Name: Génération de modifications génomiques définies à laide de CRISPR-CAS9 dans les cellules souches pluripotentes humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Découvrez une méthode CRISPR-Cas9 pour générer des modifications génomiques définies dans les cellules souches pluripotentes humaines. Cette technique permet de créer des lignées isogéniques avec des mutations hétérozygotes ou homozygotes spécifiques.

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Cette recherche a été financée par le National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), les National Institutes of Health par le biais de subventions U01HL099656 (P.G. et D.L.F.) et U01HL134696 (P.G. et D.L.F.).

1. Conception et construction de l'ARN de guide (gRNA)
REMARQUE: Chaque gRNA est composé de deux 60 paires de base (bp) oligonucléotides qui sont annealed pour générer un 100 bp double échoué (ds) oligonucléotide (Figure 1A-C). Le délai pour la conception, la génération et l'efficacité de coupe de test de gRNA est d'environ 2 semaines (figure 2).
<ol><li>Sélectionnez la région d'adn d'intérêt à modifier le génome et identifiez 3-4 23 bp séquences qui correspondent au format, 5'-G(N19)NGG-3'. Ces séquences devraient être situées à moins de 20 pb de la région d'intérêt. REMARQUE : Le ciblage peut être effectué sur le brin de sens ou d'anti-sens.</li>
	<li>Évaluer les séquences de gRNA pour la redondance génomique et la probabilité hors cible à l'aide d'une ressource comme CRISPOR (http://crispor.tefor.net).</li>
	<li>Incorporez la séquence cible de 20 pb (à l'exclusion du motif adjacent protospacer ou PAM) dans deux oligonucléotides de 60 mers comme indiqué (les séquences sont de 5' à 3' et les rouges et verts sont des compléments inverses comme indiqué dans la figure 1C).</li>
	<li>Commandez les deux oligonucléotides de 60 pb auprès du vendeur de choix. Une fois que les oligonucléotides sont reçus, resuspendre chacun à une concentration finale de 100 M en ddH2O. Faire un stock de travail de 10 'M.</li>
	<li>Anneal les deux oligonucléotides et de générer un fragment de 100 bp d'ADN à l'aide de polymérase d'ADN (Tableau des matériaux). Combiner 5 'L'oligonucléotide avant de 10 'M et 5 'L'oligonucléotide inverse de 10 'M dans un tube à bande de réaction en chaîne de polymérase (PCR) et incuber à 95 oC pendant 5 min. Refroidir la réaction pendant 10 min à température ambiante (RT).</li>
	<li>Configurez le PCR tel que décrit dans le tableau 1. Effectuer l'amplification du PCR dans un cycleur thermique en utilisant les paramètres décrits dans le tableau 2.</li>
	<li>Visualisez les produits PCR sur un bromure d'éhidium de 1,5 % (w/v) ethidium (EtBr) gel d'agarose électrophoré à 80-100 V pendant 40 min. Accise la bande de 100 pb (Figure 3A), visualisée sur une boîte lumineuse LED, à partir du gel à l'aide d'une lame de rasoir et purifie à l'aide d'un gel kitd'extraction( Tableau des Matériaux ).</li>
</ol>2. Conception des amorces de PCR pour le criblage
<ol><li>Effectuer le dépistage de l'ADN modifié à l'aide d'amorces PCR avant et inversées qui sont spécifiquement conçues pour amplifier une région de 400-500 pb du gène d'intérêt (tableau 2). Utilisez l'ADN isolé de toute ligne iPSC de contrôle pour confirmer un amplicon propre lors de l'exécution du PCR de criblage.</li>
	<li>Visualisez les produits PCR sur un gel de 1,5 % (w/v) après électrophoresis à 80-100 V pour 1 h. REMARQUE : Le séquençage des clones modifiés est effectué à l'aide d'une amorce nichée qui est conçue après confirmation de l'ensemble d'amorces de criblage. Les échantillons sont envoyés à une source commerciale pour le séquençage.</li>
</ol>3. Préparation du plasmide vectoriel gRNA-cloning
<ol><li>Pour linéariser le vecteur de clonage, prenez un tube centrifugeur de 1,5 ml et ajoutez 1 à 5 g d'ADN du vecteur de clonage gRNA avec 4 l de l'enzymede restriction Afl II et 1,5 l d'enzyme de restriction AflII. Apportez la réaction à 24 'L de ddH2O. Mélanger la réaction en pipetting de haut en bas. Incuber à 37 oC pendant la nuit (O/N).</li>
	<li>Electrophorese sur un gel agarose de 1% à 80-100 V pour 1 h et bandes d'accise (la taille prévue de la bande est de 3519 pb).</li>
	<li>Extraire et purifier comme dans l'étape 1.6.</li>
</ol>4. Assemblage du vecteur gRNA
<ol><li>Configurez les réactions et assemblez des fragments d'ADN à l'aide du kit d'assemblage (Tableau des matériaux) à 1:5 ratios de vecteur de clonage digéré aflII à 100 bp gel purifié insert, tel que décrit dans le tableau 3.</li>
	<li>Incuber la réaction à 50 oC pendant 15 min. Diluer la réaction 1:3 en ddH2O et utiliser 3 l pour la transformation bactérienne, selon les instructions du fabricant (Tableau des matériaux). Cellules de plaque sur des plaques de kanamycine LB/agar.</li>
	<li>Choisissez 3-5 colonies par gRNA. Inoculer chaque colonie dans 4 ml de LB et faire pousser O/N à 37 oC dans un incubateur orbital.</li>
	<li>Purifez l'ADN plasmide à l'aide d'un kit d'isolement plasmide miniprep, et séquencez chaque gRNA à l'aide des amorces suivantes pour assurer le succès du clonage : Vers l'avant : GTACAAAAAAAGCAGGCTTTAAAGG; Inverse: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.</li>
</ol>5. Testez l'efficacité de coupe de gRNA
<ol><li>Plaques hESCs sur les fibroblastes embryonnaires murines irradiés (MEFs) dans une plaque de 6 puits, comme précédemment décrit21. Lorsque les cellules atteignent 70-80% de confluence, préparer le mélange maître de transfection décrit dans le tableau 4.</li>
	<li>Mélanger par pipetting et incuber à RT pendant 15 min. Ajouter les cellules dans le sens goutte à goutte et incuber à 37 oC pendant 48 h (avec un changement de support après 24 h).</li>
	<li>Récolter les cellules pour le tri après 48 h.<ol>
<li>Retirez les MEF enzymatiquement (Table of Materials) avec une incubation de 3 min RT.</li>
		<li>Rincer les cellules 1x avec le milieu hESC (tableau 5) et gratter dans le milieu hESC - 10 M Y-27632 dihydrochlorure ( Tableaudes matériaux).</li>
		<li>Pellet cellules à 300 x g pendant 3 min et resuspendre dans 0,5 mL de milieu hESC - 10 M Y-27632 dihydrochlorure.</li>
		<li>Filtrer dans un tube de 5 ml à l'autre à l'intermédiaire d'un bouchon de 35 m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>À l'aide du tri des cellules activées par la fluorescence (FACS), porte sur les cellules vivantes et triez les cellules positives de la protéine fluorescente verte (GFP).</li>
	<li>Transférer un maximum de 1,5 x 104 cellules triées directement dans un plat de 10 cm2 recouvert de matrice membranaire de 1:3 sous-sol (Tableau des matériaux) et des MEF irradiés dans le milieu hESC (tableau 5) contenant du dihydrochlorure Y-27632.</li>
	<li>Changer de milieu quotidien à l'aide du milieu hESC (tableau 5) sans dihydrochlorure Y-27632 et cueillir manuellement les clones après 10-15 jours, lorsque les colonies mesurent 1 mm de diamètre.<ol>
<li>À l'aide d'une pipette et d'un microscope P200, gratter soigneusement un seul clone et attirer les cellules dans la pipette.</li>
		<li>Disperser les cellules en tapotage doucement 3-4x dans une plaque de puits 96 dans le milieu établi avec la colonie.</li>
		<li>Distribuer dans des tubes à bande PCR pour le criblage et granuléles les cellules par centrifugation à 10 000 x g pendant 5 min. Choisissez 20 colonies par gRNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Dépistage des clones
<ol><li>Isoler l'ADN en couvant des granulés de cellules dans 20 l de tampon de protéase K (tableau 5) (1 h à 55 oC et 10 min à 95 oC) et le vortex vigoureusement. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 5 min et collecte le supernatant.</li>
	<li>Effectuer le criblage PCR (section 2) dans un volume total de 20 L utilisant un mélange principal comprenant des amorces conçues pour amplifier la région d'intérêt et 5 l de la digeste de protéase K. Utilisez l'ADN génomique isolé de la lignée cellulaire qui a été modifiée par gène comme un contrôle.</li>
	<li>Évaluer les changements de taille des produits PCR après 1 h d'électrophoresis à 70-90 V sur un gel agarose de 2,5 % (w/v)(figure 3B,C). Toute différence de taille est indicative du clivage.</li>
</ol>7. Modification précise du génome dans les cellules souches pluripotentes à l'aide de l'ADN oligo à brin unique (ssODNs)
<ol><li>Conception 100 bp ssODNs centré autour de la séquence gRNA la plus efficace déterminée à avoir la meilleure efficacité de coupe.</li>
	<li>Empêcher le re-clivage de l'ODN recombiné en introduisant des mutations silencieuses dans la séquence de gRNA. Une seule mutation silencieuse dans la séquence PAM est suffisante, mais si ce n'est pas possible, 3-4 mutations silencieuses fonctionneront. REMARQUE : Pour faciliter le criblage des clones ciblés, l'introduction d'un site de restriction dans un rayon de 20 bp de la séquence de gRNA est idéale.</li>
	<li>Concevoir un ODN avec le changement de base souhaité (s) pour créer la mutation de l'intérêt et un ODN sans le changement de base.s). REMARQUE : Ces changements ne devraient pas dépasser 20 pb par rapport au site de coupe CRISPR/CAS9 prévu, car la recombinaison diminue considérablement à de plus grandes distances.</li>
	<li>Commandez les deux ssODN du vendeur de choix et suspendez-les dans l'eau pour faire 1 stock de g/L. Stockez les stocks à -20 oC.</li>
</ol>8. Configuration de la transfection
<ol><li>Pour transfect le ssODN et les plasmides CRISPR-CAS9, plaquez la ligne cellulaire cible dans un plat de 6 puits sur des MEF irradiés pour atteindre 70-80% de confluence après une incubation O/N.</li>
	<li>Configurez la réaction de transfection décrite dans le tableau 6. Mélanger la réaction par pipetting et incuber pendant 15 min à RT. Ajouter le mélange de réaction de transfection goutte à goutte aux cellules.</li>
	<li>Après 48 h, préparer les cellules pour le tri cellulaire tel que décrit dans la section 5.3.</li>
	<li>Choisissez les colonies 10 jours après le placage des cellules individuelles à l'aide d'une pipette de 200 l. Transférer 100 l de cellules dans un puits d'une plaque de puits de 24 ou 48 précédemment recouverte de gélatine et de MEF irradiés dans le milieu hESC avec du dihydrochlorure Y-27632. Utiliser les 100 l restants pour l'isolement de l'ADN tel que décrit à la section 6.</li>
</ol>9. Vérification des mutations dans les colonies individuelles
<ol><li>Pour vérifier la réussite de l'intégration du ssODN, prenez 5 L d'ADN isolés de chaque colonie pour effectuer le PCR à l'aide des amorces de criblage conçues à la section 2. Purifier les produits PCR (Table of Materials) et préparer la digestion enzymatique de restriction en utilisant le site enzymatique unique créé dans le ssODN. REMARQUE : Cette digestion inclut également le tampon d'enzyme de restriction et la concentration recommandée du fabricant de l'enzyme de restriction dans un volume de 40 l.</li>
	<li>Mélanger la réaction en pipetilage et incuber à la température recommandée par le fabricant pendant 1-3 h.</li>
	<li>Visualisez les produits PCR digérés sur un gel d'agarose EtBr électrophoresed à 80-100 V pendant 40 min. Si l'intégration réussie du ssODN s'est produite, séquencez des mutations spécifiques à l'aide d'une amorce nicheuse.</li>
</ol>

<ol><li>Srivastava, D., Dewitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+In+Vivo+Cellular+Reprogramming%3A+The+Next+Generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation.</a> Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Review Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
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<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li>
<li>Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Genome editing in human stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).</li>
<li>Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li>
<li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).</li>
<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+homology+directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li>
<li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64(2019).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Dans ce protocole, l'utilisation de CRISPR-CAS9 ainsi que de deux modèles de réparation ssODN pour générer des changements spécifiques du génome hétérozygote ou homozygotes est démontrée dans les cellules souches pluripotentes humaines. Cette méthode a eu comme conséquence la génération réussie des lignées cellulaires isogéniques exprimant des changements génomiques hétérozygotes avec une efficacité proche de 10%. Ce protocole a été optimisé pour les ESC humains et les iPSC cultivés sur des MEF irradiés qui soutiennent l...

Les cellules souches embryonnaires humaines (HESC) et les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont des outils précieux pour modéliser les maladies humaines en raison de leur capacité de renouvellement, tout en maintenant la capacité de générer des types cellulaires de lignées différentes1,2 ,3,4. Ces modèles ouvrent la possibilité d'interroger la fonction génique, et de comprendre comment des mutations spécifiques et des phénotypes sont liés à diverses maladies5,6. Cependant, pour comprendre comment une altération spécifique est liée à un phénotype particulier, l'utilisation d'un contrôle isogénique jumelé et des lignées cellulaires mutantes est important pour contrôler la variabilité ligne à ligne7,8. Des nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALENs) et des nucléases de doigts de zinc ont été utilisées pour générer des mutations d'insertion ou de suppression (indels) dans divers modèles génétiques, y compris les cellules primaires; mais ces nucléases peuvent être encombrantes à utiliser et coûteux9,10,11,12,13,14. La découverte de la nucléase palindromic (CRISPR)-CAS9, régulièrement en chevêp, a révolutionné le domaine en raison de l'efficacité de la formation d'indélétaux dans pratiquement n'importe quelle région du génome, de la simplicité d'utilisation et de la réduction du coût15 , 16 Annonces , 17 Annonces , 18 ans, états-unis qui , 19.
Un défi dans l'utilisation de la technologie d'édition du génome basée sur CRISPR-CAS9 a été la génération ou la correction de mutations spécifiques dans un allèle sans créer une mutation indel dans le deuxième allèle20. L'objectif principal de ce protocole est de surmonter ce défi en utilisant deux modèles de réparation d'oligonucléotide à brin unique (ssODN) pour réduire la formation d'indel dans le deuxième allèle. Les deux ssODN sont conçus pour contenir des mutations silencieuses pour empêcher le re-découpage par la nucléase CAS9, mais un seul contient la modification de l'intérêt. Cette méthode augmente l'efficacité de générer une modification génétique hétérozygote spécifique sans induire la formation d'indélétaux dans le deuxième allèle. À l'aide de ce protocole, des expériences d'édition de gènes dans six endroits génomiques indépendants démontrent l'introduction précise du changement génomique souhaité dans un allèle sans indel dans le deuxième allèle et se produit avec une efficacité globale de 10 %. Le protocole décrit a été adapté de Maguire et coll.21.

<table><tbody><tr><td>Tube à fond rond en polystyrène de 5 ml avec capuchon de filtre cellulaire</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture tissulaire en polystyrène à 6 puits</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>AflII endonucléase</td><td>New England Biolabs</td><td>R0520</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>N605</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 moyen</td><td>ThermoFisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Roche</td><td>11969064001</td><td></td></tr><tr>Appareil <td></td><td></td><td></td>de<td>tri de cellules activées par fluorescence (FACS)</td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Kit d’assemblage</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611</td><td></td></tr><tr><td>gRNA_Cloning Vector</td><td>Addgene</td><td>41824</td><td></td></tr><tr><td>LB Plaques de gélose contenant 50 &mu ; g/ml de kanamycine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réactif de tige de lipofectamine</td><td>ThermoFisher</td><td>(STEM00001)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel à facteur de croissance réduit (DFG)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastes embryonnaires murins (MEF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extraction de gel de nucléospine et kit de nettoyage par PCR</td> Incubateur à <td></td> agitation orbitale <td>Macherey-Nagel</td> 740609 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vecteur pCas9_GFP</td><td>Addgene</td><td>44719</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de bandelettes PCR</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Haute Fidélité ADN Polymérase et 5&times ; Tampon Phusion</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>PurelinkTM Kit de minipréparation rapide de plasmide</td><td>Invitrogen</td><td>K210011</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>Qiagen 19133</td><td></td></tr><tr><td>StellarTM Cellules Escherichia coli électrocompétentes</td><td>TakaraTM</td><td></td> Milieu 636763 <td></td></tr><tr><td>SOC</td><td>New England Biolabs</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme express TrypLE</td><td>ThermoFisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorhydrate de Y-27632/inhibiteur de ROCK (ROCKi)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de modifications génomiques définies à l'aide de crispr-cas9 dans les cellules souches pluripotentes humaines

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Les cellules souches pluripotentes humaines offrent un système puissant pour étudier la fonction génique et modéliser des mutations spécifiques pertinentes à la maladie. La génération de modifications génétiques hétérozygotes précises est difficile en raison de la formation d'indéléves médiées par CRISPR-CAS9 dans le deuxième allèle. Ici, nous démontrons un protocole pour aider à surmonter cette difficulté en utilisant deux modèles de réparation dans lesquels un seul exprime le changement de séquence souhaité, tandis que les deux modèles contiennent des mutations silencieuses pour empêcher la re-coupe et la formation d'indel. Cette méthodologie est plus avantageuse pour l'édition de gènes codant les régions de l'ADN pour générer le contrôle isogénique et les lignées de cellules souches humaines mutantes pour étudier la maladie humaine et la biologie. En outre, l'optimisation des méthodologies de transfection et de dépistage a été réalisée pour réduire le travail et le coût d'une expérience d'édition de gènes. Dans l'ensemble, ce protocole est largement applicable à de nombreux projets d'édition du génome utilisant le modèle de cellules souches pluripotentes humaines.

Génération de gARN et dépistage des indels
Chaque gRNA sera cloné dans un vecteur plasmide et exprimé à l'aide du promoteur U6. L'enzyme de restriction AflII est utilisée pour linéariser le plasmide (addgene #41824) et est située après le promoteur U6. La bande de 100 pb générée après l'annexion des deux oligos de 60 pb est clonée dans le vecteur d'expression gRNA à l'aide de l'assemblage de l'ADN. Une fois que les plasmides gRNA sont générés, ils sont transfectés en ...

Ce protocole fournit une méthode pour faciliter la génération de changements définis de nucléotide hétérozygote ou homozygote à l'aide de CRISPR-CAS9 dans les cellules souches pluripotentes humaines.

Génération de modifications génomiques définies à l'aide de CRISPR-CAS9 dans les cellules souches pluripotentes humaines

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

L’étude de la fonction génique et de la maladie est entravée par la nature de la population humaine. Les différents antécédents génétiques des lignées cellulaires iPS spécifiques au patient et de contrôle peuvent affecter l’efficacité de différenciation et les phénotypes trouvés dans un essai fonctionnel donné. L’utilisation de lignées génétiquement identiques ou isogéniques où la seule différence est la mutation particulière de l’intérêt est essentielle pour surmonter ces problèmes.De nombreuses maladies humaines sont causées par des mutations hétérozygotes, qui peuvent être difficiles à générer avec le système CRISPR-Cas9. Ceci est dû à la génération de mutations indélébiles dans l’allèle non ciblé qui peuvent se produire à très haute fréquence. Notre technique surmonte ce problème en utilisant deux modèles de réparation dont un seul abrite la mutation d’intérêt.Tout chercheur qui essaie cette technique devrait être habile dans la culture des cellules souches pluripotentes humaines. La démonstration vidéo de la cueillette des colonies sera utile pour montrer la taille et la morphologie correctes ainsi que la technique utilisée pour la cueillette et le dépistage. La démonstration de cette procédure sera Leo Cardenas.Pour commencer, plaquez les ESC humains sur les CEM irradiés dans une plaque de 6 puits. Préparer le mélange maître transfection. Mélanger au pipetage et incuber à température ambiante pendant 15 minutes.Lorsque les cellules atteignent 70 à 80%confluency, puis, ajouter le mélange maître transfection laisser tomber sage à chaque puits avec des cellules et incuber à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Changez les médias toutes les 24 heures. Pour récolter les cellules, d’abord, incuber les cellules avec Triple E pendant trois minutes à température ambiante pour enlever les MEF enzymatiquement.Ajouter 0,5 millilitres de milieu HESC avec un inhibiteur rock de 10 micromolaires. Cellules de granulés à 300 fois g pendant trois minutes et re-suspendre dans 0.5 millilitres de milieu humain d’ESC avec l’inhibiteur de ROCHE de 10 micromolar. Filtrer la suspension cellulaire dans un tube de cinq millilitres à travers un bouchon de passoire cellulaire de 35 microns.À l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence, portez les cellules vivantes et triez les cellules fluorescentes vertes positives aux protéines. Ensuite, transférez un maximum de 1,5 fois 10 aux quatre cellules triées directement dans un plat de 10 centimètres recouvert d’une à trois matrices membranaires du sous-sol et de MEFs irradiés et d’un milieu ESC humain contenant un inhibiteur rock. Changer de milieu tous les jours à l’aide du milieu esc humain sans inhibiteur ROCK.Après 10 à 15 jours, les colonies mesurent environ un à deux millimètres de diamètre. Au microscope, utilisez une pipette P200 pour gratter soigneusement un seul clone et attirer les cellules dans la pipette. Dispersez les cellules dans un puits d’une plaque de 96 puits en pipetting doucement trois à quatre fois dans le milieu établi avec la colonie.Ensuite, choisissez 20 colonies pour chaque ARN guide et distribuez-les dans des tubes à bande PCR pour le criblage. Pelleter les cellules par centrifugation à 10 000 fois G pendant cinq minutes. Maintenant, incuber des granulés cellulaires dans 20 microlitres de Proteinase K tampon pour isoler l’ADN et le vortex vigoureusement.Centrifugeuse à 10 000 fois G pendant 5 minutes. Ensuite, effectuez le criblage pcr de l’ADN édité. Ajouter dans les tubes 20 microlitres d’un mix master, y compris les amorces avant et arrière, conçues pour amplifier la région d’intérêt, ainsi que cinq microlitres du digest Proteinase K.Utilisez de l’ADN génomique isolé de la ligne iPSC de contrôle pour confirmer un amplicon propre lors de l’exécution du pcr de criblage. Évaluer les changements de taille des produits PCR après une heure d’électrophorèse à 70 à 90 volts sur un poids de 2,5% par gel d’agarose en volume. Toute différence de taille est révélatrice d’un clivage.Pour transfecter l’ADN oligo à brin unique et les plasmides CRISPR-Cas9, plaquez la lignée cellulaire cible dans un plat de 6 puits sur les CEM irradiés pour atteindre 70 à 80% de confluence après une incubation d’une nuit. Configurer la réaction de transfection telle que décrite. Mélanger la réaction par pipetting et incuber pendant 15 minutes à température ambiante.Ensuite, ajouter le mélange de réaction de transfection goutte sage pour les cellules. Après 48 heures, préparer les cellules pour le tri cellulaire comme précédemment. Environ 10 jours après le placage des cellules simples, utilisez une pipette de 200 microlitres pour ramasser des colonies dans des tubes à bandes PCR et dans un puits d’une plaque de 12 puits pré-enduite de gélatine et de MEFs.Transférer 100 microlitres des cellules à chaque puits d’une plaque de 24 ou 48 puits, préalablement recouverte de gélatine et de MEFs irradiés dans le milieu esc humain avec inhibiteur de ROCK. Utilisez les 100 microlitres restants pour l’isolement de l’ADN. Pour vérifier l’intégration réussie de l’ADN oligo à brin unique, prenez cinq microlitres d’ADN isolés de chaque colonie pour effectuer la PCR à l’aide des amorces de criblage précédemment conçues.Purifier les produits PCR et préparer les 40 microlitres de digestion des enzymes de restriction en utilisant le site enzymatique unique créé dans l’ADN oligo brin unique. Mélanger la réaction par pipetting et incuber à la température recommandée par le fabricant pendant une à trois heures. Ensuite, visualisez les produits PCR digérés ajoutés avec un colorant de chargement sur un poids de 1,5% par gel d’agarose de bromure d’éthidium de volume, électrophorese à 80 à 100 volts pendant 40 minutes.Si l’intégration réussie de l’ADN oligo à brin unique s’est produite, séquencez des mutations spécifiques à l’aide d’une amorce imbriquée. Dans cette étude, pour la construction d’ARN de guide, une bande de paire de base de 100 a été excisée d’un gel d’agarose de 1,5%. Après transfection cellulaire, la validation de la coupe de l’ARN guide a été visualisée à l’aide d’un gel agarose de 2,5 %.Un produit PCR de 180 paires de base a montré un contrôle non coupé et différents clones avec des décalages de bande indiquant la formation indélébile. Différents ARN de guide ont eu différentes efficacités de coupe. Pour éviter que CRISPR-Cas9 ne recoupe les allèles édités, la séquence PAM a été modifiée à l’aide d’une mutation silencieuse de G à A.Une mutation silencieuse dans la séquence PAM a généré un site de restriction unique, qui aide à l’écran pour une intégration réussie dans un ou deux allèles. Les lignées de cellules souches éditées par génome peuvent être utilisées dans les différenciations en aval et les analyses fonctionnelles pour étudier l’effet d’une mutation donnée sur le développement humain et la maladie. Cette méthodologie permet la génération de lignées cellulaires isogéniques avec des mutations spécifiques hétérozygotes ou homozygotes, impliquées dans une grande variété de maladies humaines.Ces modèles de maladies ouvrent la voie au développement de nouvelles thérapies cellulaires et offrent des plateformes de découverte de médicaments.

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Décrite ici, c’est un protocole pour le marquage de façon endogène des protéines avec des étiquettes fluorescentes dans les cellules souches humaines pluripotentes induites à l’aide de CRISPR/Cas9 exprimées. Cellules putativement édités sont enrichis en triant les cellules fluorescence activé et lignées clonales sont générées.

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Ici, nous décrivons une méthode détaillée d’édition de gènes transparente dans des cellules souches pluripotentes humaines en utilisant un plasmide donneur à base de piggyBac et le mutant Cas9 nickase. Deux mutations ponctuelles ont été introduites dans l’exon 8 du locus du facteur nucléaire 4 alpha des hépatocytes (HNF4α) dans les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh).

Introduction de mutations ponctuelles dans des cellules souches pluripotentes humaines à l’aide d’une édition transparente du génome

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Édition de l’épigénome CRISPR dans des cellules humaines à l’aide de la transfection de l’ADN plasmidique et de la nucléofection de l’ARNm

Découvrez une méthode CRISPR-Cas9 pour générer des modifications génomiques définies dans les cellules souches pluripotentes humaines. Cette technique permet de créer des lignées isogéniques avec des mutations hétérozygotes ou homozygotes spécifiques.

Génération de modifications génomiques définies à l'aide de CRISPR-CAS9 dans les cellules souches pluripotentes humaines

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