Caractérisation des vésicules extracellulaires dérivées d’une cellule immunitaire et étude de l’impact fonctionnel sur l’environnement cellulaire
2 juin 2020
Le présent rapport souligne les exigences chronologiques pour l’isolement extracellulaire de vésicule (EV) des microglies ou des macrophages de sang. Les véhicules électriques dérivés de microglies ont été évalués en tant que régulateurs de la excroissance neurite tandis que les véhicules électriques dérivés du macrophage sanguin ont été étudiés dans le contrôle de l’invasion de cellules de glioma C6 dans les essais in vitro. L’objectif est de mieux comprendre ces fonctions EV en tant que médiateurs immunitaires dans des
Ce protocole permet de garantir un bon isolement des vésicules extracellulaires et la notification d’un plus grand nombre de protéines EBDF. Par rapport à d’autres techniques d’isolement, celui-ci soutient qu’il s’agit de plus d’intégrité et d’activités verticales. Les VE sont de plus en plus étudiés en LC ainsi que dans des conditions pathologiques.
Cette méthode peut être appliquée à tous les systèmes que nous choisissons de caractériser et d’étudier les VE. Pour ce contenu ou l’éthique biologique une attention particulière est nécessaire lors de l’itération des VE, comme dans la culture se traduit par les expériences suivantes. Une démonstration visuelle est essentielle pour accueillir des équipements spécifiques tels qu’une colonne de chromatographie d’exclusion de taille maison ainsi que la participation du compteur de nanoparticules et du spectromètre de masse.
Antonella Raffo-Romero, du laboratoire, aidera à démontrer la procédure. Commencez par pré-isoler les vésicules extracellulaires, ou VE, à partir du milieu de l’état. Transférez la condition au milieu de culture des cultures de microglies ou de macrophages dans un tube conique et centrifugez-la à 1200 fois G pendant 10 minutes pour pelleter les cellules.
Transférer le supernatant dans un nouveau tube conique et une centrifugeuse pendant encore 20 minutes pour éliminer les corps apoptotiques. Transférer ensuite le supernatant dans un tube en polycarbonate de 10,4 millilitres. Placez le tube dans un rotor TI 70,1 et une centrifugeuse ultra à 100 000 fois G pendant 90 minutes à quatre degrés Celsius pour pelleter les VE.
Après centrifugation, jeter le supernatant et réutiliser la pastille en 200 microlitres de 0,2 micromètre filtré PBS. Pour isoler les VE, préparez une colonne chromatographie d’exclusion de taille maison en lavant et stérilisant une colonne de chromatographie en verre, et en plaçant un filtre de 60 microlitres au fond. Empilez la colonne avec la matrice de base de filtration de gel d’agarose croisée pour créer une phase stationnaire de 0,6 centimètre de diamètre et de 20 centimètres de hauteur.
Rincez ensuite la phase avec 50 millilitres de 0,2 micromètre filtré PBS. Si nécessaire, conservez la colonne à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Placez la pastille EV résuspendue sur la phase stationnaire et recueillez 20 fractions séquentielles de 250 microlitres tout en continuant à ajouter du PBS au sommet de la phase stationnaire.
Les fractions peuvent être stockées à moins 20 degrés Celsius. Pour effectuer une analyse de suivi des nanoparticules, faire une dilution de chaque fraction avec 0,2 micromètre filtré PBS et vortex pour éliminer les agrégats. Mettez la solution dans une seringue d’un millilitre et placez-la dans la pompe à seringues automatisée.
Ensuite, réglez les paramètres de la caméra au niveau de gain d’écran approprié et au niveau de la caméra et cliquez sur Exécuter. Chargez l’échantillon dans la chambre d’analyse avec un taux d’infusion de 1000 pendant 15 secondes. Puis diminuer et stabiliser le flux de vitesse pour l’enregistrement vidéo à un taux de perfusion de 25 pendant 15 secondes.
Capturez trois vidéos consécutives de 60 secondes du flux de particules. Ajustez ensuite le niveau de la caméra et le seuil de détection avant l’analyse vidéo. Cliquez sur Paramètres OK pour commencer l’analyse, et cliquez sur Export une fois terminé.
Lavez le système avec un millilitre de 0,2 micromètre filtré PBS entre chaque fraction. Si vous effectuez une analyse par microscopie électronique, utilisez un filtre centrifuge de 50 kilodaltons pour concentrer les fractions d’intérêt de la chromatographie d’exclusion de taille. Pour l’extraction des protéines, mélanger 50 microlitres de tampon RIPA avec l’échantillon ev pendant cinq minutes sur la glace.
Sonicate les échantillons trois fois à 500 Watts et 20 kilohertz pendant cinq secondes. Puis enlever les débris vésiculaires en centrifugant à 20 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir isolé les protéines, effectuer la migration des protéines dans le gel empilage d’un gel polyacrylique de 12%.
Mélanger les protéines dans le gel avec Coomassie Blue pendant 20 minutes à température ambiante. Excisez ensuite chaque morceau de gel coloré et coupez-le en petits morceaux. Mettez les morceaux de gel à travers une série de lavages successifs tels que décrits dans le manuscrit.
Ensuite, séchez-les complètement avec un concentrateur à vide. Après séchage effectuer la réduction des protéines avec 100 microlitres de bicarbonate d’ammonium millimolaire contenant 10 millimolar Dithiothreitol pendant une heure à 56 degrés Celsius. Ensuite, effectuez l’alkylation protéique avec 100 microlitres de bicarbonate d’ammonium millimolaire contenant 50 millimolar iodoacetamide pendant 45 minutes dans l’obscurité.
Lavez les morceaux de gel selon les instructions manuscrites et séchez-les complètement sur le concentrateur à vide. Effectuez la digestion des protéines avec 50 microlitres de trypsine en bicarbonate d’ammonium millimolaire à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, extraire les protéines digérées du gel avec 50 microlitres de 100% ACN pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, puis 15 minutes à température ambiante en remuant continuellement.
Puis extraire les protéines deux fois avec 50 microlitres de 5%TFA en bicarbonate d’ammonium millimolaire, tout en remuant en continu pendant 20 minutes. Ajouter 100 microlitres d’ACN et continuer à remuer pendant 10 minutes. Ensuite, séchez les protéines et réutilisez-les en 20 microlitres de 0,1% TFA.
Desalt l’échantillon à l’aide d’une pointe de pipette de 10 microlitres avec c 18 supports de phase inverse pour desaler et concentrer les peptides. Ensuite, élisez-les avec ACN et 0,1% d’acide formique. Séchez complètement l’échantillon à l’aide d’un concentrateur à vide et réutilisez-le dans 20 microlitres d’ACN et 0,1 % d’acide formique pour la spectrométrie de masse tandem chromatographie liquide, ou LC-MS.
Chargez les peptides digérés dans l’instrument et effectuez une analyse d’échantillon. Pour confirmer l’isolement ev, chaque fraction de CSC a été soumise à une analyse de suivi de nanoparticules. Le nombre de particules était significativement plus élevé en fractions cinq, six et sept.
Ces fractions ont été mis en commun dans un échantillon 2F-EV positif, et comparés aux fractions négatives ev, 1F-EV négatif et 3F-EV négatif, en utilisant l’analyse de tache occidentale. Les résultats ont montré la présence de la protéine de choc thermique 90 dans l’échantillon positif ev et dans le contrôle de lysate de cellules. La microscopie électronique de l’échantillon positif à ev a montré des VE dans une gamme de taille autour de 100 nanomètres et 400 nanomètres.
L’analyse protéomique a été effectuée afin d’identifier les protéines contaminantes dans les échantillons négatifs de ve et de caractériser la teneur en protéines des VE. Les protéines identifiées ont été comparées entre 1F-EV négatif et un 2F-EV échantillons positifs, ainsi qu’entre 2F-EV positif et un 3F-EV échantillons négatifs. À l’aide de cette méthode non ciblée, un pool de 536 protéines a été soumis à la base de données ExoCarta et a mené à l’identification de 86 protéines associées à l’EV.
En outre, ce pool a également permis d’identifier les interactions protéiques et leurs fonctions biologiques associées. Il a été constaté que les protéines de l’échantillon positif ev joué un rôle dans les voies immunitaires et neuroprotectrices. Les effets des VE dérivés des microglies ont été évalués sur l’excroissance des neurites avec les cellules PC 12 et les neurones primaires des rats.
Une augmentation significative de la croissance a été observée chez les VE par rapport au contrôle. Des VE macrophage-dérivés ont été évalués sur l’invasion cellulaire de gliome. Il a été constaté que les VE altéré la croissance et l’invasion des sphéroïdes gliomes.
La chose la plus importante à retenir est de vraiment soigneusement jeter le supernatant de l’étape d’ultracentrifugation afin d’éviter la perte de VE dans cette procédure. Nous privilégions une approche à grande échelle et non ciblée pour nous concentrer sur l’ensemble de la teneur en protéines, puis sur l’effet vertical des VE. de sorte que le contenu dans les acides nucléiques peut être associé à l’aide de l’analyse.
Avec cette approche d’une culture primaire, nous sommes en mesure de discriminer entre les protéines EV et les protéines libres qui sont en dehors de la variété. Reste donc à savoir si cette coagulation est artifactual ou plutôt une autre
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cette étude détaille les protocoles pour l'isolement des vésicules extracellulaires (VE) des microglies et des macrophages sanguins, en mettant l'accent sur leurs rôles dans la régulation de la croissance des neurites et le contrôle de l'invasion des cellules du gliome. Les résultats visent à améliorer notre compréhension des fonctions des VE en tant que médiateurs immunitaires dans des microenvironnements spécifiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neuroscience
- Biologie cellulaire
- Immunologie
Contexte
- Les vésicules extracellulaires (VE) jouent des rôles importants dans la communication cellulaire.
- Les microglies et les macrophages sont des cellules immunitaires cruciales dans le système nerveux central.
- Comprendre comment les VE influencent les fonctions neuronales peut fournir des aperçus sur les interactions neuro-immunes.
- Les techniques actuelles d'isolement des VE peuvent avoir un impact sur l'intégrité et l'activité des vésicules.
Objectif de l'étude
- Évaluer les VE dérivées de la microglie et des macrophages sanguins dans différents contextes biologiques.
- Évaluer l'impact de ces VE sur la croissance des neurites et le comportement des cellules du gliome.
- Établir des protocoles fiables pour l'isolement des VE qui garantissent l'intégrité biologique.
Méthodes utilisées
- La méthode principale implique la culture cellulaire suivie d'une centrifugation par étapes pour isoler les VE des média conditionnés.
- L'analyse de suivi des nanoparticules et les techniques de Western blot sont utilisées pour la caractérisation des VE.
- Les détails incluent l'ultracentrifugation, la chromatographie d'exclusion de taille et les méthodes d'extraction des protéines.
- Une attention est accordée au maintien de l'éthique biologique lors de la manipulation des VE.
Résultats principaux
- Des dénombrements de particules significativement plus élevés ont été observés dans des fractions spécifiques enrichies en VE.
- L'analyse de Western blot a confirmé la présence de protéines liées au stress cardiaque dans les échantillons VE positifs.
- La microscopie électronique a identifié la plage de taille des VE isolées, indiquant des méthodes d'isolement réussies.
Conclusions
- Les protocoles développés pour l'isolement des VE à partir des microglies et des macrophages peuvent améliorer la recherche sur les processus neurodéveloppementaux médiés par l'immunité.
- L'étude fournit un cadre pour les futures investigations sur les rôles des VE dans divers contextes biologiques.
- Comprendre les implications fonctionnelles de ces VE pourrait informer les stratégies thérapeutiques dans les maladies neurologiques.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Isolation and functional characterization of immune cell-derived extracellular vesicles (EVs) enable mechanistic de-risking in neuroimmunology and oncology target validation. This approach supports predictive confidence in therapeutic vesicle design by linking EV protein signatures to neurite outgrowth and glioma invasion phenotypes. The protocol provides a scalable, reproducible workflow for evaluating EV-mediated immune functions in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microglial and macrophage EV protein signatures as biomarkers for immune-mediated pathway modulation.
- Operational Value: Provides standardized isolation via ultracentrifugation and size-exclusion chromatography to ensure EV integrity for functional assays.
- Predictive Value: Supports target de-risking by correlating EV-enriched proteins (e.g., HSP90) with functional outcomes in neurite outgrowth and glioma spheroid invasion models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative nanoparticle tracking data from SEC fractions to standardize EV yield and purity across batches.
- Operational Value: Enables functional readouts in neurite outgrowth (PC12/primary neurons) and glioma invasion (C6 spheroids) assays for immune mediator screening.
- Assay Readiness: Pooled EV-positive fractions (5-7) provide consistent material for downstream proteomic and functional validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease-relevant EV functions in neurite outgrowth (neuroprotection) and glioma invasion (anti-tumor immune modulation).
- Translational Continuity: Links EV protein cargo to immune and neuroprotective pathways, supporting biomarker-aligned mechanistic studies.
- Preclinical Model Utility: Uses primary neurons and glioma spheroids to evaluate EV effects in physiologically relevant culture systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven evaluation of immune cell EVs as modulators of neuronal and cancer cell phenotypes, supporting lead identification through functional de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of EV-mediated immune signaling in CNS and tumor microenvironments via isolated vesicle functional assays.
- Screening: Delivers standardized, quantification-ready EV preparations for high-content phenotypic screening in neurite outgrowth and invasion models.
- Analytics: Generates nanoparticle tracking, Western blot, and proteomic data to quantify EV yield, validate markers (e.g., HSP90), and characterize functional protein cargo.
- Translational Research: Connects EV protein signatures to pathway-level effects in neurite outgrowth and glioma invasion, enabling risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation and characterization platform applicable to multiple immune cell types and disease contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of immune cell EV functions in neurite outgrowth and glioma invasion models.
- Operational Value: Standardized isolation via ultracentrifugation and SEC ensures reproducibility and scalability across labs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking EV protein signatures to phenotypic outcomes in disease-relevant systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutic vesicle candidates based on functional immune mediator validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, ultracentrifugation, and size-exclusion chromatography for EV isolation.
- Dependent on nanoparticle tracking analyzers, Western blot systems, and mass spectrometry for EV characterization.
- Necessitates cross-team standardization of EV fractionation and pooling (e.g., fractions 5-7) for reproducible functional assays.
- Adaptation to primary microglia, macrophages, or other immune cells requires validation of EV yield and functional activity.
- Practical limitation: EV integrity depends on careful supernatant removal post-ultracentrifugation to prevent loss of vesicle yield.
