Une méthode de montage en couches pour la microscopie confocale de temps-lapse prolongée des embryons entiers de poisson zèbre

Nous avons mis au point une méthode de montage pour l’imagerie en accéléré qui permet la croissance sans restriction des embryons fragiles de poisson zèbre et en même temps les maintient dans une position complètement fixe. Cette méthode de montage est rapide, facile et bon marché et il fonctionne pour l’imagerie de laboratoire sur n’importe quel microscope inversé. Nous avons mis au point cette méthode d’imagerie d’embryons vivants de poissons zèbres, mais elle pourrait être modifiée pour l’imagerie d’autres petits modèles d’animaux aquatiques.

Commencez par élever le poisson zèbre adulte. Dans l’après-midi, placer le poisson dans des cuves de reproduction à un rapport homme-femelle de un à deux. Préparez ensuite une solution de bouillon de 1% d’agarose de fonte faible dans les médias embryonnaires et dissolvez-la en la chauffant dans un four à micro-ondes.

Aliquot la solution agarose en tubes de 1,5 millilitre. Faire une solution de stock de 4% tricaine dans l’eau distillée et stocker l’agarose et la tricaine à quatre degrés Celsius. Tricaine est toxique et doit être pesé et préparé dans un capot de fumée.

Après l’accouplement, récolter les embryons de poisson zèbre à l’E3 dans une boîte de Pétri et les incuber à 26,5 degrés Celsius pendant environ 28 heures avant de monter. Anesthésier les embryons avec 0,02% de tricaine et les déchorionner au microscope en saisissant doucement et en tirant la chorion à part pour libérer l’embryon. Juste avant le montage, chauffer la solution agarose à 65 degrés Celsius, puis laisser refroidir à environ 30 degrés Celsius afin que l’embryon ne soit pas blessé par la chaleur et ajouter de la tricaine à la solution agarose.

Utilisez des plats de fond en verre de 35 millimètres avec un fond de couverture numéro zéro. Placez délicatement un embryon déchorionné avec l’un de ses côtés latéraux vers le fond du plat avec une pipette en verre ou une micropipette, puis retirez soigneusement tout E3 restant avec une micropipette. Ajouter la première solution d’agarose au petit puits créé par la couverture fixée au fond du plat pour couvrir l’embryon en s’assurant que l’agarose recouvre le petit puits mais ne le déborde pas.

Couvrir le petit puits d’un verre de couverture pour créer un espace étroit rempli d’agarose avec l’embryon entre les deux lunettes de couverture. Placez une couche de solution agarose de 1% sur le dessus de la couverture partout dans le fond du plat qui gardera le verre de couverture en place pendant qu’il solidifie. Remplissez ensuite la partie restante du plat d’E3 contenant 0,02 % de tricaine pour garder le système hydraté.

Pour identifier la concentration optimale d’agarose pour la première couche, monter les embryons dans des concentrations croissantes d’agarose et effectuer une imagerie en accéléré pour identifier la concentration qui minimise la distorsion et la motilité de l’embryon, puis tester une gamme plus fine de concentrations basées sur les résultats. L’étape la plus critique de ce protocole est d’identifier la concentration optimale d’agarose pour la première couche. Testez différentes nano concentrations d’agarose telles que 0,030%0,032%, etc.

pour trouver la concentration optimale. Pour effectuer l’imagerie en accéléré des embryons, utilisez une étape de microscope avec un incubateur réglé à 28,5 degrés Celsius et une image jusqu’à 55 heures. Pour imager simultanément plusieurs embryons, utilisez un adaptateur de scène qui contient plusieurs plats et faites pivoter les plats un par un afin que les embryons soient placés horizontalement.

Sélectionnez un objectif de grossissement faible, puis localisez les embryons à l’aide de l’oculaire et alignez-les finalement horizontalement en faisant pivoter la vaisselle. Enregistrez l’emplacement des embryons dans le logiciel et créez un nom de fichier pour l’autoavage des données. Réglez la taille du sténopé, la vitesse de balayage, la taille de l’image et le zoom.

Sélectionnez ensuite un grossissement plus élevé pour capturer des images et les canaux de fluorescence à imager. Pour chaque canal, ajustez la puissance laser et la haute tension du détecteur en vous assurant de collecter la meilleure plage dynamique possible tout en évitant la saturation et en limitant le blanchiment des photos. Ensuite, pour visualiser l’embryon entier avec un objectif de 10X, définissez les paramètres de capture d’image grande dans le logiciel pour l’image de plusieurs champs de vision et de les assembler en ajustant la position de l’embryon pour s’assurer qu’il s’inscrit dans cette grande zone d’image.

Configurez les paramètres pour capturer les piles Z selon les instructions manuscrites. Afin de maintenir la concentration de plusieurs embryons pendant l’imagerie à long terme, utilisez une mise au point automatisée et ajustez les niveaux de décalage individuels pour chaque embryon pour qu’il se concentre sur le plan de référence. Ensuite, configurez des paramètres time-lapse dans le logiciel microscope pour l’image pour une durée de 55 heures à intervalles d’une heure.

À chaque cycle, capturez deux ensembles de données sur l’embryon séquentiellement et enregistrez automatiquement les données. Utilisez le logiciel microscope pour traiter les images. Si plus d’un embryon a été photographié, créez des fichiers indépendants pour chaque embryon en divisant les ensembles de données en fonction de l’emplacement de l’imagerie.

Convertissez les ensembles de données de temps 3D en ensembles de données de temps 2D à l’aide de projections d’intensité maximale ou d’un outil similaire. Enfin, créez des fichiers de film en économisant en tant qu’AVI et en sélectionnant l’option sans compression avec des intervalles de 200 millisecondes pour une vitesse de lecture de cinq images par seconde. Cette méthode de montage en couches permet d’imager les embryons de poisson zèbre tout en leur permettant de croître tout en limitant leur mouvement.

Si la concentration d’agarose est trop élevée, les embryons deviennent déformés. Mais s’il est trop bas, ils sortiront du champ de vision pendant la microscopie time-lapse. La concentration optimale d’agarose s’est trouvée entre 0.028 et 0.034%Poisson zèbre transgénique vivant exprimant RFP dans l’embryon entier et GFP dans les cellules endothéliales de la vasculature ont été imaged pendant 55 heures pendant lesquelles le vaisseau intersegemental a germé, vasculature subintestinal et tête s’est développée, et condensation caudale de plexus de veine avec l’extension de tronc s’est produite.

Des embryons exprimant GFP et neurones moteurs ont été photographiés pour visualiser le développement de neurones moteurs. Les axones du neurone moteur poussent du tube neural ventral sur les somites vers le côté ventral de l’embryon. Le co-développement de la germination dorsale des axones des neurones moteurs par rapport à la position des vaisseaux intersegmentaux a été photographié à l’aide d’un grossissement plus élevé.

Cela a permis de visualiser les détails les plus fins de la germination ventrale de l’axon ainsi que la germination dorsale de l’axon à partir du tube neural. Au fur et à mesure que le nombre de somites augmentait, les somites s’étendent également en longueur et en largeur. Ce processus a été photographié à l’aide d’embryons transgéniques exprimant GFP dans les muscles.

Parce que la concentration optimale de l’agarose est très étroite, il est très sensible aux petites variations dans les mesures lors de la préparation de la solution de stock de l’agarose et il doit être redéfini pour chaque nouveau lot de solution d’agarose. Il est important de définir soigneusement les paramètres d’imagerie, y compris la taille et la résolution de l’image, la vitesse de balayage, le zoom, la haute tension du détecteur et la puissance laser afin d’assurer la cohérence entre les expériences et aussi de réduire la possibilité de toxicité photo et de blanchiment de photos pendant l’imagerie à long terme. En utilisant cette méthode de montage pour les embryons transgéniques de poisson zèbre suivie d’une imagerie prolongée en accéléré de l’organisme tout entier, nous pouvons visualiser comment différents tissus se développent ensemble.