Micro-fragmentation humaine des tissus adipeux pour le phénotypage cellulaire et la caractérisation du secretome

En utilisant ce système, nous pouvons recueillir les grappes sous-millimétriques de tissu adipeux humain, dans lequel l’ensemble du microenvironnement des cellules régénératrices est intact. L’ensemble du système microvasculaire est également intact, et nous pouvons donc utiliser ce genre de micro-organes pour la transplantation in vivo pour la culture in vitro et pour l’isolement cellulaire pour une caractérisation plus complète. La principale raison d’être de l’utilisation du système dans le laboratoire de recherche est que le processus est totalement sans enzymes, et donc il permet le traitement rapide et efficace des tissus adipeux humains tout en maintenant une micro-architecture et ce sera la microvasculature du tissu totalement intacte.

Et donc nous pouvons étudier directement un produit de thérapie cellulaire qui s’est avéré déjà très utile dans la clinique. Cette technologie système fermé est une technique facile à utiliser pour la récolte, le traitement et la réin injection de tissu adipeux raffiné intra-opératoire, et peut être appliquée avec succès dans les cosmétiques orthopédiques, proctologie et aussi gynécologie. Cette méthode permet une étude plus approfondie de l’impact de la graisse dans la régénération des tissus.

La procédure sera démontrée par Bianca Vezzani, boursier postdoctoral et par Mario Gomez-Salazar, qui est doctorant. En travaillant dans des conditions aseptiques dans les 16 heures suivant la récolte, placez l’échantillon d’abdominoplastie sur un tissu chirurgical avec la peau orientée vers le haut. Utilisez une canule d’infiltration de tissu jetable pour injecter 50 à 100 millilitres de 37 degrés Celsius 0,9% solution de chlorure de sodium dans le tissu adipeux sous-cutané.

Connectez une seringue de verrouillage Luer de 10 millilitres à une canule de liposuccion jetable et saisissez l’échantillon dans la région cutanée près d’un bord de l’échantillon, introduisez soigneusement la canule dans le tissu adipeux. Une fois que la canule est à l’intérieur du tissu, extraire le piston et déplacer la canule radialement dans l’échantillon de tissu adipeux. Il est important de manipuler le tissu adipeux fermement pendant la lipo-aspiration.

Si pas assez de graisse est recueillie, envisager d’effectuer une injection saline supplémentaire. Lorsque la seringue est pleine de lipo-aspirate, retirez soigneusement la canule du tissu et remplacez la seringue complète par une nouvelle seringue vide jusqu’à ce qu’un total de 60 millilitres d’aspirate ait été récolté. Pour la micro-fragmentation du lipo-aspirate, retirez l’appareil de l’emballage et vérifiez que l’unité principale est connectée au sac à déchets.

Placez le sac de collecte des déchets sur le sol et assurez-vous que les vannes sont fixées aux bouchons de l’unité de traitement. Percer le port de raccordement du sac pour connecter la pointe terminale de la ligne d’entrée dans le sac salin et positionner le sac salin plus haut que l’unité de traitement. Vérifiez que les cinq pinces reliées aux tubes des circuits sont ouvertes, placez l’unité de traitement en position verticale, permettez à la solution saline de remplir l’unité de traitement et confirmez que le flux atteint le sac à déchets.

Secouez l’unité de traitement pour enlever les bulles d’air et placez l’appareil en position verticale avec le bouchon bleu orienté vers le haut. Fermez la pince à côté de la ligne d’entrée et connectez une seringue de lipo-aspirate à la valve auto-occluding du bouchon d’entrée bleu pour commencer à injecter le lipo-aspirate. En gardant l’unité de traitement verticale, poussez lentement vers le bas sur le piston de seringue jusqu’à ce que tout le lipo-aspirate ait été transféré à l’unité.

Lorsque tout le lipo-aspirate a été injecté, ouvrez la pince d’entrée pour restaurer le flux salin et secouez vigoureusement l’unité de traitement pendant au moins deux minutes, en vérifiant régulièrement le flux de solution saline dans le sac à déchets. Lorsque la solution saline de l’unité de traitement devient transparente, placez l’appareil avec le capuchon gris vers le haut et fermez les pinces situées sur le drain près des bouchons bleus et gris. Le tissu traité flottera au sommet.

Ensuite, remplissez une seringue de verrouillage Luer de 10 millilitres avec une solution saline et connectez la seringue à la vanne de chargement du bouchon bleu. Connectez une seringue vide de verrouillage Luer de 10 millilitres avec le piston complètement inséré à la valve du capuchon gris. Injectez fermement la solution saline dans l’unité de traitement à partir du bouchon bleu, en vérifiant que la seringue reliée à la valve grise est donc remplie de tissu traité.

Lorsque toute la solution saline a été injectée, retirez soigneusement les deux seringues et répétez l’infusion saline jusqu’à ce que tous les tissus traités aient été prélevés. À la fin du traitement, retirez toutes les seringues, fermez toutes les pinces, détachez le sac salin et jetez l’appareil selon les protocoles locaux. Lorsque tous les tissus traités ont été recueillis, transférer le tissu adipeux micro-fragmenté dans un récipient stérile, et ajouter un volume égal de milieu de digestion au récipient.

Placer le récipient scellé dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius, réglé à 120 rotations par minute pendant 45 minutes, en arrêtant la digestion avec un volume égal de solution de blocage à la fin de l’incubation. Filtrer séquentiellement l’échantillon, d’abord à travers une passoire à cellules de 100 micromètres suivie d’une filtration à travers une passoire à cellules de 70 micromètres et centrifugeuse de la suspension filtrée pendant cinq minutes à 200 fois g. Nous suspendons la pastille dans environ 5 millilitres de tampon de lyse érythrocyte pendant 15 minutes à température ambiante.

Arrêtez la lyse avec un volume égal de solution de blocage et filtrez la solution à travers une passoire à cellules de 40 micromètres. Ensuite, recueillir les cellules tissulaires adipeuses micro-fragmentées par centrifugation et nous suspendons la pastille dans la solution de blocage frais avec floure-mélange pour le comptage. Après la dissociation et la coloration des anticorps, les cellules adipeuses micro fragmentées peuvent être transportées au cytomètre d’écoulement pour analyse cellulaire et/ou tri.

La dissociation mécanique des lipo-aspirates manuels entraîne la production de tissu adipeux micro-fragmenté qui se compose d’un agrégat d’adipocytes enveloppant un réseau microvasculaire. L’analyse d’immunofluorescence de la gélatine incorporée dans le tissu adipeux micro-fragmenté cryofixed accentue la structure, montrant le réseau vasculaire marqué par le marqueur cellulaire endothélial Ulex Europaeus Agglutinin 1 récepteur et se composant principalement de petits vaisseaux capillaires-comme. Notamment, les péricytes exprimant l’antigène neuronal-glial 2 ou la bêta de récepteur de facteur de croissance plaquettète-dérivé sont normalement distribués, ensheathing cellules endothéliales.

En excluant les cellules hématopoïétiques positives CD31 et CD45 positives, la présence de péricytes négatifs CD34 positifs CD34 et de cellules adventitielles négatives et CD34 positives CD144 peut être identifiée dans le MAT. La lipo-aspiration manuelle est une partie critique de la procédure et doit être effectuée dans des conditions stériles au plus 16 heures après l’abdominoplastie. Le tissu adipeux micro fragmenté peut être davantage traité par coloration immunohistochimique, culture in vitro ou analyse sécrétome pour obtenir un aperçu plus approfondi de la biologie des tissus adipeux.

Cette technique permet d’étudier divers tissus dans leur arrangement naturel, indigène et tridimensionnel comme une sorte de petits organoïdes, qui sont assez petits pour être transplantés chez la souris ou pour être maintenus dans la culture à long terme. Et nous utilisons ce système principalement pour approcher expérimentalement les différents microenvironnements spécifiques aux organes. Nos donneurs de tissus adipeux ne sont pas connus comme porteurs d’infections transmissibles.

Toutefois, en l’absence de tout autre dépistage, tous les tissus humains devraient être considérés comme potentiellement contaminés et manipulés en conséquence.