In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Complexe de tissus multicellulaires, ce protocole reconstitue la conduite cellulaire d’une manière simplifiée. Une chose est cette technique pour étudier les relations directes entre les protons de conducteur cellulaire et la réponse cellulaire. Ce protocole utilise des perles de polystyrène chimiquement fonctionnelles pour reconstituer les protons du conducteur cellulaire.

Les perles peuvent être coupées avec n’importe quel proton d’intérêt, pour tester leurs effets sur la réponse cellulaire. Nous avons utilisé cette méthode dans C-Elegance sur les embryons de souris. Par conséquent, ce protocole peut être droit aux études des organismes larges.

Comme les embryons sont fragiles après un traitement à haute teneur en chlorite, une pratique importante est nécessaire avant de pouvoir isoler avec succès le blastoméome. La démonstration visuelle fournira une meilleure compréhension de la façon dont on devrait gérer capillaire pendant les méthodes d’isolation blastomere. Pour commencer, pesez 10 milligrammes de perles de polystyrène modifiées carboxylate dans un tube de micro centrifugeuse de 1,5 millimètre.

Ajouter un milli litre de tampon MES dans le tube pour le laver. Vortex le tube pour mélanger les perles. Faites tourner le tube pendant 60 secondes à 2000XG via une centrifugeuse à banc.

Dicard le supernatant en pipetting soigneusement le tampon. Lavez les perles à nouveau avec un milli litre de tampon MES. Après le lavage, ajouter un millimètre de tampon MES contenant 10 milligrammes d’EDAC dans le tube, pour activer les groupes de carboxyl de surface.

Vortex le tube pour mélanger les perles. Faire pivoter et incuber le tube pendant 15 minutes à température ambiante. Faites tourner les perles pendant 60 secondes à 2000XG.

Jetez le supernatant en pippetting soigneusement le tampon, et laver avec un milli-litre de PBS. Vortex le tube pour mélanger les perles et répéter le lavage PBS une fois de plus. Préparez un millimètre d’une, 10, 100, et mille fois série de dilution de Rhodamine Red-X de la solution de stock Rhodamine Red-X de 0,65 millimètre Rhodamine Red-X.

Pippette 20 micro-litres de perles dans chaque tube de dilution en série. Faire pivoter et incuber les tubes pendant cinq minutes à température ambiante. Laver les perles deux fois avec un milli litre de PBS.

Après le lavage, ajouter un milli litre de PBS dans les tubes et les conserver à quatre degrés Celsius jusqu’à six semaines. Vérifiez l’intensité de fluorescence des perles au microscope utilisé pour l’imagerie en direct. Tenez chaque extrémité d’un micro-capillaire à une capacité de 10 micro-litres avec main droite et gauche.

Tirez le micro-capillaire vers les deux extrémités pour appliquer la tension et amener le centre du capillaire sur un brûleur pour faire deux capillaires tirés à la main. Sous le microscope disséquant, couper les extrémités des capillaires tirés à la main avec des forceps. Faites les deux tailles d’ouverture de pointe approximativement deux fois, et une fois la courte longueur d’accès des embryons de C-Elegance pour le transfert d’embryon et l’enlèvement de coquille d’oeuf respectivement.

Attachez le capillaire tiré dans un appareil de pippetting de bouche. Pippette 45 micro-litres de sels d’oeufs solution sur un puits d’une diapositive multi-puits. Placez cinq à 10 adultes C-Elegance sur le puits.

Pour obtenir les premiers embryons C-Elegance couper les adultes en morceaux en plaçant deux aiguilles à droite et à gauche du corps de C-Elegance, et glisser les aiguilles les uns après les autres. Pippette 45 micro-litres de solution hypochlorite sur un puits à côté du puits contenant la solution oeuf-sel et pippette 45 micro-litres de Shelton’s Growth Medium sur les trois puits suivants. Transférer un stade cellulaire et les embryons précoces à deux stades cellulaires dans la solution hypochlorite par la pippette buccae avec l’ouverture de plus grande taille et attendre 40 à 55 secondes.

Lavez les embryons en les transférant dans les trois puits suivants avec le milieu de croissance de Shelton. Avec une à deux secondes dans chacun des deux premiers puits. À l’aide du capillaire dessiné à la main avec l’ouverture de plus petite taille, répéter soigneusement le pippetting de l’embryon pour l’enlèvement de coquille d’œuf.

Après cela, pippette continuellement avec le capillaire dessiné à la main pour séparer les blastomères embryonnaires de stade à deux cellules. Après l’ablation de la coquille d’œuf, réduisez au minimum la force de pippetting les embryons de haut en bas pour empêcher l’éclatement. Préparez une chambre d’imagerie en plaçant un coverslip sur un support de coverslip et collez les bords du coverslip pour le stabalize.

Retournez le support de coverslip, et dessinez un cercle sur le coverslip avec un stylo hydrophobe. Ajoutez le milieu de croissance de Shelton dans le cercle dessiné par le marqueur hydrophobe, et transférez le blastomere isolé à la chambre d’imagerie dans le cercle. Maintenant, distribuez un petit volume des perles chimiquement fonctionnalisées sur le coverslip utilisant le capillaire dessiné à la main avec la plus grande ouverture.

Contrôlez la position des perles en soufflant dans le capillaire dessiné à la main jusqu’à ce que les perles s’attachent au blastomere isolé. Montez le coverslip pour éviter l’évaporation du milieu et effectuez l’imagerie en direct à l’aide d’un microscope inversé. Dans cette étude, le signal fluorescent de la perle traitée avec 0.005 microgrammes par milli-litre Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester pour la souche transgénique exprimant GFP miosin-2 et M-cherihistone était trop faible.

D’autre part, le signal fluorescent des perles traitées avec cinq microgrammes par millimètre Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester était trop fort. La concentration de Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester à 0,5 microgramme par millimètre était optimale pour cette souche transgénique particulière. Au cours de l’imagerie en direct, un avion a été identifié où deux centrosomes étaient alignés verticalement.

L’avion avec un angle de plus ou moins 90 degrés de ce plan est un avion à fuseaux. L’angle d’orientation du fuseau par rapport à l’interface de contact cellule/perle après la cytokinesis montre que les deux cellules de fille ont été attachées à la perle dans une ligne qui passe les deux vues de contact a été employée comme orientation de contact. Il faut apprendre comment les embryons et la coquille d’œuf réagissent à certaines forces externes appliquées par la pippette buccae.

Théoriquement, n’importe quelle réponse cellulaire peut être étudiée, par exemple, la spécification de sulfate peut être étudiée par des cellules de culture et le contact avec des perles adhésives sur de plus longues durées. Cette technique a été utilisée pour comprendre le mécanisme d’orientation de la division cellulaire dépendante du contact. Le filtre de PTF a été employé pour empêcher l’inhalation des vapeurs de solution d’hypochlorite par la pippette de bouche.