les ions pour la stimulation des monocytes humains. Cette méthode fournit une protéine pure et sans endotoxine pour les études immunologiques.

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Cette étude a été soutenue par des subventions du programme de recherche médicale innovante intra-muros de la faculté de médecine de l'Université De Muenster (KE121201 à C.K.) et de la Fondation allemande de recherche (DFG, Fo354/3-1 à D.F.).

REMARQUE: Veuillez consulter le tableau supplémentaire 1 pour la préparation des tampons et des solutions de stock.
1. Expression protéique dans E. coli
<ol><li>
clonage
	<ol>
<li>Clone sans étiquette humaine S100A12 (NCBI Reference Sequence: NP-005612.1) dans l'expression bactérienne vecteur pET11b. Pour exprimer la protéine, transformez la construction en E. coli BL21(DE3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
culture
	<ol>
<li>Préparer une culture de démarrage en inoculé une seule colonie dans 5 ml de milieu de croissance (bouillon LB avec une ampicilline de 100 g/mL) dans un tube à fond rond de 14 ml. Incuber toute la nuit à 37 oC en secouant à 220 tr/min. Transférer 2 à 4 ml de culture de nuit dans 400 ml de milieu de croissance dans un flacon Erlenmayer de 2 L et incuber la culture à 37 oC en secouant à 220 tr/min. REMARQUE: La densité initiale de la culture principale devrait être la densité optique à 600 nm (OD600) - 0,1.</li>
		<li>Surveillez l'OD600 pendant la croissance. Induire l'expression des protéines en s'ajoutant 1 M d'isopropyl-D-thiogalactopyranosid (IPTG) à une concentration finale de 1 mM à600 OD 0,5 à 0,6. Incuber à 37 oC et 220 tr/min pour 4 h supplémentaires. REMARQUE: En général, un OD600 de 0,6 sera atteint après 1,5 à 2,5 h à 37 oC.</li>
		<li>Préparer un tampon de sonication de 50 ml en dissolvant 50 mM De Tris, 50 mM de NaCl et 1 mM d'acide tétraacétique d'éthylènediamine (EDTA) dans 40 mL d'eau déionisée. Ajuster le pH avec HCl à 8,0 et faire jusqu'à 50 ml. Ajouter l'inhibiteur de la protéase (1 comprimé par solution de 50 ml) et réquilibrer le tampon à 4 oC.</li>
		<li>Transférer la culture bactérienne dans des bouteilles de centrifugeuses appropriées et récolter les cellules à 3 200 x g pendant 30 min à 4 oC. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 25 ml de tampon de sonication glace-froid. Désormais, gardez les cellules sur la glace. REMARQUE : Les cellules suspendues peuvent être stockées à -20 oC à court terme et à -80 oC à long terme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sonication/lysis
	<ol>
<li>Sonicate les cellules pour 6 cycles de 30 s sur la glace. Après chaque cycle, les cellules de repos pour 30 à 60 s pour protéger les cellules contre la surchauffe.</li>
		<li>Transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugation à grande vitesse préréfrigéré de 50 ml et une centrifugeuse dans un rotor à angle fixe à 15 000 x g pendant 30 min à 4 oC. Décantez le lysate défriché qui contient les protéines cytosoliques solubles dans un tube frais de 50 ml et jetez la pastille.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Purification des protéines
<ol><li>Chromatographie d'échange d'anion
	<ol>
<li>dialyse<ol>
<li>Préparer la chromatographie d'échange d'anion (AIEX) tampon A en dissolvant 20 mM Tris, 1 mM EDTA et 1 mM d'éthylène glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N'-tetraacetic acid (EGTA) dans de l'eau déionisée et ajuster le pH à 8,5 avec HCl. Pour la dialyse préparer 2 x 5 L et pour la chromatographie 2x 1 L de tampon AIEX A. REMARQUE: Le volume de dialysate doit être environ 100 fois le volume de l'échantillon. Tous les tampons utilisés pour la chromatographie doivent être filtrés (0,45 m ou plus petit) et dégazés (p. ex., par bain à ultrasons ou dégazage sous vide).</li>
			<li>Couper les tubes de dialyse (coupure de poids moléculaire [MWCO] : 3,5 kDa) dans une longueur appropriée avec un espace supplémentaire pour l'air afin d'assurer la flottabilité de l'échantillon au-dessus de la barre d'agitation rotative. REMARQUE: Le glycérol préserve la membrane et doit être enlevé avant utilisation.</li>
			<li>Pour réduire la viscosité de la solution protéique défrichée de l'étape 1.3.2, diluer la solution avec 25 ml de tampon A d'AIEX pour faciliter l'application ultérieure à la colonne de chromatographie. Fixez la première fermeture sur le tube, chargez l'échantillon dans la membrane et attachez la deuxième fermeture à au moins 1 cm de l'extrémité supérieure du tube.</li>
			<li>Placer le récipient de 5 L avec le tampon A d'AIEX sur une plaque d'agitation, ajouter une barre d'agitation et la membrane remplie de solution protéinée. Ajuster la vitesse pour faire pivoter l'échantillon en évitant les interférences avec la barre tournante. Dialyser pendant 12 à 24 h à 4 oC, puis remplacer le tampon de dialysate (amortiaaa a) par une préparation fraîche pré-refroidie et continuer pendant au moins 4 heures supplémentaires. Transférer la solution de protéines dialysées dans un tube de 50 ml et filtrer à travers une unité de filtre de 0,45 m. REMARQUE: Stockage possible.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Chromatographie</li>
		<li>Démarrez le système de chromatographie liquide (FPLC) avec un entretien général, connectez les tampons de colonne AIEX A et AIEX B (amorti adème A avec 1 M NaCl) et la colonne contenant de la résine d'échange d'anions. Consultez le tableau 1 pour les paramètres chromatographiques généraux. REMARQUE : Les tampons, les colonnes et l'équipement FPLC doivent être récalcitrés à la même température avant de commencer la course (se référer aux paramètres chromatographiques du tableau 1, du tableau 2, du tableau 3, du tableau 4et du tableau 5).</li>
		<li>Équilibrez la colonne avec le tampon A de l'AIEX, chargez ensuite l'échantillon sur la colonne et élichez les protéines avec un gradient linéaire de 0 % à 100 % de tampon de haute teneur en sel (AIEX B). Consultez le tableau 2 pour un protocole de méthode détaillé.</li>
		<li>Recueillir 2 fractions de mL pendant l'élution et analyser 10 L de chaque fraction sur un Coomassie-stained 15% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Mettre en commun les fractions contenant de la protéine S100A12 pour la dialyse. REMARQUE: Le poids moléculaire de S100A12 est de 10 575 Da.</li>
	</ol></li>
	<li>Chromatographie hydrophobique-interaction dépendante du calcium (HIC)
	<ol>
<li>dialyse<ol>
<li>Dialysez la solution protéique contre 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.5 suivant la procédure décrite dans la section 2.1.1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Chromatographie<ol>
<li>Préparer 1 L de chromatographie tampon HIC A en dissolvant 20 mM Tris, 140 mM NaCl et 25 mM CaCl2 dans de l'eau déionisée et ajuster le pH à 7,5. Pour le tampon B HIC, dissoudre 20 mM Tris, 140 mM NaCl et 50 mM EDTA. Ajuster le pH à 7,0 et filtrer et dégazer les tampons. Ajouter le CaCl2 à l'échantillon à une concentration finale de 25 mm et filtrer à travers 0,45 m. Equilibrate hic buffers et échantillon à 4 oC (température de colonne).</li>
			<li>Démarrez le système de chromatographie liquide avec l'entretien général, connectez les tampons de colonne HIC A et B et la colonne. Consultez le tableau 3 pour d'autres paramètres chromatographiques.</li>
			<li>Équilibrez la colonne, chargez l'échantillon et prolongez le bloc « laver l'échantillon non lié » jusqu'à ce que le signal UV atteigne à nouveau le niveau de référence. Ensuite, commencez l'élution avec un chélateur de calcium contenant tampon (EDTA). Consultez le tableau 4 pour un protocole de méthode détaillé. REMARQUE: Des expériences antérieures ont montré qu'un excès de calcium semble être bénéfique pour la liaison de S100A12 à la résine de chromatographie.</li>
			<li>Recueillir des fractions de pointe de 2 ml et analyser 10 L de chaque fraction sur un SDS-PAGE teinté de Coomassie de 15 %. Piscine pure S100A12 fractions et dialyser contre Hepes tamponné saline (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7.0) comme décrit dans la section 2.1.1. REMARQUE: Le coefficient d'extinction du monomeric S100A12 est de 2980 M-1 cm-1.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. Détection et élimination de l'endotoxine
<ol><li>
Détection de l'endotoxine
	<ol>
<li>Pour déterminer la contamination par l'endotoxine, mesurez les concentrations de protéines diluées à partir de l'étape 2.2.2.4. (p. ex., 1:10 et 1:100 dans HBS) utilisant un essai immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) à base d'analyse fluorescente de détection d'endotoxine(tableau des matériaux). Effectuez cet exemple en suivant le protocole du fabricant. REMARQUE: Utilisez des solutions HBS fraîchement préparées dissoutes dans de l'eau désionisée ultrapure pour éviter la (nouvelle) contamination par l'endotoxine par le tampon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Enlèvement de l'endotoxine et concentration de protéines
	<ol>
<li>Chargez 15 ml d'échantillon sur une unité de filtre centrifugeuse de 50 kDa et une centrifugeuse à 3 200 x g et 10 oC pendant environ 10 min. Transférer le flux dans un récipient frais (sur la glace) et remplir et centrifuger le tube filtrant de 50 kDa aussi souvent que nécessaire. Laver la membrane du filtre deux fois avec HBS pour récupérer autant de protéines que possible après chaque étape.</li>
		<li>Concentrez le flux s100A12 en utilisant un filtre centrifuge de 3 kDa jusqu'à ce que le volume soit réduit à un cinquième jusqu'à un dixième du volume de chargement initial (centrifugation à 3 200 x g, 10 oC pendant environ 30 min). Remplissez le filtre aussi souvent que nécessaire, rincez la membrane et transférez la solution concentrée dans un nouveau tube après chaque recharge. Jetez le flux à travers. Filtrer à nouveau à travers 50 kDa comme décrit ci-dessus. REMARQUE: Au cours de cette procédure, la perte de protéines est remarquable (jusqu'à 50%), mais la préparation de protéines restantes est complètement épuisée de LPS. Cette méthode produit environ 10 à 15 mg de protéines provenant de la culture de 400 ml.</li>
		<li>Ajustez la solution protéique à 1 mg/mL avec hbS sans endotoxine et mesurez la teneur en LPS telle que décrite à l'étape 3.1.1. Dans le cas où la solution protéique n'est toujours pas testée comme sans LPS (lt;0.1 EU/mL), éliminez les contaminations résiduelles en utilisant une résine d'élimination de l'endotoxine. REMARQUE: Avec une concentration en protéines de 1 mg/mL, la contamination de 0,1 UE/mL LPS équivaut à environ 0,01 pg de protéines LPS/g.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Croisement chimique et séparation d'Oligomer
<ol><li>
Liaison sylencelle chimique
	<ol>
<li>Préparer des solutions de stock très pures (sans endotoxine) de 1 M CaCl2 et 100 mM ZnCl2 dans de l'eau déionisée ultrapure (Table des Matériaux). Utilisez ce tampon, fraîchement préparé, pour l'étape suivante.</li>
		<li>Incubate 10 ml de S100A12 purifié sans endotoxine (concentration 1 mg/mL en HBS) pendant 30 min à température ambiante (RT) avec 25 mM CaCl2 pour dimérique/tétramérisme, ou 25 mM CaCl2 et 1 mM ZnCl2 pour hexameric/tetrameric S100A12 Oligomères.</li>
		<li>Préparer le crosslinker en dissolvant 8 mg de BS3 dans 500 l d'eau sans endotoxine directement avant utilisation (8 mg de liaison croisée pour une solution de protéines ioniques de 10 mL équivaut à une concentration finale de 1,4 mM). Mélanger le crosslinker et l'échantillon par pipetting et incuber pendant 30 min supplémentaires à RT. Quench la réaction en ajoutant 1 M Tris-HCl, pH 7,5 à une concentration finale de 50 mM et filtrer à travers 0,45 m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Chromatographie de taille-exclusion
	<ol>
<li>Équilibrez l'échantillon relié à 12'15 oC (température de colonne) et démarrez le système de chromatographie liquide avec un entretien général. Connectez le tampon de colonne (HBS) et la colonne taille-exclusion. Consultez le tableau 5 pour obtenir des renseignements détaillés.</li>
		<li>Équilibrez la colonne dans HBS, chargez l'échantillon et collectez des fractions de pointe (1/2 ml) pendant la course. Analysez ces fractions sur un gradient de 4 à 20 % SDS-PAGE et mettez en commun les fractions avec les principales bandes du complexe protéique désiré. REMARQUE: L'hydrolyse des réactifs d'ester de NHS comme BS3 dans les solutions aqueuses a comme conséquence une absorption forte à 280 nm. Le lien croisé non lié (poids moléculaire : 572 g/mol) élit à la fin de la course et donne un pic fort.</li>
		<li>Concentrez les solutions en utilisant des unités de filtre centrifuge avec des MWCO de 10 kDa (dimer), 30 kDa (tétramer) ou 50 kDa (hexamer). Déterminer la contamination par l'endotoxine telle que décrite à la section 3.1. Si nécessaire, retirer le Reste de LPS avec une résine d'élimination de l'endotoxine suivant les recommandations du fabricant (Tableau des matériaux).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Tests fonctionnels sur les monocytes
<ol><li>Préparation des monocytes
	<ol>
<li>Isoler les monocytes des manteaux bouffi humains par centrifugation de gradient de densité et enrichissement monocyte subséquent à l'aide d'un kit de séparation de perles magnétiques (Tableau des matériaux). REMARQUE: Ce protocole donnera environ 5 à 7 x 107 monocytes (une couche bouffie) d'une pureté de 83 à 95 %. Étant donné que le nombre, mais aussi la réactivité des cellules dépend fortement du donneur, le protocole peut devoir être mis à l'échelle (selon le nombre de cellules requis).</li>
		<li>Pour la centrifugation de densité, équilibrez la solution de séparation (densité de 1,077 g/mL) vers RT et transférez 20 mL en tubes centrifugeuses de 50 ml (2 tubes par pelage bouffi). Diluer le sang du pelage buffy humain avec la solution de sel tamponné de Hank (HBSS) à un volume total de 60 ml et une couche de 30 ml de ce mélange soigneusement sur le dessus du milieu de séparation. Centrifugeuse à 550 x g pendant 35 min à RT. Désapire le frein de centrifugeuse.</li>
		<li>Après centrifugation, les cellules sanguines périphériques mononucléaires (PBMC) sont situées directement au-dessus du milieu de séparation. Transférer ces cellules dans un tube frais de centrifugeuse de 50 ml, faire jusqu'à 50 ml avec HBSS, et centrifugeuse à 170 x g pendant 10 min. Aspirer le supernatant et resuspendre la pastille cellulaire dans un petit volume de HBSS par pipetting.</li>
		<li>Remplissez le tube jusqu'à 50 ml et la centrifugeuse à 290 x g pendant 10 min. Aspirez à nouveau le supernatant, suspendez les cellules en HBSS (50 ml) et centrifugeoire à 170 x g pendant 10 min. Comptez les cellules et resuspendez-les dans un tampon de séparation cellulaire (Tableau des matériaux /c9) à une concentration de 5 x 107 cellules/mL. REMARQUE: Au lieu de HBSS, saline tamponnée de phosphate (PBS) peut être employée pour laver les cellules.</li>
		<li>Pour l'isolement des monocytes des PBMC, utilisez un kit magnétique d'isolement cellulaire négatif et suivez le protocole du fabricant. Compter les monocytes et le resuspendre dans le milieu monocyte (RPMI 1640, 15% sérum fœtal de veau inactivé par la chaleur [FCS], 4 mM L-glutamine, 100 U/mL pénicilline/streptomycine) à une concentration de 2 x 106 cellules/mL.</li>
		<li>Pour les monocytes de culture, enrober les plats de culture (p. ex., 100 mm) d'un film hydrophobe perméable au gaz, adapté aux cellules de suspension(Tableau des matériaux). Stériliser les plaques en utilisant la lumière UV pendant environ 30 min. Transférer les cellules à ces plaques de culture et les laisser reposer toute la nuit à 37 oC et 5 % de CO2. REMARQUE: Utilisez 15 à 25 ml de suspension cellulaire par plat enduit.</li>
	</ol></li>
	<li>Stimulation monocyte
	<ol>
<li>Stimulation avec S100A12 (type sauvage) REMARQUE: Pour distinguer le S100A12 non traité (produit final de la section 2.2.2) de la protéine reliée croisée, S100A12 dans ce qui suit est appelé «type sauvage».<ol>
<li>Transférer les cellules reposées dans un tube centrifugeur de 50 ml et une centrifugeuse à 350 x g pendant 10 min. Aspirez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire dans un milieu de stimulation (RPMI 1640, 5 % DE FCS inactivé par la chaleur, 4 mM L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline/ streptomycine) à une concentration de 2 x 106 cellules/mL.</li>
			<li>Pour la stimulation, utilisez 24 plaques de suspension de puits et ajoutez 250 l de suspension cellulaire par puits (0,5 x 106 cellules/puits). Ajouter 50 g/mL de polymyxine B aux puits prévus, suivi s'il le faut soit en LPS à différentes concentrations (25, 50, 100 et 200 pg/mL) soit par le wildtype S100A12 (10, 20, 40, 60 g/mL). De plus, appliquez la protéine non traitée ou dénaturée par la chaleur (99 oC, 10 min) en différentes concentrations sur les cellules. REMARQUE: Un traitement thermique court dénature la protéine S100A12, mais a moins ou moins d'effet sur Le LPS.</li>
			<li>Incuber les plaques pendant 4 h à 37 oC et 5 % de CO2. Récoltez les cellules en transférant la suspension cellulaire de chaque puits à des tubes de réaction de 1,5 ml. Centrifugeuse à 500 x g pendant 10 min. Transférer les supernatants sur des tubes frais et mesurer la libération de TNFMD dans différentes dilutions (p. ex. 1:2, 1:5, 1:10) avec un kit humain TNFMD ELISA suivant les recommandations du fabricant.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Stimulation avec oligomères S100A12<ol>
<li>Préparer et ensemencer les monocytes dans 24 plaques de suspension de puits comme décrit ci-dessus. Stimulez les cellules en ajoutant des oligomères S100A12 à partir de l'étape 4.2.3. en différentes concentrations molaires (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM). REMARQUE: Afin de comparer les capacités des différents oligomères pour stimuler les monocytes, des oligomères ont été appliqués aux cellules dans des concentrations molaires comparables.</li>
			<li>Incuber pendant 4 h à 37 oC et 5 % de CO2,récolter les cellules et mesurer la libération de TNFMD dans les supernatants comme décrit ci-dessus.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Dans ce protocole, nous décrivons l'expression bactérienne tag-free de S100A12 humain et sa purification aussi bien que la séparation dans différents oligomères ion-induits pour la stimulation de cellules immunitaires. Comparé à la littérature éditée sur la purification de protéine de S100A128,23,24, l'utilisation du CaCl2 élevé (25 mM) dans la chromatographie hydrophobe-interaction est à notre connaissance unique. Pl...

S100A12 est une protéine de liaison de calcium qui est principalement produite par les granulocytes humains. La protéine est surexprimée pendant l'inflammation (systémique) et ses niveaux de sérum, particulièrement dans les maladies (auto)inflammatoires telles que l'arthrite idiopathique juvénile systémique (sJIA), la fièvre méditerranéenne familiale (FMF) ou la maladie de Kawasaki (KD) peut informer au sujet de l'activité de la maladie et la réponse à la thérapie. Selon les récepteurs de reconnaissance des modèles (PRR) tels que les récepteurs à péage (TLR), le système immunitaire inné peut être activé par des modèles moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP) comme les lipopolysaccharides (LPS) ou des modèles moléculaires associés à des dommages (DAMP; également appelé «alarmins»). Les DAMP sont des molécules endogènes telles que les protéines cellulaires, les lipides ou les acides nucléiques1. DAMP-fonctions sont bien décrits pour les membres de la famille des protéines calgranuline, S100A8/A9 et S100A122, qui sont également signalés pour fonctionner comme métal divalent ion-chelating peptides antimicrobiens3,4, 5,6. Selon la force d'ion disponible S100A12 peut, comme d'autres membres de la famille S100, organiser dans différents homomultimers et jusqu'à récemment l'impact de S100A12-oligomerisation sur PRR-interaction, en particulier TLR4, était inconnu.
La forme monomérique de la protéine (92 acides aminés, 10,2 kDa) se compose de deux structures d'hélice-boucle-boucle EF reliées par un lien flexible. Le C-terminalEF-hand contient le motif classique Ca2 -contraignant tandis que le N-terminalEF-hand présente une structure de boucle étendue spécifique aux protéines S100 ('pseudo-EF-hand') et révèle une affinité Ca2'. La liaison Ca2MDpar S100A12 peut entraîner un changement conformationnel majeur dans le terminus Cdes protéines, qui entraîne l'exposition d'un patch hydrophobe sur chaque monomère et forme l'interface de dimerisation. Ainsi, dans des conditions physiologiques, la plus petite structure quaternaire formée par S100A12 est un dimère non covalent (environ 21 kDa) dans lequel les monomères individuels sont en orientation antiparallèle. Lorsqu'il est disposé comme dimère, S100A12 est signalé à séquestreZ2 ainsi que d'autres ions métalliques divalents, par exemple, Cu2 avec une forte affinité7. Ces ions sont coordonnés à l'interface dimère S100A12 par les acides aminés H15 et D25 d'une sous-unité et H85 ainsi que H89 de l'autre sous-unité anti-parallèle8,9,10. Tandis que des études antérieures suggèrent que Zn2 -chargéS100A12 peut induire l'organisation de la protéine en homo-tetramers (44 kDa) et pour avoir comme conséquence l'augmentation De Ca2- affinité11,12, titration métallique récente les études6 suggèrent Ca2-contraignant par S100A12 pour augmenter l'affinité de la protéine à Zn2. Une fois que les mains EF S100A12 sont entièrement occupées par Ca2,on pense que le Ca2 supplémentaire se lie entre les dimères, déclenchant la formation d'hexamer (environ 63 kDa). L'architecture de la structure hexameric quarternary est clairement différente de celle du tétramer. Il est proposé que l'interface tétramer est perturbée pour donner lieu à de nouvelles interfaces dimer-dimer qui bénéficie formation hexamer10. S100A12 est presque exclusivement exprimé par les granulocytes humains où il constitue environ 5% de toute la protéine cytosolique13. Dans sa fonction DAMP S100A12 a été historiquement décrit comme agoniste du récepteur multi-ligand pour les produits finaux avancés de glycation (RAGE), alors appelé protéine extracellulaire nouvellement identifiée rage-contraignante (EN-RAGE)14. Bien que nous ayons précédemment rapporté biochimique S100A12-contraignant à la fois RAGE et TLR415, nous avons récemment démontré monocytes humains pour répondre à la stimulation S100A12 d'une manière TLR4-dépendante16. Cela nécessite l'arrangement de S100A12 dans sa ca2/Zn2 -induitstructure hexameric quarternary16.
Ici nous décrivons une procédure de purification pour l'homme recombinant S100A12 et ses oligomères ion-induits pour des stimulations de cellules immunitaires16,17. Ceci est basé sur une stratégie de chromatographie en deux étapes, qui comprend initialement une colonne d'échange d'anions pour isoler et concentrer la protéine et éliminer les contaminations en vrac (par exemple, les endotoxines/lipopolysaccharides)18. Les résines de chromatographie ion-échange séparent les protéines sur la base de différentes charges de surface nettes. Pour les protéines acides comme S100A12 (point isoélectrique de 5,81), un système tampon avec un pH de 8,5 et une forte résine d'échange d'anion conduit à une bonne séparation. Les protéines liées ont été élucées avec un gradient tampon à haute teneur en sel. Avec une augmentation de la force ionique des ions négatifs dans le tampon d'élution concurrencent les protéines pour les charges sur la surface de la résine. Les protéines s'éliment individuellement en fonction de leur charge nette et, par conséquent, les tampons décrits ci-dessus permettent d'isoler et de concentrer la protéine S100A12 surexprimée. En raison de groupes chargés négativement dans les lipopolysaccharides, ces molécules se lient également aux résines d'échange d'anion. Cependant, leur charge nette plus élevée entraîne une élution ultérieure dans le gradient de haute teneur en sel appliqué. La deuxième étape de la procédure de purification a été introduite à des fins de polissage. Cela permet d'utiliser la capacité de liaison de calcium de S100A12 et élimine les impuretés restantes sur une colonne hydrophobe-interaction. La liaison calcique de S100A12 entraîne un changement conformationnel et une exposition de plaques hydrophobes à la surface de la protéine. À cette condition, S100A12 interagit avec la surface hydrophobe de la résine. Sur le calcium-chelating par EDTA, cette interaction est inversée. En présence d'ions, en particulier de calcium et de zinc, S100A12 s'arrange en oligomères homoméricagris. Pour étudier les relations structure-fonction des différents oligomères, nous avons stabilisé le sadicycle, le tétramérique et le recombinant hexamérique S100A12 avec un crosslinker chimique et avons séparé les complexes sur une colonne de chromatographie d'exclusion de taille. Enfin, pour analyser la fonctionnalité et l'activité biologique de la protéine purifiée et de ses oligomères induits par les ions, la libération de cytokine du monocyte stimulé S100A12 et du LPS peut être comparée.
Diverses méthodes de purification du S100A12 ont été décrites jusqu'à présent. Jackson et coll.19, par exemple, ont publié un protocole avec purification par l'intermédiaire d'une colonne d'échange d'anion et d'une chromatographie d'exclusion de taille ultérieure. Le polissage de la purification sur une colonne d'exclusion de taille donne de bons résultats, mais, en raison par exemple des volumes de chargement limités, il est moins flexible en matière d'évolutivité. Une approche différente, publiée par Kiss et coll.20, décrit la purification des protéines étiquetées par la colonne d'affinité Ni2 comme la première étape de purification, suivie d'un clivage enzymatique pour enlever l'étiquette et d'autres étapes de purification. Contrairement aux études précitées19,20, la protéine produite telle que décrite dans ce protocole est déterminée pour des expériences sur les cellules immunitaires. Par conséquent, la contamination résiduelle d'endotoxine de la culture bactérienne est un défi. Bien que différentes approches pour l'élimination de l'endotoxine ont été décrites jusqu'à présent, il n'existe aucune méthode uniforme qui fonctionne aussi bien pour une solution de protéines donnée21,22.
En résumé, notre protocole combine les avantages d'une expression sans étiquette dans un système bactérien avec l'élimination efficace de l'endotoxine et un rendement élevé de protéines pures.

<table><tbody><tr><td>vecteur pET11b</td><td>Novagen</td><td>&nbsp ; </td><td>&nbsp ; </td></tr><tr><td>BL21(DE3) compétent E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527</td><td>&nbsp ; </td></tr><tr><td>&nbsp ; </td><td>&nbsp ; </td><td>&nbsp ; </td><td>&nbsp ; </td></tr><tr><td>100x Acides aminés non essentiels</td><td>Merck</td><td>K 0293</td><td></td></tr><tr><td>25 % HCl</td><td>Carl Roth</td><td>X897.1</td><td></td></tr><tr><td>4&minus ; 20 % Mini-PROTEAN TGX Protein Gels</td><td>BioRad</td><td>4561093</td><td></td></tr><tr><td>Sel sodique d’ampicilline</td><td>Carl Roth</td><td>HP62.1</td><td></td></tr><tr><td>BS3 (sous-assujetti de bis(sulfosuccinimidyl)) - 50 mg</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21580</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid Dihydrat</td><td>Carl Roth</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Briliant Blue R250 Solution de décoloration</td><td>BioRad</td><td>1610438</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Briliant Blue R250 Solution de coloration</td><td>BioRad</td><td>1610436</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit d’enrichissement en monocytes humains</td><td>Stemcell</td><td>19059</td><td>Kit d’isolement de cellules négatives magnétiques</td></tr><tr><td>EDTA sel disodique dihydraté</td><td>Carl Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>EndoLISA</td><td>Hyglos</td><td>609033</td><td>Détection d’endotoxines dosage</td></tr><tr><td>Eau ultra pure sans endotoxines</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TMS-011-A</td><td>Eau ultrapure pour la préparation de tampons sans endotoxines</td></tr><tr><td>EndoTrap rouge</td><td>Hyglos</td><td>321063</td><td>Résine d’élimination des endotoxines</td></tr><tr><td>FBS (inactivée par la chaleur)</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, sans calcium, sans magnésium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14175053</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Carl Roth</td><td>9105</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (haute qualité, testet d’endotoxine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>hTNF-alpha - OptEia ELISA Set</td><td>BD</td><td>555212</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropyl-&szlig ;-D-thiogalactopyranosid)</td><td>Carl Roth</td><td>CN08.1</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Merck</td><td>K 0282</td><td></td></tr><tr><td>LB-Medium</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides de E. coli O55 :B5</td><td>Merck</td><td>L6529</td><td></td></tr><tr><td>Pancoll, humain</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-60500</td><td>Solution de séparation (centrifugation par gradient de densité)</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine (10.000 U/mL)</td><td>Merck</td><td>A 2212</td><td></td></tr><tr><td>Phénylsépharose Haute Performance</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1082-01</td><td>Résine pour chromatographie d’interaction hydrophobe</td></tr><tr><td>Polymyxine B</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pmb</td><td></td></tr><tr><td>Comprimés inhibiteurs de protéase</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Q Sepharose Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td>Résine pour chromatographie échangeuse d’anions</td></tr><tr><td>Tampon RoboSep Stemcell</td><td></td><td>20104</td><td>Tampon de séparation cellulaire (section 5.1.4)</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Moyen</td><td>Merck</td><td>F 1215</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Carl Roth</td><td>P031.1</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Carl Roth</td><td>4855.3</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de zinc</td><td>Carl Roth</td><td>T887</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matériel de laboratoire</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,45 et micro ; Filtre à seringue Merck</td><td></td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>14 mL tubes à fond rond</td><td>BD</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>2 L Erlenmyer</td><td>Carl Roth</td><td>LY98.1</td><td></td></tr><tr><td>24 puits Plaques de suspension</td><td>Greiner</td><td>662102</td><td></td></tr><tr><td>5 L Bécher doseur</td><td>Carl Roth</td><td>CKN3.1</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes à centrifuger coniques</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes de centrifugation à grande vitesse</td><td>Eppendorf</td><td>3,01,22,178</td><td></td></tr><tr><td>Unité de filtration centrifuge Amicon Ultra-15 MWCO 3 kDa</td> Unité de filtration centrifuge <td>Merck</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 MWCO 50 kDa</td> Boîte de culture <td>Merck</td><td>UFC905024</td><td></td></tr><tr><td>(100 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>Fermetures de tubulure de dialyse</td><td>Spectrum</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>Aimant EasySep 'The Big Easy’Stemcell</td><td></td> <td>18001</td><td></td></tr><tr><td>Tubes collecteurs de fractions 5 mL</td><td>Greiner</td><td>115101</td><td></td></tr><tr><td>film Lumox, 25 & micro ; m, 305 mm x 40 m</td><td>Sarstedt</td><td>94,60,77,316</td><td>Film pour plaques de culture de monocytes</td></tr><tr><td>Spectra/Por Membrane de dialyse (3,5 kDa)</td><td>Spectrum</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>Unité de filtration Steritop</td><td>Merck</td><td>SCGPT01RE</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg ; C Incubateur (avec agitation)</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 42</td><td></td></tr><tr><td>&Auml ; Purificateur KTA UPC 10</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>System Collecteur de fractions</td><td>GE Healthcare</td><td>Frac-920</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse (avec rotor A-4-81)</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Rotor à angle fixe</td><td>Eppendorf</td><td>F-34-6-38</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>BioRad</td><td>1658000EDU</td><td></td></tr><tr><td>NanoPhotometer</td><td>Implen</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Brandelin</td><td>UW2070</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de fluorescence</td><td>Tecan</td><td>infinite M200PRO</td><td></td></tr><tr><td>pH-mètre</td><td>Knick</td><td>765</td><td></td></tr></tbody></table>

purification de l'homme s100a12 et de ses oligomères induits par les ions pour la stimulation cellulaire immunitaire

Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour purifier la protéine sététicire-contraignante humaine S100A12 et ses oligomères ion-induits de la culture d'Escherichia coli pour des stimulations de cellules immunitaires. Ce protocole est basé sur une stratégie de chromatographie en deux étapes, qui comprend la pré-purification des protéines sur une colonne de chromatographie d'échange d'anion et une étape de polissage ultérieure sur une colonne hydrophobe-interaction. Cette stratégie produit des protéines S100A12 d'une grande pureté et d'un rendement à des coûts gérables. Pour les essais fonctionnels sur les cellules immunitaires éventuelle contamination endotoxine résiduelle nécessite une surveillance attentive et d'autres étapes de nettoyage pour obtenir des protéines sans endotoxine. La majorité des contaminations à l'endotoxine peuvent être exclues par la chromatographie d'échange d'anions. Pour épuiser les contaminations résiduelles, ce protocole décrit une étape d'élimination avec des filtres centrifuges. Selon la résistance aux ions disponible S100A12 peut organiser en différents homomultimers. Pour étudier la relation entre la structure et la fonction, ce protocole décrit davantage le traitement ionique de la protéine S100A12 suivi d'un raccordement chimique pour stabiliser les oligomères S100A12 et leur séparation subséquente par exclusion de taille Chromatographie. Enfin, nous décrivons un essai cellulaire qui confirme l'activité biologique de la protéine purifiée et confirme la préparation Sans LPS.

Après la prépurification sur la colonne AIEX (figure 1A-C) et le HIC dépendant du calcium(figure 2A,B),des protéines hautement pures ont été obtenues (Figure 2C). En outre, les mesures de l'endotoxine ont indiqué l'enlèvement réussi de LPS. Le contenu LPS suivant AIEX a été mesuré dans une dilution 1:10 au-dessus de la limite de détection d'analyse, c'est-à-dire au-dessus de 500 EU/mL. Après la prem...

Ce protocole décrit une méthode de purification pour la protéine recombinante sans étiquette de liaison de calcium S100A12 et ses oligomères ion-induits pour des essais humains de stimulation de monocyte.

Purification de l'homme S100A12 et de ses oligomères induits par les ions pour la stimulation cellulaire immunitaire

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

Ce protocole décrit une procédure complète de purification de la protéine liant le calcium humain, S100A12, et en particulier, car ce sont différents oligomers induits par les ion pour les implications de recherche en aval. Avec cette technique, nous sommes en mesure de maintenir un rendement élevé de protéines très pures et sans endotoxine. La liaison croisée chimique et la séparation sur la colonne chromatographie d’exclusion de taille est une méthode convaincante pour produire des protéines homo-oligomériques pour d’autres analyses fonctionnelles.Notre technique nous permet de mécaniser les aspects de S100A12 en tant que ligand récepteur de reconnaissance de modèle et des informations d’art pour idéalement développer de nouvelles interventions ciblées et améliorer les tests diagnostiques. En plus de regarder cette vidéo, nous recommandons une lecture attentive du protocole, car nous décrivons une procédure complexe en plusieurs étapes. Pour commencer, couper un tube de dialyse dans une longueur appropriée, environ 30 centimètres, avec un espace supplémentaire pour l’air.Faire tremper la membrane dans de l’eau déionisée pendant 15 à 30 minutes pour enlever le glycérol. Pour réduire la viscosité de la solution protéique défrichée, diluer la solution avec 25 millilitres de tampon AIEX A.Attachez la première fermeture sur le tube. Chargez l’échantillon dans la membrane et fixez la deuxième fermeture à au moins un centimètre de l’extrémité supérieure du tube.Dans une pièce refroidie à quatre degrés Celsius, placer le récipient avec le tampon A de l’AIEX sur une plaque à remuer, ajouter une barre de remue-pièce et la membrane remplie de solution protéique. Réglez la vitesse pour faire pivoter l’échantillon de sorte qu’il n’y ait aucune interférence avec la barre de remue-remuer rotative. Dialyzez pendant 12 à 24 heures à quatre degrés Celsius, puis remplacez le tampon dialysé par le tampon A pré-refroidi gratuit et continuez pendant au moins quatre heures supplémentaires.Transférez la solution protéique dialysée du tube dans un tube de 50 millilitres à travers une unité de filtre de 0,45 micron. Démarrez le FPLC avec maintenance générale. Connectez les tampons de colonne AIEX A et AIEX B aux vannes tampons et à la résine d’échange d’anion contenant de la colonne aux ports de colonne du FPLC.Ajustez les paramètres chromatographiques généraux en conséquence. Démarrez le programme AIEX dans le logiciel FPLC et choisissez le volume d’équilibrage pour le tampon A.Par la suite, chargez l’échantillon sur la colonne et élisez les protéines avec un gradient linéaire de 0% à 100% tampon de sel élevé. Recueillir deux fractions millilitres pendant l’élitution.Analyser les fractions élucidées après avoir terminé la course. Pour cela, chargez 10 microlitres de chaque fraction sur une page Coomassie tachée de 15% SDS et identifiez les fractions contenant S100A12. Mettre en commun ces S100A12 contenant des fractions pour la dialyse en solution saline tamponnée tris.Pour poursuivre la purification des protéines, après la dialyse protéique, ajouter un chlorure de calcium à l’échantillon à une concentration finale de 25 millimolaires, ce qui facilitera la liaison de S100A12 à la résine dans la prochaine étape. Filtrez ensuite l’échantillon à travers un filtre d’une taille de coulée de 0,45 microns. Equilibrer les tampons et les échantillons hic à quatre degrés Celsius.Ensuite, connectez les tampons de colonne HIC A et B et la colonne au système et ajustez les paramètres. Commencez la méthode pour équilibrer la colonne avec un à deux volumes de colonne de HIC A tampon et chargez l’échantillon et le bloc d’échantillon non lié de lavage avec un signal UV atteint à nouveau le niveau de ligne de base. Puis commencer l’élitution avec un chélateur de calcium contenant tampon EDTA.Recueillir deux millilitres de fractions de pointe pendant l’élitution. Après avoir analysé 10 microlitres de chaque fraction sur une page Coomassie tachée de 15%SDS identifier les fractions pures S100A12. Mutualiser ces fractions et dialyser contre HBS.Tout d’abord, chargez 15 millilitres d’échantillon sur une unité de filtre centrifuge de 50 kilodaltons. Centrifugeuse à 3200 fois g à 10 degrés Celsius pendant environ 10 minutes. Transférer le débit filtré dans un récipient frais, sur la glace.Maintenant, utilisez un millilitre de HBS pour rincer la membrane du filtre et pour la dilution de la solution concentrée dans la pointe du filtre. Centrifugeuse à nouveau pour récupérer autant de protéines que possible dans le flow-through. Pour filtrer la solution, répétez la charge et la centrifugation de l’échantillon aussi souvent que nécessaire.Ensuite, pour concentrer le S100A12 contenant l’écoulement, chargez-le dans un filtre centrifuge de trois kilodaltons et centrifugeuse à 3200 fois g, 10 degrés Celsius pendant environ 30 minutes. Maintenant, le volume est réduit à 1/5 jusqu’à 1/10 du volume de chargement initial. Transférer la solution concentrée dans un nouveau tube.Répétez l’étape de concentration aussi souvent que nécessaire. Après la liaison chimique croisée, selon le manuscrit, effectuer la chromatographie d’exclusion de taille. Equilibrer la colonne dans HBS, charger l’échantillon, et recueillir des fractions de pointe d’un à deux millilitres pendant la course.Après avoir analysé ces fractions sur une page SDS de quatre à 20 %, mutualiser les fractions avec les principales bandes du complexe protéique désiré. Ensuite, concentrez les solutions comme cela a été fait précédemment. Pour isoler les monocytes des couches buffy humaines par centrifugation de gradient de densité, équilibrer d’abord la solution de séparation à la température ambiante.Transférer 20 millilitres dans des tubes centrifugeuses de 15 millilitres, deux tubes par pelage bouffi. Diluer le sang de la couche buffy humaine avec HBSS à un volume total de 60 millilitres et superposer 30 millilitres de ce mélange soigneusement sur le dessus du milieu de séparation. Centrifugeuse à 550 fois g pendant 35 minutes à température ambiante.Éteignez le frein de la centrifugeuse. Après centrifugation, les cellules sanguines périphériques mononucléaires sont situées directement au-dessus du milieu de séparation. À l’intérieur d’une pipette, transférer ces cellules dans un tube de centrifugeuse frais de 50 millilitres.Remplissez le tube de HBSS à 50 millilitres et centrifugeuse à 170 fois g pendant 10 minutes. Aspirer le supernatant et réutiliser la pastille cellulaire dans un petit volume de HBSS par pipetting. Ensuite, remplissez le tube jusqu’à 50 millilitres et centrifugeuse à 290 fois g pendant 10 minutes.Aspirez à nouveau le surnatant. Resuspendez les cellules en 50 millilitres de HBSS et centrifugeuse à 170 fois g pendant 10 minutes. Aspirez le supernatant et résuspendez la pastille cellulaire dans un petit volume d’un millilitre de tampon de séparation, comptez les cellules et ajoutez un tampon à une concentration de cinq fois 10 aux sept cellules par millilitre.Pour l’isolement des monocytes des cellules sanguines périphériques mononucléaires, utilisez un kit d’isolement cellulaire négatif magnétique et suivez le protocole du fabricant. Utilisez un compteur cellulaire automatisé pour compter les monocytes et résuspendez dans le milieu des monocytes à une concentration de deux fois 10 à six cellules par millilitre. Pour la culture des monocytes, placez un plat de culture cellulaire avec un film perméable au gaz hydrophobe adapté aux cellules de suspension.Placer les plaques sous la lumière UV pendant environ 30 minutes pour la stérilisation. Transférer 15 à 25 millilitres de suspension cellulaire dans ces plaques de culture et les laisser reposer toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après la pré-purification sur la colonne AIEX et le HIC dépendant du calcium, des protéines très pures ont été obtenues.En tant que contrôle supplémentaire, les monocytes humains ont été stimulés par le LPS et ont produit des protéines de type sauvage. L’exposition de protéine à différents ions a comme résultat l’arrangement de différents oligomers de S100A12. L’augmentation des concentrations de zinc induire l’arrangement de S100A12 dans les tétramers et les hexamers lors de la séparation sur quatre à 20%Coomassie taché SDS page.Quand un excès d’ions a été appliqué avant le croisement, il a induit un décalage prononcé de l’équilibre d’oligomer. S100A12 a été relié en présence de calcium de 25 millimlaires ou de calcium de 25 millimlaires et d’un zinc millimolaire. Après un croisement dans le tampon HBS avec du chlorure de calcium de 25 millimlaires et un chlorure de zinc millimolaire, l’hexamer et le tétramer ont été séparés.Le tétramer et le dimère ont été séparés dans le tampon HBS avec du chlorure de calcium de 25 millimlaires. Un exemple d’oligomers mis en commun et concentrés après séparation sur une page SDS tachée de coomassie de quatre à 15% montre le dimère, le tétramer et l’hexamer. La stimulation de monocyte avec le S100A12 hexaméricain a eu comme conséquence la libération alpha prononcée de TNF.Après l’élimination de l’endotoxine, il est important de ne pas réintroduire la contamination dans les échantillons lors de la génération suivante et de la purification des oligomers. L’analyse en aval de tout processus lié à l’oligomérisation S100A12 est concevable. De même, les acides aminés et les conditions ioniques qui affectent le processus d’oligomérisation lui-même peuvent être analysés.Nous utilisons actuellement des oligomers S100A12 séparés selon le protocole décrit pour développer des ligands et des anticorps spécifiques au peptide pour bloquer la signalisation de la protéine par tlf4 et pour développer et améliorer les tests diagnostiques.

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