Génération de cardiomyocytes dérivés de HiPSC ventriculaires et de préparations cellulaires de haute qualité pour la caractérisation de la manipulation du calcium

La reproductibilité est une préoccupation majeure lorsqu’on induise des cardiomyocytes dérivés de cellules souches. En utilisant ces méthodes, une grande pureté et des cardiomyocytes de haute qualité peuvent être générés à partir d’iPS pour leur utilisation dans des études fonctionnelles. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode simple, fiable, rentable et extrêmement puissante pour obtenir des préparations purifiées et de haute qualité de cardiomyocytes dérivés de l’iPSC.

Pour le passage cellulaire, rincer les cellules avec un millilitre de PBS sans calcium et magnésium pendant sept à 10 minutes avant de remplacer le PBS par un millilitre de milieu de passage. À l’aide d’un élévateur cellulaire, raclez doucement les cellules du fond des puits et utilisez une pipette stérile en verre de deux millilitres pour dissocier mécaniquement les cellules détachées. Lorsque les cellules se sont soulevées en petits groupes comme visible sous le microscope ajouter moyen de passage pour diviser les cellules à un rapport d’un à six.

Ensuite, aspirez la matrice humaine de cellules souches embryonnaires qualifiées à partir de la plaque de six puits. Ajoutez ensuite un millilitre de milieu de passage et un millilitre de cellules dissociées à chaque puits, et laissez les cellules croître jusqu’à ce qu’elles atteignent 70 à 80% de confluence avant de commencer une différenciation cardiaque. Au moins 30 minutes avant de dissocier l’iPSC-MC, essuyer les feuillets de couverture en verre individuels avec 70 % d’éthanol et placer le couvercle dans les puits individuels d’une plaque stérile de six puits.

Lorsque les feuillets de couverture ont séché, ajouter 250 à 300 microlitres de cellules souches embryonnaires humaines solution matricielle qualifiée directement sur le centre de chaque glissement de couverture, et placer la plaque de six puits dans le capot de culture tissulaire. Pour dissocier l’iPSC-CM métaboliquement sélectionné ajouter un millilitre de trypsine stérile de 0,25% avec EDTA à chaque puits pour une incubation de cinq minutes à 35 degrés Celsius, et utiliser une pipette de 1000 microlitres pour dissocier mécaniquement les cellules jusqu’à ce qu’une suspension d’une seule cellule ait été réalisée. Tirez les cellules dans le tube conique stérile de 15 millilitres, et lavez chaque puits avec deux millilitres de RPMI 20 moyen par puits.

Ajouter ensuite les lavages au tube et pelleter les cellules par centrifugation. Resuspendez les cellules dans un volume suffisant de milieu pour atteindre trois fois 10 à la cinquième cellule pour 250 microlitres de concentration de cellules. Utilisez une pointe de pipette de 1000 millilitres pour dissocier les cellules jusqu’à ce que la solution semble homogène.

Ensuite, aspirez 250 microlitres de cellules dans une pointe de pipette de 1000 microlitres, et distribuez lentement tout le volume de solution sur un glissement de couverture codé par matrice embryonnaire humaine. Lorsque toutes les cellules ont été ensemencées, placez soigneusement la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant la nuit. Ajouter délicatement deux millilitres de D7 moyen à chaque puits le lendemain matin.

Lorsque les iPSC-MC sélectionnés atteignent au moins trois mois traiter les cellules avec deux microlitres de Fura-2 AM pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius, et la puissance sur le système d’analyse du calcium. Lancez l’ArcLamp et connectez les tubes de la pompe à l’entrée et aux prises appropriées et au fil électronique du stimulateur à la chambre. Placez la chambre sur le système.

Remplissez le tube ProFusion qui traverse le chauffe-eau fluide inlined avec 37 degrés Celsius réchauffé la solution de Tyrode, et ajuster la caméra et les dimensions d’ouverture de cadrage pour minimiser la zone de fond. Attachez le couvercle en verre ensemencé d’iPSC-CMs dans la chambre, et ajoutez doucement 500 microlitres de la solution de Tyrode directement sur le dessus du bordereau de couverture. Commencez à profuser la chambre avec la solution de Tyrode à une vitesse de 1,5 millilitre par minute, et utilisez un stimulateur électrique pour rythmer les iPC-MC avec 1 stimulation hertz champ à 10 volts toutes les quatre millisecondes pendant trois à cinq minutes.

Lorsque tout le colorant a été lavé hors de la chambre ajuster la fenêtre de visualisation à la partie supérieure gauche de la feuille de couverture, et commencer l’enregistrement. Après avoir recueilli un flux constant de cinq à 10 pics cliquez sur pause pour arrêter temporairement l’enregistrement et déplacer le stade microscope à une zone adjacente pour l’extrémité opposée de la feuille de couverture avant de reprendre l’enregistrement. Après avoir scanné l’éphémère de calcium sur l’ensemble du bordereau de couverture de la même manière sur une période de 10 minutes analyser les données avec un logiciel approprié d’analyse des traces de florescence selon les instructions du fabricant.

Ce protocole génère des cardiomyocytes très purs qui acquièrent un phénotype ventriculaire de type adulte en culture au fil du temps. Comme évalué par la coloration fluorescente immuno pour les isoformes auriculaires et ventriculaires de MLC2, la majorité des cellules générées par ce protocole sont atrial MLC2 isoforme positif au jour 30 après l’induction de la différenciation cardiaque. Tandis que les isoformes ventriculaires de MLC2 sont exprimés en beaucoup de nombres en même temps.

Au fur et à mesure que le temps de culture augmente, on observe un passage complet aux isoformes MLC2. Ces données ont également été confirmées par la quantification cytométrique de flux du pourcentage de marqueur MLC2 atrial et ventriculaire exprimant des cellules. L’amplitude de calcium est considérablement augmentée dans l’iPSC-MC au jour 90, semblable à celle observée pour les MC adultes de rat.

Il est important de noter que la contamination des cellules non cardiaques peut influencer la maturation fonctionnelle des iPSC-MC humains pendant la différenciation. De plus, lorsqu’il s’agit d’enregistrer des transitoires de calcium dans les iPSC-MC, il est nécessaire de permettre aux cellules de se stabiliser à 37 degrés Celsius sous stimulation constante pendant au moins 200 secondes, et de limiter les enregistrements à une fenêtre de temps spécifique pour assurer des résultats reproductibles. N’oubliez pas de confirmer que les iPSC présentent une morphologie homogène et de permettre aux cellules de croître à 70 à 80% confluence avant d’initier une différenciation cardiaque.

La qualité pure dans les cardiomyocytes iPS-dérivés immatures pourrait montrer des caractéristiques fonctionnelles altérées, qui ne reflètent pas le phénotype réel, mais pourraient être mal interprétées comme phénotype maladie. Par conséquent, l’obtention de cardiomyocytes purs et de haute qualité est importante pour fournir des résultats cohérents et reproductibles.