Excroissance glomerulaire en tant qu’essai Ex Vivo pour analyser les voies impliquées dans l’activation des cellules épithéliales pariétales

L’activation des cellules épithéliales pariétales est dans le facteur clé dans le développement du tissu cicatriciel dans le glomerulus du rein. En utilisant cette méthode, nous pouvons étudier les processus cellulaires impliqués dans cette activation et nous espérons trouver des options de traitement pour ralentir ou même arrêter la progression de la maladie. Le principal avantage de notre technique est que nous utilisons des cellules primaires qui se développent directement à partir du glomeruli isolé.

Après avoir libéré les reins, comme décrit dans le manuscrit du texte, tenir le rein avec les forceps chirurgicaux et utiliser une autre paire de forceps pour retirer les capsules rénales. Après cela, placez les reins dans les puits d’une plaque de culture de six puits qui contiennent chacun deux millilitres de HBSS et placez la plaque de culture sur la glace. Tout d’abord, transférer les reins dans une boîte de Pétri de 100 millimètres et utiliser deux scalpels pour les hacher en petits morceaux qui sont d’environ un à deux millimètres.

Gardez les morceaux de rein hachés humides avec HBSS. Ensuite, placez les morceaux de rein sur un tamis en métal de 300 micromètres et appuyez sur le rein à travers le tamis à l’aide du piston à partir d’une seringue de 20 millilitres. Rincez à plusieurs reprises le tamis avec HBSS entre les deux et utilisez une pipette sérologique pour recueillir le débit et le transférer dans une boîte de Pétri propre.

Utilisez un scalpel pour gratter tout ce qui reste dans le fond du tamis et le transférer à l’homogénéité rénale recueillie. Rincer l’homogénéité rénale au tamis de 75 et 53 micromètres avec le HBSS. Ensuite, lavez les deux tamis avec HBSS pour enlever toutes les structures plus petites.

Recueillir les structures rénales et les matériaux qui sont restés dans les tamis en lavant la surface supérieure de chacun avec DMEM complété par 20% sérum de veau fœtal et transférer le matériau dans les puits d’une microplaque de fixation de six puits ultra-faible. Apportez la microplaque d’attachement ultra-faible à un microscope à lumière inversée et utilisez une pipette de 20 microlitres a pris recueillir glomeruli unique encapsulé et ou décapsulé. Après avoir attrapé un seul glomerulus dans la pointe pipette, ajouter le milieu frais de DMEM sans matériel rénal recueilli dans la même pointe de pipette à un volume de 20 microlitres.

Transférer le glomerulus unique avec le milieu DMEM au centre d’un puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits et incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant trois heures pour permettre l’attachement du glomerulus au centre du puits. Après l’incubation, le glomerulus sera fixé au centre du puits. Ajouter soigneusement 500 microlitres de milieu basal endothélial complétés par un kit de facteur de croissance et un supplément de 5%FBS et 1% de pénicilline et de streptocotomycine à chaque puits.

Culture le glomeruli unique à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant six jours. Après six jours d’incubation, utilisez un microscope à lumière inversé numérique pour prendre des images et analyser la croissance glomerular. À l’aide d’un logiciel d’analyse d’image, déterminez la surface de la croissance glomerular en ouvrant l’un des fichiers d’image avec une barre d’échelle.

Tracez une ligne droite sur la barre d’échelle et cliquez sur Analyser, puis mesurez pour déterminer la distance en pixels. Pour déterminer l’échelle, cliquez sur Analyser et définir l’échelle et entrez la distance connue en pixels, la distance connue et l’unité de longueur. Cliquez sur Ok une fois terminé.

Cliquez sur Analyser et définir les mesures. Ensuite, vérifiez les options pour la zone et l’étiquette d’affichage. Cliquez sur Ok une fois terminé.

Ensuite, dessinez une sélection à main levée autour de l’excroissance glomerular. Cliquez sur Analyser et mesurer pour afficher un tableau de résultats, qui contient la surface de la croissance dans l’échelle déterminée antérieure. dans cette étude, les excroissances épithéliales pariétales glomerular de cellules de glomeruli encapsulées sont isolées des reins de souris, cultivés, et analysés.

Les images représentatives de microscopie légère montrent les excroissances glomerular à différents points de temps pendant la culture après que les glomerulus soient isolés des reins de souris. Afin de valider que les cellules en croissance sont des cellules épithéliales pariétales, les glomeruli décapsulés sont également isolés et cultivés pendant six jours. Les glomeruli décapsulés ne montrent aucune excroissance cellulaire pendant cette période d’incubation.

La coloration immunofluorescente est alors effectuée pour différents marqueurs cellulaires épithéliales pariétals, marqueurs spécifiques au site photo, ainsi que des marqueurs cellulaires endothéliales. Les résultats valident que les cellules en croissance, en effet, sont des cellules épithéliales pariétales. Glomeruli associé à des souris CD44 KNOCKOUT montrent une diminution du nombre de cellules en croissance, ainsi qu’une diminution de la surface de la croissance glomerular par rapport au glomeruli isolé de souris de type sauvage.

Ceci suggère un rôle important pour CD44 dans l’activation épithéliale pariétale de cellules. En utilisant cette technique, il est également possible d’étudier les effets sur les médicaments sur l’activation pariétale des cellules épithéliales. Cela peut être fait en traitant le glomeruli isolé avec le médicament de votre choix et d’analyser les différences dans la croissance cellulaire et la migration cellulaire.