Name: Cibler les médicaments aux macrophages de poisson zèbre larvaire en injectant des liposomes chargés de drogues (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Découvrez une méthode de ciblage de médicaments aux macrophages de Danio rerio larvaire par microinjection de liposomes chargés. Cette technique permet d'évaluer précisément la fonction macrophagique dans les modèles inflammatoires.

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Ces travaux ont été soutenus par des subventions accordées à C.J.H. (Health Research Council of New Zealand and Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) et Z.W. (Faculty Research Development Fund de l’Université d’Auckland). Les auteurs remercient Alhad Mahagaonkar pour la gestion experte de l’installation de poisson zèbre, de l’unité de recherche en imagerie biomédicale, de l’école des sciences médicales, de l’Université d’Auckland pour son aide en imagerie confocale et graham Lieschke d’avoir offert la ligne de journalistes Tg(mpeg1:EGFP).

1. Préparation de Liposomes à étiquette bleue Marina
REMARQUE: Liposomes portant le colorant fluorescent bleu, Marina Blue et la drogue sont préparés en utilisant une méthode d’hydratation mince film avec l’insertion post de poloxamer 188. Toutes les procédures sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire. Les liposomes de contrôle ne portent que Le bleu Marina et le PBS. L’exemple décrit ici le chargement de liposomes avec un médicament antioxydant mitochondrie25 qui est utilisé dans les résultats représentatifs comme une preuve de concept.
<ol><li>Pour préparer les liposomes, dissoudre 16,4 mg (22,2 'mol) des phospholipides 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (voir Tableau des matériaux), 4. 3 mg (11,1 'mol) cholestérol (voir Tableau des matériaux)et 2,8 mg (3,7 'mol) 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (voir Tableau des matériaux, dans 3 ml de chloroforme:méthanol (3:1 v/v) dans un flacon à fond rond de 25 ml.</li>
	<li>Au mélange ci-dessus, ajouter 31 nmol de Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (voir Table of Materials) et 300 nmol d’un médicament inhibiteur mROS (voir Tableau des matériaux) et sonicate brièvement pour se dissoudre complètement. Pour les liposomes témoins, ajoutez seulement Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine. REMARQUE : Pour éviter le photoblanchiment du colorant fluorescent Marina Blue sensible à la lumière, protégez toutes les procédures de la lumière, dans la mesure du possible. Ceci est également important si le médicament à charger est sensible à la lumière.</li>
	<li>Retirer le solvant lentement sur un évaporateur rotatif (voir Tableau des matériaux)sur un bain d’eau à température contrôlée réglé à 45 oC en tournant à 75 tr/min sous pression sous vide (200 mbar pendant 15 min puis 0 mbar pendant 20 min). Ceci forme un film mince sec de lipide dans les murs en verre du flacon qui est encore séché pendant 45 min sous N2 pour faciliter l’enlèvement complet du solvant organique.</li>
	<li>Après la formation du film mince, régler la pression du vide à 40 mbar pendant 15 min, puis purger avec du gaz azoté pendant 30 min pour assurer l’élimination du solvant résiduel.</li>
	<li>Hydrater le film mince à l’aide d’un ml de saline tamponnée de phosphate (PBS, pH 7,4) et sceller avec du parafilm avant d’agiter le flacon à l’aide d’un évaporateur rotatif au-dessus d’un bain d’eau de 60 oC pendant 20 min afin de former des vésicules.</li>
	<li>Soumettre la suspension hydratée à 7 cycles de gel et de dégel en congelant dans le liquide N2 pendant 3 min, suivie d’une immersion dans un bain d’eau de 45 oC pendant 7 min.</li>
	<li>Extruder les liposomes à travers une membrane à l’aide d’un mini-extrudeur (voir Tableau des matériaux) et de 1,0 m de membranes en polycarbonate gravées sur piste (voir Tableau des matériaux)pendant 2-6 cycles afin d’obtenir de grandes vésicules unilamellar. REMARQUE: Afin d’atteindre un ciblage plus favorable envers les macrophages, manipuler les cycles d’extrusion jusqu’à ce que le diamètre des liposomes est d’environ 1 m26,27,28.</li>
	<li>Condensez les liposomes frais en granulés par ultracentrifugation à 186 000 x g et incubez avec 1 ml de 1 % de poloxamer 188 (voir Table of Materials) solution (10 mg/mL en PBS) à 45 oC et 750 tr/min pendant 30 min à l’aide d’un thermomélangeur avec un tube microrifuge de 2 ml (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Ultracentrifuger le mélange à 186 000 x g pendant 1 h à 4 oC et retirer le supernatant afin d’enlever tout polymère ou médicament non lié. Entreposer les granulés de liposomes à 4 oC, à l’abri de la lumière.</li>
</ol>2. Caractérisation de la taille Liposome et du potentiel Zeta
<ol><li>Diluer la formulation liposome avec de l’eau ultrapure (1:100) et mesurer la taille des particules, l’indice de polydispersité (PDI) et le potentiel zeta des liposomes à l’aide d’un analyseur dynamique de diffusion de lumière (voir Tableau des matériaux),en tripler à 25 oC. REMARQUE : Le PDI est une mesure de la distribution de la taille de la population de nanoparticules. Les valeurs PDI 'lt; 0.05 indiquent une distribution plus uniforme tandis que les valeurs plus proches de 1 indiquent une distribution de taille plus grande. Le potentiel zeta est la charge globale de surface.</li>
</ol>3. Calcul de l’efficacité de piégeage et du chargement de drogue dans les Liposomes
REMARQUE : Pour déterminer l’efficacité de piégeage du médicament dans les liposomes, la teneur en drogue contenue dans le supernatant et le granule de liposome sont mesurées.
<ol><li>Resuspendre la pastille liposome dans 1 ml de PBS.</li>
	<li>Retirez le supernatant, diluez 10 x avec de l’eau ultrapure et analysez par chromatographie liquide de haute performance (HPLC).</li>
	<li>Pour déterminer la concentration de médicaments dans les liposomes, ajouter 100 ll de suspension liposome à 900 oL de 10 % de solution triton-X100 (pour détruire la membrane lipidique, libérer le médicament piégé et prévenir l’accumulation de lipides dans la colonne HPLC) et vortex pendant 3 min avant l’analyse.</li>
	<li>Injecter 20 ll d’échantillon dans un système HPLC composé d’une pompe quaternaire, d’un auto-échantillonneur à thermostat et d’une colonne de 3 m 250 x 4,6 mm. Définir la phase mobile (10 mM PBS pH 2,5, acetonitrile et méthanol (30:40:30, v/v/v)) le débit à 0,9 mL/min et obtenir des profils spectrals à l’aide d’un détecteur de tableau à diodes réglé à 230 mM.</li>
	<li>Calculez l’efficacité de piégeage (EE) et le chargement de médicaments (DL) à l’aide des équations suivantes : EE (%) [Moi / Mt] x 100 DL (%) -[Moi / Mlip] x 100 Là où Me est la masse de la drogue encapsulée, Mt est la masse totale de médicament utilisé pendant la formulation et Mlip est la masse totale des lipides (y compris le cholestérol) et la drogue encapsulée.</li>
</ol>4. Préparation et injection de Liposomes
<ol><li>Préparer les aiguilles à microinjection borosilicate en insérant un mince mur borosilicate verre capillaire (1 mm O.D. x 0,78 mm I.D. x 10 cm de longueur) dans un dispositif de traction micropipette (voir Tableau des matériaux) avec les réglages génériques suivants puller (chaleur 680, traction 75, vitesse 40, temps 55 et pression 530) pour produire une aiguille microinjection conique.</li>
	<li>Placer les aiguilles dans un plat Petri sur l’argile de modélisation et disposer d’une manière que l’extrémité tirée ne touche pas le fond du plat. Gardez le couvercle de la vaisselle Petri fermé pour éviter la contamination par la poussière jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.</li>
	<li>Diluer les formulations liposome fraîchement préparées 1:1 dans le PBS stérile (pH 7.4) et brièvement le vortex (2-3 s) pour mélanger. REMARQUE : Protégez les liposomes de la lumière jusqu’à ce que les larves soient prêtes pour la microinjection.</li>
	<li>Mettre en place des couples adultes de reproducteurs de poissons zèbres la veille et recueillir des embryons comme décrit précédemment par Rosen et coll.29.</li>
	<li>Transférer les embryons dans un plat Petri (100 mm x 20 mm avec environ 60 embryons par plat) contenant un milieu E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4) complété par 0,1 % de méthylène bleu pour inhiber la croissance fongique. Enlever tous les embryons morts ou non fécondés et incuber pendant la nuit à 28,5 oC.</li>
	<li>Pour faciliter l’imagerie en direct, ajouter 0,003% N-Phenylthiourea (PTU) au média E3 lorsque les embryons atteignent 24 h de développement pour prévenir la formation de pigments (mélanisation).</li>
	<li>Déchorionate manuel les embryons à environ 30 h après la fécondation (hpf) à l’aide de forceps à pointe fine. REMARQUE : N’utilisez pas le traitement enzymatique pour déchorionate embryons car ceci peut causer des dommages épithélial et l’inflammation locale influençant de ce fait des études immunologiques</li>
	<li>Laisser les embryons se développer à 28,5 oC jusqu’à 2 jours après la fécondation (dpf).</li>
	<li>Préparer une plaque d’injection en versant suffisamment de 3% de cellulose méthyle (dans le support E3) dans le couvercle d’un petit plat de culture de 35 mm pour former un film mince couvrant toute la surface. REMARQUE : Lors de la préparation de la cellulose méthyle de 3 % dans les médias E3, il faut plusieurs jours pour que la cellulose méthyle se dissolve avec une douce agitation sur un shaker orbital.</li>
	<li>Anesthésiez les larves en couvant dans des médias E3 complétés par 200 g/mL de Tricaine.</li>
	<li>Recueillir un bassin d’environ 20-25 larves à l’aide d’une pipette de transfert en plastique et permettre aux embryons de se concentrer à l’extrémité de la pipette par gravité. En prenant soin de transférer les larves avec un minimum de liquide, placez-les au milieu du couvercle de la culture de 35 mm.</li>
	<li>À l’aide d’une chargeuse microcapillaire, disposer les larves de la manière suivante : antérieure vers le haut de la plaque d’injection avec la surface dorsale orientée vers l’aiguille de microinjection, pour injecter dans le ventricule postérieur(figure 2A-D); ou, antérieure vers la gauche de la plaque d’injection (lors de l’injection de la droite) avec la surface ventrale orientée vers l’aiguille de microinjection pour injecter dans le venosus sinus (Figure 2I). REMARQUE : Lorsqu’on leur injecte de cette façon, les macrophages de ventricule-résident arrière-cerveau(figure 2E) et les macrophages hématopoïétiques caudaux (Cht)(figure 2J)peuvent être ciblés, respectivement. La région du TCS du poisson zèbre larvaire est un site hématopoïétique analogue au foie fœtal des mammifères. Portez une attention particulière à ne pas endommager les embryons tout en organisant car cela peut causer une inflammation locale influençant ainsi les études immunologiques.</li>
	<li>Prendre des liposomes fraîchement préparés (à partir de l’étape 4.3) et remplir à l’arrière une aiguille d’injection avec environ 5 ll du mélange d’injection liposome à l’aide d’une chargeuse microcapillaire (voir tableau des matériaux). REMARQUE : Lors de l’évaluation de la localisation des liposomes dans les compartiments phagolysosomal des macrophages (Figure 2H), complétez ce mélange d’injection avec 200 g/mL d’un marqueur fluorescent rouge de phagosomes (voir Tableau des matériaux) et 100 nM d’un marqueur fluorescent rouge lointain de lysosomes (voir Tableau des matériaux)pour marquer les phagosomes30,31 et lysosomes32respectivement.</li>
	<li>Monter l’aiguille dans un micromanipulateur (voir Tableau des matériaux) relié à un support magnétique et à un injecteur de pression (voir Tableau des matériaux). Placer sous un stéréomicroscope et placer l’injecteur à une durée d’impulsion d’environ 50 ms et une pression d’injection d’environ 40 psi.</li>
	<li>Couper la pointe de l’aiguille de microinjection avec des pointes fines propres pour générer une ouverture d’environ 5 m de diamètre.</li>
	<li>Calibrer le volume à injecter en injectant un bolus dans une goutte d’huile minérale placée sur les lignes de grille d’un hémocytomètre. Ajuster la durée de l’impulsion et/ou la pression d’injection jusqu’à ce que le diamètre du bolus couvre 2,5 des plus petites lignes de grille (ce qui correspond à un volume d’environ 1 nL).</li>
	<li>Injecter soigneusement 1 nL du mélange d’injection de liposome dans le ventricule postérieur de chaque larve. REMARQUE : Lorsque vous injectez dans le ventricule postérieur, prenez soin de ne pas pénétrer trop loin ventrale (au-delà du cerveau postérieur) car cela peut perturber la vascularisation sous-jacente conduisant à des hémorragies. Lors de l’injection dans le venosus sinus, il faut veiller à ce que la pointe de l’aiguille se trouve juste à l’intérieur du péricarde et ne pénètre pas le jaune.</li>
	<li>Après l’injection, transférez immédiatement les larves injectées dans le support E3 en ajoutant des supports E3 à la plaque d’injection et en agitant doucement les larves hors de la cellulose méthyle à l’aide d’une pipette de transfert en plastique.</li>
	<li>Incuber les larves à 28,5 oC (protégé de la lumière) jusqu’à l’analyse par imagerie confocale vivante.</li>
</ol>5. Imagerie confocale et analyse d’image pour confirmer le ciblage macrophage des Liposomes
<ol><li>Chauffer un bain d’eau à 50 oC.</li>
	<li>Anesthésiez les larves à injection de liposome en transférant vers un nouveau plat Perti contenant des supports E3 complétés par 0,003% de PTU et 200 'g/mL Tricaine.</li>
	<li>Préparer le milieu de montage d’imagerie en direct en dissolvant 1% de faible point de fusion agarose dans les médias E3, complété par 0,003% PTU, dans un micro-ondes. Placer dans le bain d’eau et une fois que la solution a refroidi à 50 oC, ajouter 200 g/mL de Tricaine.</li>
	<li>Gardez le milieu de montage dans le bain d’eau de 50 oC pour éviter la polymérisation prématurée de l’agarose.</li>
	<li>Pour imager la surface dorsale du cerveau postérieur sur un microscope confocal équipé d’une lentille d’immersion en eau (figure 2E), intégrez les larves comme suit : Remplissez un plat de culture de 35 mm avec le milieu de montage (jusqu’à une profondeur d’environ 5 mm) et laissez-le polymériser. Excaver une petite tranchée dans l’agarose qui est de taille suffisante pour accueillir le sac jaune.</li>
	<li>Remplissez une pipette de transfert en plastique avec un milieu de montage en fusion, expulsez une petite quantité et utilisez-la pour recueillir les larves anesthésiées. Transférer immédiatement les larves dans le plat de culture et orienter les sacs de jaune, côté ventral vers le bas, dans les trous excavés, à l’aide d’une chargeuse microcapillaire. Maintenir périodiquement dans cette position jusqu’à ce que l’agarose polymérise. Regroupez-vous avec des supports E3 complétés par une Tricaine de 200 g/mL. REMARQUE : Lors du transfert et du positionnement des larves, prenez soin de ne pas causer de dommages épithéliales et d’inflammation locale qui peuvent influencer les études immunologiques. Pour le positionnement des larves à l’image vivante de la région du TCS (figure 2J), monter comme décrit ci-dessus, mais positionner les larves dans le trou excavé latéralement.</li>
	<li>Lors de l’imagerie sur un microscope confocal inversé, encastrez les larves, sans le lit d’agarose, directement sur le fond d’un plat en verre. Disposez-les de la surface dorsale vers le bas (ou latéralement) et après la polymérisation, couvrez toute la surface du plat avec une couche uniforme de milieu de montage. Une fois polymérisé, ajouter une fine couche de support E3 complétée par 200 g/mL de Tricaine.</li>
	<li>Pour vivre l’image du ventricule postérieur sur un microscope confocal, utilisez les paramètres suivants : 512 x 512 pixels; 40 x 3 piles Z (s’étendant de la surface la plus dorsale de l’arrière-cerveau); objectif 20x; 2.5x zoom. REMARQUE : En comparant les intensités du signal entre les échantillons (par exemple lors de l’imagerie de l’appréhende de liposomes étiquetés Marina Blue injectés dans les lignes de reporter marquant soit des macrophages [Tg(mpeg1:EGFP)33] ou des neutrophiles [Tg(lyz:EGFP)34]), il est essentiel que les réglages laser soient maintenus les mêmes (g. g., diamètre de trou d’épingle, tension laser, décalage et gain) pour aider à s’assurer que les différences ne sont pas un artefact de paramètres d’acquisition d’image modifiés.</li>
	<li>Utilisez un logiciel d’analyse d’image 3D pour quantifier l’utilisation de macrophages ou de neutrophiles des liposomes labellisés Marina Blue. Pour quantifier le nombre de cellules contenant des liposomes (Figure 2F) dans une pile Z, faites défiler les différentes sections Z et comptez le nombre de cellules individuelles contenant des liposomes étiquetés Marina Blue. Pour quantifier l’intensité de fluorescence des liposomes dans les cellules (Figure 2G), dessinez une région d’intérêt autour de chaque cellule (dans les dimensions X, Y et Z) pour quantifier l’intensité de fluorescence totale ou moyenne de Marina Blue intracellulaire.</li>
</ol>

<ol><li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li>
<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li>
<li>Krenkel, O., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+macrophages+in+tissue+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Liver macrophages in tissue homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).</li>
<li>Alderton, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+immunology%3A+turning+macrophages+on%2C+off+and+on+again%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).</li>
<li>Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+atherosclerosis%3A+a+dynamic+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).</li>
<li>Lawrence, T., Natoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+macrophage+polarization%3A+enabling+diversity+with+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).</li>
<li>Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-mediated+inflammation+in+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).</li>
<li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+450+million+years+in+the+making%3A+zebrafish+and+vertebrate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+and+mechanisms%22%5BJournal%5D)">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).</li>
<li>Hall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoresponsive+gene+1+augments+bactericidal+activity+of+macrophage-lineage+cells+by+regulating+beta-oxidation-dependent+mitochondrial+ROS+production%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production.</a> Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).</li>
<li>Hall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+fatty+acid-fueled+mROS+production+within+macrophages+alleviates+acute+gouty+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).</li>
<li>Cambier, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteria+manipulate+macrophage+recruitment+through+coordinated+use+of+membrane+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids.</a> Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).</li>
<li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li>
<li>Madigan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Macrophage+Response+to+Mycobacterium+leprae+Phenolic+Glycolipid+Initiates+Nerve+Damage+in+Leprosy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy.</a> Cell. 170 (5), 973-985 (2017).</li>
<li>Tobin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lta4h+locus+modulates+susceptibility+to+mycobacterial+infection+in+zebrafish+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans.</a> Cell. 140 (5), 717-730 (2010).</li>
<li>Volkman, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculous+granuloma+induction+via+interaction+of+a+bacterial+secreted+protein+with+host+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium.</a> Science. 327 (5964), 466-469 (2010).</li>
<li>Bowman, T. V., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swimming+into+the+future+of+drug+discovery%3A+in+vivo+chemical+screens+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish.</a> ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).</li>
<li>Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetic+screening+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chemical genetic screening in the zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li>
<li>Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+and+nanoparticles%3A+nanosized+vehicles+for+drug+delivery+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).</li>
<li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+with+liposomes+as+pharmaceutical+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).</li>
<li>Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stealth+liposomes%3A+review+of+the+basic+science%2C+rationale%2C+and+clinical+applications%2C+existing+and+potential%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential.</a> International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).</li>
<li>Astin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+cells+and+bacterial+infection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish.</a> Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-insertion+of+poloxamer+188+strengthened+liposomal+membrane+and+reduced+drug+irritancy+and+in+vivo+precipitation%2C+superior+to+PEGylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation.</a> Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-Mediated+Drug+Delivery+in+Larval+Zebrafish+to+Manipulate+Macrophage+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function.</a> Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).</li>
<li>Cader, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C13orf31+%28FAMIN%29+is+a+central+regulator+of+immunometabolic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function.</a> Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).</li>
<li>Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+particle+size+on+drug+delivery+to+rat+alveolar+macrophages+following+pulmonary+administration+of+ciprofloxacin+incorporated+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Targeting%22%5BJournal%5D)">Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes.</a> Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).</li>
<li>Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+characteristics+of+liposomes+by+rat+alveolar+macrophages%3A+influence+of+particle+size+and+surface+mannose+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmact+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification.</a> Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).</li>
<li>Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+particle+size+on+the+distributions+of+liposomes+to+atherosclerotic+lesions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Development+and+Industrial+Pharmacy%22%5BJournal%5D)">Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice.</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+zebrafish+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of zebrafish leukocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).</li>
<li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li>
<li>Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rag-Ragulator+Complex+Regulates+Lysosome+Function+and+Phagocytic+Flux+in+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia.</a> Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), 49-56 (2011).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42(2007).</li>
<li>Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+to+macrophages%3A+role+of+physicochemical+properties+of+particulate+carriers--liposomes+and+microspheres--on+the+phagocytosis+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers--liposomes and microspheres--on the phagocytosis by macrophages.</a> Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).</li>
<li>Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+macrophages+initiating+and+driving+inflammation+in+a+monosodium+urate+monohydrate+crystal-induced+murine+peritoneal+model+of+acute+gout%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout.</a> Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).</li>
<li>Faires, J. S., McCarty, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+arthritis+in+man+and+dog+after+intrasynovial+injection+of+sodium+urate+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals.</a> Lancet. 280, 682-685 (1962).</li>
<li>Martin, W. J., Harper, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+inflammation+and+resolution+in+acute+gout%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Innate inflammation and resolution in acute gout.</a> Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).</li>
<li>Fenaroli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+as+drug+delivery+system+against+tuberculosis+in+zebrafish+embryos%3A+direct+visualization+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment.</a> ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).</li>
<li>Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Neutrophilic+Inflammation+Using+Polymersome-Mediated+Cellular+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery.</a> Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).</li>
<li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).</li>
<li>Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+liposomal+drug+delivery+to+monocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages.</a> Journal of Drug Delivery. 2011, 727241(2011).</li>
<li>Fidler, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+liposomes+to+improve+delivery+of+macrophage-augmenting+agents+to+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages.</a> Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).</li>
<li>Ng, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+digestive+system+in+zebrafish%3A+III.+Intestinal+epithelium+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmenal+Biology%22%5BJournal%5D)">Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis.</a> Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’existe pas d’intérêts financiers concurrents.

Ici, nous avons fourni un protocole détaillé pour formuler des liposomes chargés de médicaments pour cibler spécifiquement les macrophages chez les poissons zèbres larvaires. Cette méthode peut être utilisée pour disséquer le rôle des macrophages dans certains modèles de maladies en assurant l’administration ciblée directe de médicaments spécifiquement aux macrophages. En outre, il peut être utilisé lorsque la toxicité générale des médicaments limite leur utilisation lorsqu’ils sont livrés par des routes plus conventionn...

Le système de phagocytemono mononucléaire fournit une première ligne de défense contre les agents pathogènes envahissants. Ce système se compose de monocytes, de cellules dendritiques dérivées de monocytes et de macrophages, qui phagocytos activement les agents pathogènes étrangers, limitant ainsi la propagation des agents pathogènes. En plus de ces fonctions d’effectrice phagocytique et microbicides, les cellules dendritiques et les macrophages sont également capables de produire de la cytokine et de présenter des antigènes pour activer le système immunitaire adaptatif1. Parmi ces cellules, les macrophages ont reçu une attention particulière en raison de leur hétérogénéité fonctionnelle diversifiée et de leur implication dans de multiples maladies inflammatoires, de l’auto-immunité et des maladies infectieuses au cancer2,3,4,5,6,7. La plasticité des macrophages et leur capacité à s’adapter fonctionnellement aux besoins de leur environnement tissulaire nécessite des approches expérimentales pour observer et interroger directement ces cellules in vivo.
Le poisson zèbre larvaire est un organisme modèle idéal pour étudier la fonction et la plasticité des macrophages in vivo8. La transparence optique du poisson zèbre larvaire offre une fenêtre pour observer directement le comportement des macrophages, en particulier lorsqu’il est couplé avec des lignes de reporter transgéniques de marquage macrophage. Exploiter le potentiel d’imagerie en direct et la tractabilité expérimentale du poisson zèbre larvaire a conduit à de nombreuses idées significatives dans la fonction macrophage qui ont une pertinence directe à la maladie humaine9,10,11,12,13,14,15. Bon nombre de ces études ont également profité de la forte conservation de l’activité des drogues chez le poisson zèbre (un attribut qui sous-tend leur utilisation comme une plate-forme de découverte de médicaments animaux16,17,18), en utilisant des interventions chimiques pour manipuler pharmacologiquement la fonction macrophage. Jusqu’à présent, ces traitements pharmacologiques ont été pour la plupart administrés soit par immersion, ce qui exige que le médicament soit soluble dans l’eau, soit par microinjection directe de médicaments gratuits (Figure 1A). Les limites de ces stratégies d’administration passive comprennent des effets hors cible et une toxicité générale qui peuvent empêcher d’évaluer tout impact sur la fonction de macrophage. En outre, lors de l’étude des effets des drogues sur les macrophages, on ne sait pas si les médicaments agissent sur les macrophages eux-mêmes ou par des mécanismes plus indirects. Lors de l’exécution d’études d’intervention chimique similaires pour étudier la fonction de macrophage, nous avons reconnu qu’il y avait un besoin non satisfait de développer une méthode d’administration peu coûteuse et simple pour cibler les médicaments spécifiquement aux macrophages.
Les liposomes sont des vésicules bicouches microscopiques, biocompatibles et lipidiques qui peuvent encapsuler les protéines, les nucléotides et la cargaison de médicaments19. La structure bicouche lipidique unilamellar ou multilamellar des liposomes forme un lumen intérieur aqueux où les drogues solubles dans l’eau peuvent être incorporées tandis que les drogues hydrophobes peuvent être intégrées dans les membranes lipidiques. En outre, les propriétés physicochimiques des liposomes, y compris la taille, la charge et les modifications de surface peuvent être manipulées pour adapter leur ciblage à des cellules spécifiques20,21. Ces caractéristiques des liposomes ont fait d’eux un véhicule attrayant pour livrer des médicaments et d’améliorer la précision des régimes de traitement actuels20. Comme les liposomes sont naturellement phagocytozed par les macrophages (une caractéristique exploitée par leur utilisation courante dans la livraison de clodronate spécifiquement aux macrophages pour les expériences d’ablation22), ils présentent comme une option attrayante pour l’administration de médicaments spécifiques aux macrophages (Figure 1B).
Ce protocole décrit la formulation des médicaments en liposomes fluorescents bleus recouverts du poloxamer 188 polymère hydrophile, qui forme une couche protectrice sur la surface liposome et a été montré pour augmenter la conservation de drogue et ont la biocompatibilité supérieure23. Poloxamer a été choisi pour le revêtement de surface des liposomes comme notre recherche précédente avait montré que, par rapport aux liposomes modifiés de polyéthylène glycol, les liposomes modifiés de poloxamer ont montré une meilleure biocompatibilité suivant l’injection sous-cutanée des pattes de rat et pharmacocinétique semblable dans les lapins suivant l’infusion intraveineuse23. Des protocoles sont également décrits pour leur microinjection dans le poisson zèbre larvaire et la formation image vivante pour évaluer leur capacité de ciblage de macrophage et la localisation aux compartiments intracellulaires nécessaires pour la dégradation de liposome et l’administration cytoplasmique de drogue. Comme preuve de concept, nous avons déjà utilisé cette technique pour cibler deux médicaments aux macrophages pour supprimer leur activation dans un modèle larvaire de poisson zèbre de l’inflammation goutte aigu24. Cette technique d’administration de médicaments élargit la « boîte à outils » chimique à la disposition des chercheurs sur le poisson zèbre qui veulent assurer le ciblage des macrophages de leurs médicaments d’intérêt.

<table><tbody><tr><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850355P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850367P</td><td></td></tr><tr><td>1.0 et micro ; m Whatman Nuclepore Membranes en polycarbonate gravées sur piste</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>110610</td><td></td></tr><tr><td>Fiole à fond rond de 25 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z278262</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Boîte de culture</td><td>Thermo Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1260 Détecteur à barrette de diodes Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4212B</td><td></td></tr><tr><td>Pompe quaternaire Agilent 1260 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1311B</td><td></td></tr><tr><td>Thermostat Agilent 1290 Infinity Series</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1330B</td><td></td></tr><tr><td>Mini-extrudeuse Avanti Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aiguilles de micro-injection de borosilicate</td><td>Warner Instruments</td><td>203-776-0664</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901-100G</td><td></td></tr><tr><td>cholestérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No.5 pince à pointe fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader pointe de pipette</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf SmartBlock 1,5 mL, thermobloc pour 24 récipients de réaction</td><td>Eppendorf</td><td>4053-6038</td><td></td></tr><tr><td>manipulateur de cils</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>Hémocytomètre 113</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hawksley</td><td>BS.748</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BDH Chemicals</td><td>441474J</td><td></td></tr><tr><td>Système HPLC</td><td>Agilent Technologies</td><td>Série 1260 Système</td><td></td>HPLC</tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1KG</td><td></td></tr><tr><td>agarose à bas point de fusion</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Rouge profond</td><td>Invitrogen</td><td>L12492</td><td>1 mM solution mère dans DMSO, maintenir à -20 &deg ; C et protéger de la lumière.</td></tr><tr><td>LysoTracker Deep Red</td><td>Thermo Scientific</td><td>L12492</td><td></td></tr><tr><td>support magnétique</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE)</td><td>Invitrogen</td><td>M12652</td><td>Maintenir à -20 &deg ; C et protéger de la lumière.</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>méthylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0387-500G</td><td></td></tr><tr><td>bleu de méthylène</td><td>Alfa Aesar</td><td>42771</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391-500G</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulateur</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>huile minérale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3516</td><td></td></tr><tr><td>Antioxydant ciblant les mitochondries MitoTEMPO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0737</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Red Indicateur de superoxyde mitochondrial</td><td>Thermo Scientific</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>MitoTEMPO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0737</td><td>Maintenir à -20 &deg ; C et protéger de la lumière.</td></tr><tr><td>N-Phénylthiourée (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-10G</td><td>Être prudent lors de la manipulation, toxique.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BDH Chemicals</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>PBS (pH 7,4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri (100 mm x 20 mm)</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>430167</tr><tr><td>Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4,6 mm</td><td>colonne Phenomenex</td><td>00G-4439-E0</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td><td>Thermo Scientific</td><td>P35361</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>P35361</td><td>Conserver à -20 &deg ; C et protéger de la lumière. Préparez une solution mère de 1 mg/mL en dissolvant 2 mg de produit lyophilisé dans 2 mL de PBS complété par 20 mM d’HEPES, pH 7,4.</td></tr><tr><td>pipette de transfert en plastique</td><td>Medi’Ray</td><td>RL200C</td><td></td></tr><tr><td>poloxamère 188</td><td>BASF Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>injecteur de pression</td><td>Applied Scientific Instruments</td><td>MPPI-2</td><td></td></tr><tr><td>évaporateur rotatif</td><td>B&uuml ; chi, Flawil, Suisse</td><td>B&uuml ; chi R-215 Rotavapor</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage</td><td>Olympus</td><td>Olympus FV1000 FluoView</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX+ Ultracentrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>75000090</td><td></td></tr><tr><td>stéréomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ12</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Préparer une solution mère de 4 mg/mL (dans du H2O désionné) et conserver à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>triton-X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Bain à ultrasons</td><td>Thermo Scientific</td><td>FB-11205</td><td></td></tr><tr><td>Volocity Logiciel d’analyse d’images</td><td>PerkinElmer</td><td>version 6.3</td><td></td></tr><tr><td>bain-marie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>Zetasizer Nano ZS ZEN 3600</td><td></td></tr></tbody></table>

cibler les médicaments aux macrophages de poisson zèbre larvaire en injectant des liposomes chargés de drogues

Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes

Les larves de poisson zèbre (Danio rerio) sont devenues un modèle populaire pour étudier les interactions hôte-pathogène et la contribution des cellules immunitaires innées aux maladies inflammatoires en raison de leur système immunitaire inné fonctionnellement conservé. Ils sont également largement utilisés pour examiner comment les cellules immunitaires innées aident à guider les processus de développement. En tirant parti de la transparence optique et de la tractabilité génétique du poisson zèbre larvaire, ces études se concentrent souvent sur des approches d’imagerie vivante pour caractériser fonctionnellement les macrophages et les neutrophiles fluorescents marqués chez les animaux intacts. En raison de leur hétérogénéité fonctionnelle diverse et de leurs rôles sans cesse croissants dans la pathogénie de la maladie, les macrophages ont reçu une attention considérable. En plus des manipulations génétiques, les interventions chimiques sont maintenant couramment utilisées pour manipuler et examiner le comportement des macrophages chez les poissons zèbres larvaires. L’administration de ces médicaments se limite généralement au ciblage passif de médicaments gratuits par immersion directe ou microinjection. Ces approches reposent sur l’hypothèse que tout changement au comportement de macrophage sont le résultat d’un effet direct du médicament sur les macrophages eux-mêmes, et non pas une conséquence en aval d’un effet direct sur un autre type de cellule. Ici, nous présentons nos protocoles pour cibler les médicaments spécifiquement aux macrophages de poissons zèbres larvaires en microinjectant des liposomes fluorescents chargés de médicaments. Nous révélons que les liposomes fluorescents bleus 188-modifiés de poloxamer-chargés de drogue sont facilement pris par des macrophages, et pas par des neutrophiles. Nous fournissons également la preuve que les médicaments livrés de cette façon peuvent avoir un impact sur l’activité des macrophages d’une manière compatible avec le mécanisme d’action du médicament. Cette technique sera utile aux chercheurs qui veulent assurer le ciblage des médicaments aux macrophages et lorsque les médicaments sont trop toxiques pour être livrés par des méthodes traditionnelles comme l’immersion.

L’approche d’hydratation des couches minces décrite ici pour la préparation de liposomes fluorescents enveloppant les médicaments est une méthode simple et rentable. Avec le protocole utilisé dans cette étude, les liposomes devraient être unilamellar23,24. La taille, le potentiel zeta, le chargement des médicaments et l’efficacité du piégeage des liposomes produits sont résumés dans le tableau 1. La taille des particules des liposomes (avant et a...

Ici, nous décrivons la synthèse des liposomes drug-charged et de leur microinjection dans le poisson zèbre larvaire dans le but de cibler l’administration de drogue aux cellules de macrophage-lignée.

Cibler les médicaments aux macrophages de poisson zèbre larvaire en injectant des liposomes chargés de drogues

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells ...

Ce protocole décrit une technique de ciblage des médicaments d’intérêt pour les macrophages larvaire du poisson zèbre pour manipuler et évaluer la fonction macrophage. Cette technique présente des avantages par rapport aux stratégies traditionnelles d’administration de médicaments, comme l’immersion, en veillant à ce que les médicaments soient spécifiquement ciblés sur les macrophages par encapsulation liposome. Lorsqu’elle est appliquée aux modèles de la maladie du poisson zèbre avec une composante inflammatoire, cette technique a le potentiel de résoudre la façon dont les macrophages contribuent aux processus pathologiques.Ici, nous démontrons l’utilité de cette technique en ciblant un médicament mitochondrial-réactif d’espèce d’oxygène inhibant aux macrophages pour supprimer l’activation. La microinjection de liposomes chargés de drogue en larves peut être difficile, car il faut prendre soin de ne pas causer de dommages épithéliales excessifs, ce qui pourrait influencer les études immunologiques. La démonstration visuelle de ce protocole est importante parce qu’elle implique des méthodologies pharmacologiques et entières de cellules vivantes animales qui peuvent ne pas être exéc

targeting-drugs-to-larval-zebrafish-macrophages-injecting-drug-loaded

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Embryons de poisson zèbre transparent ont prouvé hôtes modèle utile pour visualiser et les interactions entre l'étude fonctionnellement les cellules immunitaires innées et bactéries pathogènes intracellulaires, tels...

L&#39;infection des embryons de poisson zèbre avec bactéries pathogènes intracellulaires

Le développement rapide, de petite taille et la transparence du poisson zèbre sont des atouts considérables pour l'étude du contrôle immunitaire innée de...

L&#39;imagerie non invasive de la candidose disséminée chez les larves poisson zèbre

L’article décrit l’ablation hépatique ciblée, une méthode pour induire la mort des hépatocytes avec du métronidazole chez les larves de poisson-zèbre transgénique. L’exemple de protocole décrit le processus de génération, de manipulation et d’évaluation de l’ablation ciblée du foie chez le poisson-zèbre.

Ablation ciblée du foie : induire la mort des hépatocytes avec du métronidazole chez des larves de poisson-zèbre transgénique

La vidéo montre une technique de dispositif de blessure et de piégeage de poisson-zèbre pour observer l’infection par des agents pathogènes fongiques marqués par fluorescence chez les larves de poisson-zèbre. L’infection initiale attire les macrophages et, à mesure que l’infection persiste, le recrutement des neutrophiles progresse au site d’injection.

Une technique zWEDGI pour visualiser les larves de poisson-zèbre infectées par des agents pathogènes fongiques

La vidéo démontre la micro-injection de lipopolysaccharides (LPS) dans le cerveau de larves de poisson-zèbre pour induire une neuroinflammation. Les larves sont positionnées sur une boîte tapissée d’agarose, l’aiguille est insérée dans les ventricules cérébraux et le LPS est injecté. Le LPS injecté déclenche une réponse immunitaire qui conduit à une neuroinflammation.

Induction d’une neuroinflammation chez des larves de poisson-zèbre avec une injection de lipopolysaccharide

Les embryons de poisson-zèbre optiquement transparents sont largement utilisés pour étudier et visualiser en temps réel les interactions entre les micro-organismes pathogènes et les cellules immunitaires innées. La micro-injection de Mycobacterium abscessus, combinée à l’imagerie par fluorescence, est utilisée pour examiner les caractéristiques pathogènes essentielles telles que la formation de la moelle épinière chez les embryons de poisson-zèbre.

Décrypter et de l&#39;imagerie et la pathogenèse de Cording<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Dans embryons de poissons zèbres

Pour tester l'effet d'une chimiokine sur le recrutement de macrophages in vivo, l'hybridation in situ de montage entière a été employée pour détecter l'expression ectopique de la chimiokine, et l'immunostaining a été employée pour étiqueter des macrophages. L'imagerie en direct a été utilisée pour l'observation en temps réel de la migration des macrophages.

Un modèle d'expression ectopique de chemokine pour tester le recrutement de macrophage in Vivo

Ce protocole décrit une technique pour visualiser le comportement et la mort de macrophage dans le poisson zèbre embryonnaire pendant l'infection de marinum de Mycobacterium. Des étapes pour la préparation des bactéries, l'infection des embryons et la microscopie intravitale sont incluses. Cette technique peut être appliquée à l'observation du comportement cellulaire et de la mort dans des scénarios similaires impliquant une infection ou une inflammation stérile.

Visualisation de la mort des cellules lytiques de Macrophage pendant l'infection mycobactérienne dans les embryons de poisson zèbre par l'intermédiaire de la microscopie intravitale

Les modèles de xénogreffe de poisson zèbre permettent le dépistage des médicaments à haut débit et l’imagerie fluorescente des cellules cancéreuses humaines dans un microenvironnement in vivo. Nous avons mis au point un flux de travail pour le dépistage automatisé à grande échelle des médicaments sur des échantillons de leucémie dérivés du patient chez le poisson zèbre à l’aide d’une unité d’imagerie automatisée équipée d’un microscope à fluorescence.

Dépistage de drogue des xénogreffes dérivées de tumeur de patient primaire dans le poisson-zèbre

Ce protocole démontre la micro-injection de lipopolysaccharide dans la région ventriculaire du cerveau dans un modèle larvaire de poisson zèbre pour étudier la réponse neuroinflammatoire et la neurotoxicité qui en résultent.

Microinjections ventriculaires cérébrales de lipopolysaccharide dans des larves de poisson-zèbre pour évaluer la neuroinflammation et la neurotoxicité

Le poisson zèbre ciblant les électrophiles et les oxydants réactifs (Z-REX) est une méthode basée sur la biologie chimique pour l’étude de la signalisation réactive des petites molécules. Cette technique peut être appliquée à des poissons vivants de différents stades de développement. Ici, nous associons des tests standard chez le poisson zèbre avec Z-REX pour l’analyse de la voie de signalisation.

Surveillance des réponses de signalisation ciblée chez les larves de poisson-zèbre - Z-REX démasque les mécanismes précis des médicaments électrophiles et des métabolites

Découvrez une méthode de ciblage de médicaments aux macrophages de Danio rerio larvaire par microinjection de liposomes chargés. Cette technique permet d'évaluer précisément la fonction macrophagique dans les modèles inflammatoires.

Cibler les médicaments aux macrophages de poisson zèbre larvaire en injectant des liposomes chargés de drogues

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