Une méthode statique auto-dirigée pour générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches embryonnaires humaines

Organoïdes du cerveau humain sont un outil important pour étudier la maladie dans un système qui est facilement manipulé et intègre un cadre humain et l’interaction appropriée de plusieurs types de cellules. Cette technique peut être appliquée pour étudier de nombreuses maladies du cerveau, y compris les troubles neurodéveloppementaux, les insultes toxiques, et la croissance et le traitement du cancer dans le cerveau. Le principal avantage de ce protocole est la capacité de générer des organoïdes cérébraux hautement reproductibles avec une grande variété de types de cellules neuronales.

Ceci est fait en utilisant un flux de travail très simpliste qui pourrait être accompli par la plupart des laboratoires. Et ceux-ci sont produits d’une manière appropriée temporaire sans l’influence de facteurs de croissance spécialisés ou de matrices non définies ce qui en fait un système très simple et rentable. Pour commencer, combinez 100 microlitres de matrice avec 5,9 millilitres de glace froide Dulbecco’s Modified Eagle Medium ou F12 media dans un tube conique de 15 millilitres.

Enduire chaque puits d’une plaque de six puits d’un millilitre de la matrice membranaire. Envelopper l’assiette dans un film de paraffine et conserver toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, aspirez l’excès de médias de chaque puits, rincez les puits avec F12 et ajoutez h9 hESCS dans un volume total de deux millilitres de média mTeSR1 par puits.

Culture des cellules d’une semaine à l’autre. Fournissez quotidiennement deux millilitres de médias mTeSR1 et placez la plaque dans un incubateur à faible teneur en oxygène de 37 degrés Celsius avec 5 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone. Utilisez des outils en verre pour déneager les cellules différenciantes de la culture entre les passages.

Rafraîchissez les médias tous les jours. Les cellules doivent être amorcées quatre à six jours avant d’utiliser les cellules H9 pour la production d’organoïdes. Pour passer les cellules, commencez par les rincer avec des supports DMEM F12 et aspirer l’excès de liquide.

Après le rinçage, ajouter la solution de protéase et incuber les cellules pendant 40 minutes afin que les colonies flottent dans le puits. Ensuite, lavez les cellules trois fois à l’aide de DMEM F12 et si nécessaire titrer pour rendre les morceaux plus petits. Ensuite, distribuez les cellules à un rapport d’environ un à huit sur quatre plaques de six puits et placez les plaques dans l’incubateur et nourrissez-les quotidiennement.

Après quatre à six jours, les cellules atteignent environ 80% de confluence. Transition vers un incubateur régulier. Diluer la solution de stock de protéase à une concentration de travail en ajoutant un millilitre de la solution de stock à cinq millilitres de DMEM ou F12 moyen par chaque plaque de six puits de hESCS.

Aspirez et retirez le média de culture cellulaire, puis couvrez le hESCS avec la solution de protéase. Placez les plaques dans l’incubateur pendant 10 à 15 minutes ou jusqu’à ce que les bords des colonies arrondissent et commencent à se séparer de la matrice, mais avant qu’ils ne se arrondir complètement. Inclinez la plaque, aspirez la solution de protéase et lavez doucement les cellules avec deux millilitres de DMEM ou de F12 pour chaque puits trois fois.

Assurez-vous que les colonies restent attachées à la matrice. Il est donc essentiel que les morceaux de cellules ES sont dans la taille appropriée alors assurez-vous qu’ils sont en dispase pour la quantité appropriée de temps. S’ils sont là pour trop peu de temps, il peut être très difficile de les rincer et de les briser.

Et s’ils sont là-dedans trop longtemps, ils peuvent se débarer pendant les étapes de lavage. Ajouter environ un à 1,5 millilitres de supports mTeSR frais à chaque puits et rincer les cellules de la plaque dans un tube conique de 50 millilitres à l’aide d’un tuyauteur doux. Aspirer et distribuer hESCS dans la plaque jusqu’à ce qu’ils atteignent environ 1/30e de leur taille d’origine.

Aujourd’hui, les grappes de colonies ressemblent à des pièces de 250 à 350 micromètres. Transférez les cellules dans un seul flacon T75 à fixation ultra faible contenant 30 millilitres de supports mTeSR sans bFGF. Le lendemain, inclinez la fiole de telle sorte que les cellules vivantes se billard dans le coin.

S’il y a un grand nombre de cellules qui ont adhéré au fond du flacon, utilisez une pipette de 10 millilitres pour transférer les cellules dans un nouveau flacon. Attendez-vous à avoir une forte population de cellules mortes pour les premiers jours. Une fois que les cellules se déposent, aspirent outre du média et des cellules mortes laissant environ 10 millilitres de médias contenant les cellules vivantes et ajoutent 20 millilitres de médias de bFGF bas complétés avec 30 nanogrammes par millilitre de bFGF.

Après deux jours, vérifiez les cellules. La plupart des cellules devraient avoir l’air saines et brillantes. Toutefois, si plus d’un tiers des cellules semblent sombres, inclinez le flacon et remplacez 20 millilitres de médias par 20 millilitres de faible teneur en médias bFGF complétés par 20 nanogrammes par millilitre de bFGF.

Le troisième jour, retirez la moitié des supports et remplacez-les par 15 millilitres de supports hESC complétés par 10 nanogrammes par millilitre de bFGF. Le cinquième jour, remplacez la moitié des médias par 15 millilitres de supports d’induction neuronale. Après cela, tous les deux jours, remplacer la moitié du milieu par des supports d’induction neuronale.

Après trois semaines dans la culture, ajouter 100X Penicillin-Streptomycine aux médias à une concentration finale de 1X si désiré. Rafraîchissez la moitié des médias tous les deux jours. Dans ce protocole, les organoïdes cérébraux formés avaient l’air brillants et similaires en taille sans cellules sombres mourantes dans les centres de ces grappes.

Les cellules ont été progressivement sevrées de bFGF. Le cinquième jour, ils ont été placés dans des médias d’induction neuronale et ils sont restés dans ces médias tout au long de la période culturelle. Bien que les organoïdes soient plus grands et donc plus foncés au fil du temps, les structures neurales en forme de rosette se sont développées, ce qui indique l’initiation de la différenciation neuronale et contient des caractéristiques du tube neural embryonnaire.

Pour examiner plus en profondeur l’expression des gènes dans les cellules, une analyse qPCR a été effectuée. Le transporteur de glutamate VLGUT1 a été exprimé à deux semaines et demie, a augmenté à cinq semaines, et est resté cohérent par cinq mois de culture. Un marqueur de cerveau antérieur Foxg1 a été exprimé à de faibles niveaux jusqu’à cinq semaines dans la culture.

Le marqueur de couche profonde Tbr1 a culminé environ cinq semaines et a diminué par la suite. Alors que l’expression du marqueur de la couche supérieure Satb2, le marqueur ventral Eng1, le marqueur de la moelle épinière hindbrain Hoxb4, ainsi que le marqueur oligodendrocyte Olig2 ont tous augmenté au fil du temps. En revanche, le marqueur de cellules souches Sox2 a diminué au fil du temps.

Le marqueur glial GFAP a culminé à cinq semaines et est resté relativement constant par la suite. N’oubliez pas de prendre le plus grand soin lors de la manipulation des cellules ES dans les organoïdes à un stade précoce pour éviter la contamination car ils sont cultivés sans antibiotiques et n’oubliez pas de se nourrir selon le calendrier. Après cette procédure, vous pouvez évaluer les organoïdes à l’aide de techniques telles que rt-PCR quantitative pour l’expression des gènes et l’immunofluorescence pour l’expression des protéines et la localisation.

En utilisant cette technique, nous avons pu étudier la capacité d’une petite molécule pour soulager des aspects des dommages hypoxiques néonatals humains comme modélisé dans une chambre d’hypoxie. Il est significatif que ces organoïdes humains de cerveau se sont comportés de la même manière aux expériences in vivo de souris.