Name: Fractionnement subcellulaire des cellules de leucémie lymphocytique chronique primaire pour surveiller le trafic de protéines nucléaires/cytoplasmiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Apprenez le fractionnement nucléaire et cytoplasmique des cellules de leucémie lymphocytique chronique pour étudier le trafic des protéines. Cette méthode permet d'analyser la localisation des protéines après traitement.

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Les auteurs tenons à remercier la Dre Natasha Malik d'avoir examiné de façon critique le manuscrit. Cette étude a été financée par une subvention de projet Bloodwise accordée à l'AMM (18003). Les installations d'analyse facÉAd ont été financées par la Fondation Howat. MWM a été financé par un doctorat des Amis du Centre de recherche sur la leucémie Paul O'Gorman, JC a été financé par le Centre de recherche sur la leucémie des Amis de Paul O'Gorman et JH a été financé par une subvention de projet Bloodwise (18003).

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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Le protocole décrit fournit une méthode rapide et efficace pour la génération de fractions nucléaires et cytoplasmiques à partir de cellules CLL primaires, et la quantification subséquente du trafic de protéines entre les fractions nucléaires et cytoplasmiques lors de la stimulation cellulaire traitement de la toxicomanie. Les données présentées démontrent la capacité de détecter le trafic de protéines spécifiques, par exemple, FOXO1, entre les fractions nucléaires et cytoplasmiques, sur traitement avec un inhibiteur de mTOR double AZD8055 en présence/absence de BCR reliant flà/flandage par F( ab')2 stimulation de fragment(figure 3 et figure 4). Le couplage de ces expériences avec la quantification des taches occidentales à partir d'échantillons individuels de patients atteints de LCL permet d'analyser objectivement les données générées et démontre la robustesse de l'analyse décrite pour quantifier les changements globaux dans la localisation des protéines Cellules CLL isolées dans des cohortes de patients (figure 4). Il ressort clairement des données qu'une moyenne de cinq échantillons de patients dans les fractions cytoplasmiques a atteint une importance proche. Étant donné l'hétérogénéité clinique des patients atteints deLCL 11, ces analyses seraient normalement effectuées sur de plus grandes cohortes de patients, et/ou axées sur des sous-groupes pronostiques spécifiques de patients afin d'acquérir une meilleure compréhension de la réponse cellulaire de CLL aux traitements médicamenteux spécifiques.
Les données présentées démontrent l'importance de choisir des marqueurs protéiques qui résident exclusivement dans les fractions cytoplasmiques ou nucléaires, car la pureté de la fractionnement sera confirmée par ces marqueurs. La tubuline a été choisie pour la confirmation de fraction cytoplasmique, et Lamin A/C comme marqueur nucléaire. D'autres protéines couramment utilisées sont GAPDH et 'tubulin pour identifier la fraction cytoplasmique ou Brg1 (SMARCA4), TFIID et RNA Polymerase II pour la pureté des fractions nucléaires4,5. Cependant, il faut faire attention au choix de protéines qui sont fortement enrichies en fractions spécifiques et qui ne sont pas présentes dans les deux fractions (p. ex., la tubuline) (figure 2C)9. En effet, GAPDH et actine bien que généralement considérés comme des protéines cytoplasmiques peuvent se localiser au noyau12,13, soulignant l'importance de choisir un marqueur de fraction qui ne se déplace pas lorsque la stimulation ou le traitement est appliquées sur les cellules. En outre, il est important de confirmer que le marqueur protéique choisi est exprimé dans la cellule d'intérêt en exécutant le WCL aux côtés des fractionnements subcellulaires.
Dans l'expérience représentative montrée, le même nombre de cellules de CLL a été employé pour chaque condition (stimulation/traitement de drogue), et par la suite les échantillons de fractionnement ont été préparés immédiatement. Le chargement de 10 g de protéines/voies fractionnée fournit suffisamment de matériel pour la détection des protéines d'intérêt. Comme ces échantillons n'ont subi qu'un traitement médicamenteux et une stimulation à court terme (jusqu'à 4 h), on a supposé que le niveau de protéines resterait le même dans chaque échantillon, et un test de protéines n'a pas été effectué. Cependant, si les traitements cellulaires sont prolongés (18 - 72 h), le niveau de mort cellulaire ou de prolifération dans les cellules peut modifier considérablement la qualité et la quantité de protéines extraites, dépendant de la stimulation médicamenteuse/cellulaire appliquée, modifiant ainsi les niveaux de protéines dans le traitement /échantillons stimulés. Dans ces cas pour les traitements médicamenteux à plus long terme, il est conseillé d'effectuer la quantification des protéines à l'aide d'un essai Bradford ou équivalent, avant le ballonnement occidental pour s'assurer que la même quantité de protéines est exécuté dans chaque voie de l'immunoblot. La présence de détergents peut interférer avec des analyses de protéines spécifiques14,cette interférence peut être réduite en diluant des échantillons de protéines de fraction cellulaire. En outre, utilisez le tampon de lyse complète comme le blanc, en utilisant la même dilution que dans les échantillons testés.
Pour fournir des preuves à l'appui des résultats décrits ici, des expériences parallèles pourraient être effectuées à l'aide de la microscopie de fluorescence pour analyser l'emplacement de FOXO1 dans les cellules CLL pour permettre la visualisation de ces résultats5. En outre, les fractions subcellulaires générées peuvent également être utilisées pour des analyses d'activité enzymatiques ou des analyses protéomiques dans d'autres analyses en aval.

Le transport des macromolécules entre le noyau et le cytoplasme a longtemps été établi pour jouer un rôle clé dans la fonction cellulaire normale et est souvent déréglementé dans les cellules cancéreuses1,2. Une telle déréglementation peut résulter de la surexpression/mutation des protéines qui contrôlent l'exportation nucléaire. Une telle protéine Exportin-1 (XPO1), est un récepteur de transport qui exporte des protéines contenant des signaux d'exportation nucléaire (NES) dans le cytoplasme du noyau2. XPO1-cargos comprennent p53, les membres de la famille FOXO et l'IB, contribuant à leur inactivation en inhibant leur mécanisme d'action1,2,3. D'autres erreurs de localisation des protéines peuvent se produire lorsque des signaux microenvironnementaux empiètent sur les cellules cancéreuses, ce qui entraîne l'activation de voies de signalisation intracellulaires telles que la voie phosphatidyl-inositol-3-kinase (PI3K)/Akt, l'inactivation des membres de la famille FOXO et l'exportation subséquente du noyau4,5. Une telle mauvaise localisation des protéines suppressrices de tumeur a été impliquée dans la progression d'un certain nombre de tumeurs hématologiques et solides1,2,6.
Le développement d'inhibiteurs de petites molécules pour une utilisation clinique dans les malignités hématologiques (leucémie myéloïde aigue (LAAm)/CLL), qui se lient à la fonction XPO1 et inhibent sélectivement, souligne l'importance de mettre au point des techniques appropriées pour l'impact des agents pharmacologiques sur l'enfermant des protéines entre lescompartimentsnucléaire et cytoplasmique 6,7,8. Les techniques d'imagerie ont progressé de manière significative permettant l'identification des protéines dans les compartiments subcellulaires sur la stimulation externe des traitements médicamenteux, cependant, l'importance de techniques parallèles robustes et de soutien est essentielle pour fiable informer un public scientifique de la validité d'un résultat.
Les lymphocytes au repos et les cellules cLL-B malignes isolées des échantillons de sang des patients représentent un défi dans la génération de fractions nucléaires et cytoplasmiques dues au rapport nucléaire élevé : cytoplasmique. L'optimisation des conditions expérimentales pour générer des données expérimentales robustes et fiables est bien sûr essentielle afin de planifier de futurs programmes expérimentaux. La méthode décrite ici permet de quantifier les protéines dans les fractions nucléaires et cytoplasmiques et détermine comment ces protéines peuvent être affectées par la stimulation cellulaire et / ou le traitement médicamenteux.

<table><tbody><tr><td>Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL</td><td>Griener Bio one</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur</td><td>Griener Bio one</td><td>612398</td><td></td></tr><tr><td>Tubes FACS de 12 mm x 75 mm</td><td>Elkay</td><td>2052-004</td><td></td></tr><tr><td>Tube de 15 mL</td><td>Griener Bio one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>de 50 mL Tube</td><td>Griener Bio one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-CD5 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555352</td><td>marqueur de surface phénotypique</td></tr><tr><td>anti-CD19 Anticorps PE Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557835</td><td>marqueur de surface phénotypique</td></tr><tr><td>anti-CD23 Anticorps APC</td><td>BD Biosciences</td><td>558690</td><td>marqueur de surface phénotypique</td></tr><tr><td>anti-CD45 Anticorps APC Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557833</td><td>marqueur de surface phénotypique</td></tr><tr><td>anti-&bêta ;-Tubuline Anticorps</td><td>Cell Signalisation</td><td>2146</td><td>Marqueur cytoplasmique</td></tr><tr><td>anti-&gamma ;-Tubuline Anticorps de souris (clone GTU-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5326</td><td></td></tr><tr><td>anti-FoxO1 (C29H4) Anticorps de lapin</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>2880</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-lamin A/C</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>2032</td><td>Marqueur nucléaire</td></tr><tr><td>anti-IgG de souris, Anticorps lié à HRP</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>7076</td><td>Anticorps secondaire</td></tr>, <tr><td>anticorps anti-lapin, IgG, anticorps liés à HRP,</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>7074</td>, <td>Anticorps secondaire</td></tr>, <tr><td>anti-Rpb1, Anticorps CTD (clone 4H8)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>2629</td><td>Marqueur nucléaire</td></tr><tr><td>BDFACS Canto II</td>, <td>BD Biosciences</td><td>Sur demande</td><td>Cytomètre</td></tr><tr><td>en flux DAPI Solution BD</td><td>Biosciences</td><td>564907</td><td>discriminateur vivant/mort</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin</td><td>Serum Thermofisher</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Histopaque1077 gradient de densité milieu</td><td>Sigma</td><td>H8889</td><td></td></tr><tr><td>HyperPAGE 10 - 190 kDa marqueur protéique</td><td>Bioline</td><td>BIO-33066</td><td>Moléculaire marqueur</td></tr><tr><td>de poids Image Studio Lite (version 5.2.5)</td><td>LI-COR</td><td>www.licor.com</td><td>Software</td></tr><tr><td>Labnet VX100</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Vortex</td></tr><tr><td>Nucelar Extract Kit</td><td>Active Motif</td><td>40010</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>Thermofisher</td><td>01-111-42</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Thermofisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus Échelle de protéines précolorées</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26619</td><td>Marqueur de poids moléculaire</td></tr><tr><td>Comprimés PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep Enrichissement des cellules B humaines Cocktail</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15064</td><td></td></tr><tr><td>Sigma 3-16P</td><td>SciQuip</td><td></td><td>Centrifugeuse</td></tr><tr><td>Sigma 1-15PK</td><td>SciQuip</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr></tbody></table>

fractionnement subcellulaire des cellules de leucémie lymphocytique chronique primaire pour surveiller le trafic de protéines nucléaires/cytoplasmiques

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

L'exportation nucléaire de macromolécules est souvent déréglementée dans les cellules cancéreuses. Les protéines suppressrices de tumeurs, telles que p53, peuvent être rendues inactives en raison de la localisation cellulaire aberrante perturbant leur mécanisme d'action. La survie des cellules lymphocytiques chroniques de leucémie (LCL), entre autres cellules cancéreuses, est facilitée par la déréglementation de l'encrassement nucléaire à cytoplasmique, au moins en partie grâce à la déréglementation du récepteur de transport XPO1 et à l'activation constitutive de Voies de signalisation médiées par PI3K. Il est essentiel de comprendre le rôle des protéines individuelles dans le contexte de leur emplacement intracellulaire pour acquérir une compréhension plus profonde du rôle de ces protéines dans la pathobiologie de la maladie. En outre, l'identification des processus qui sous-tendent la stimulation cellulaire et le mécanisme d'action d'inhibiteurs pharmacologiques spécifiques, dans le contexte du trafic de protéines sous-cellulaires, fournira une compréhension plus complète du mécanisme de action. Le protocole décrit ici permet l'optimisation et la génération efficace subséquente de fractions nucléaires et cytoplasmiques à partir de cellules lymphocytiques chroniques primaires. Ces fractions peuvent être utilisées pour déterminer les changements dans le trafic de protéines entre les fractions nucléaires et cytoplasmiques lors de la stimulation cellulaire et le traitement médicamenteux. Les données peuvent être quantifiées et présentées en parallèle avec des images immunofluorescentes, fournissant ainsi des données robustes et quantifiables.

Lors de la planification d'expériences sur les cellules CLL primaires, si les essais nécessitent un grand nombre de cellules (50 x 106 cellules), il ya une préférence pour utiliser des cellules CLL fraîchement isolées, plutôt que des cellules cryoconservées qui nécessitent la décongélation, mais ce n'est pas toujours possible. C'est parce que le processus de gel/dégel peut entraîner la mort de jusqu'à 50% des cellules CLL, bien que cela dépende de l'échantillon. L'enrichissement des cellules CLL avec un COE 40 x 106/mL en utilisant la centrifugation de densité tel que décrit ici (étapes 1.3 - 1.5) permet une récupération cellulaire élevée avec une haute pureté (-95%) cellules CLL primaires. Dans l'échantillon montré, le COE 177 x 106/mL : à partir d'un échantillon sanguin de 30 ml, 5 x 109 cellules ont été récupérées, ce qui représente un rendement cellulaire de 94 % du total des cellules. L'analyse de cet échantillon par cytométrie de flux a révélé une pureté des cellules CLL de 'gt;95% comme indiqué par l'expression double surface des marqueurs de cellules CLL CD19 et CD5 après gating sur FSC/SSC, cellules simples qui étaient DAPI négatif (cellules viables) (Figure 1).
L'optimisation de la procédure de fractionnement subcellulaire a été effectuée à l'aide d'une gamme de rapports de détergent (1:20 à 1:60) pendant la préparation de la fraction cytoplasmique (étape 3.4). Par la suite, les fractions nucléaires et les LCM ont été préparées (étapes 3,5 et 3,6 respectivement). Des immunoblots ont été exécutés sur les fractions résultantes de la lignée cellulaire cLL MEC1 (figure 2A) et des cellules cLL primaires (figure 2B). Les taches ont été sondées pour les marqueurs de fraction Lamin A/C (nucléaire ; 74/63 kDa) et '-tubulin (cytoplasmique ; 55 kDa) pour confirmer la fractionnement réussi de cellules. La fractionnement indique que le niveau optimal de détergent pour les cellules MEC1 est une dilution de 1:60 (figure 2A), par rapport à une dilution de 1:30 étant optimale pour les cellules CLL primaires (figure 2B), comme indiqué par un enrichissement de protéine nucléaire et un manque de protéines cytoplasmiques dans les fractions et vice versa. Les WCL représentent la protéine totale et agissent comme un contrôle positif pour les anticorps utilisés pour sonder les fractions subcellulaires. Il est important de choisir les protéines appropriées comme marqueurs de fractions : La figure 2C montre que les immunoblots de fractions nucléaires/cytoplasmiques préparées à partir de cellules MEC1 dans lesquelles la polymérase II d'ARN (Rpb1 CTD ; 250 kDa) et Lamin A/C ont été effacés comme marqueurs de les fractions nucléaires, tandis que la tubuline et la tubuline (50 kDa) ont été utilisées comme marqueurs cytoplasmiques. Il est clair que la tubuline est enrichie dans le cytoplasme mais l'expression est évidente dans le noyau, comme indiqué précédemment9.
Une fois que les conditions expérimentales sont optimisées, une expérience peut être effectuée. Dans les exemples montrés, la localisation subcellulaire de FOXO1 dans les fractions nucléaires et cytoplasmiques a été déterminée sur la stimulation des cellules avec le récepteur d'antigène de cellules B (BCR) en présence ou en absence de l'inhibiteur dual mTORC1/2 AZD8055, dans les cellules MEC1 ( Figure 3A) et cellules CLL primaires ( Figure3B)5,10. Dans les deux exemples, la génération de fractions nucléaires et cytoplasmiques hautement enrichies a été réalisée comme indiqué par l'expression presque exclusive de Lamin dans la fraction nucléaire et de la tubuline dans les fractions cytoplasmiques. Dans les deux types de cellules, l'expression FOXO1 a été réduite dans le cytoplasme après traitement avec AZD8055 par rapport à NDC, accompagnée d'une augmentation de l'expression FOXO1 dans le compartiment nucléaire, démontrant ainsi la translocation des protéines (figure 3). Pour enlever la subjectivité de l'interprétation de données, les immunoblots individuels de cinq échantillons principaux de CLL ont été quantifiés dans les fractions subcellulaires (étape 4 ; Figure 4A), en utilisant les protéines nucléaires ou cytoplasmiques respectives comme contrôles de chargement interne pour chaque échantillon, puis en normalisant chaque fraction pour le contrôle non stimulé (US) sans contrôle des médicaments (NDC), comme indiqué. Le graphique qui en résulte montre les tendances du mouvement FOXO1 entre les fractions nucléaires et cytoplasmiques, avec AZD8055 réduisant les niveaux d'expression FOXO1 dans le cytoplasme, tout en augmentant simultanément l'expression dans le noyau. En outre, une élévation dans l'expression cytoplasmique DE l'ONÉ1 est évidente sur le rattachement du BCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tube</td>
			<td>Nom du tube</td>
			<td>Cellules/perles</td>
			<td>antigène</td>
			<td>Fluorophore</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Non taché</td>
			<td>Cellules</td>
			<td>Na</td>
			<td>Na</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Tache unique</td>
			<td>Perles</td>
			<td>CD5 (en)</td>
			<td>Fitc</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Tache unique</td>
			<td>Perles</td>
			<td>CD19 (en)</td>
			<td>PE-Cy7 (en)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Tache unique</td>
			<td>Perles</td>
			<td>CD23 (en)</td>
			<td>Apc</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Tache unique</td>
			<td>Perles</td>
			<td>CD45 (en)</td>
			<td>APC-Cy7 (en anglais seulement)</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>Tache unique</td>
			<td>Cellules</td>
			<td>viabilité</td>
			<td>Dapi</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>CLL Tache</td>
			<td>Cellules</td>
			<td>CD5, CD19, CD23, CD45 et viabilité</td>
			<td>FITC, PE-Cy7, APC, APC-Cy7 et DAPI</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Tableau montrant l'ensemble idéal de tubes d'échantillon requis pour la cytométrie d'écoulement des cellules CLL. Chaque expérience doit inclure tous les contrôles appropriés pour une analyse précise des résultats obtenus.
<img alt="Graphiques de cytométrie en flux montrant les marqueurs de CD, l’identification des lymphocytes et l’analyse de la population cellulaire." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60426/60426fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : Parcelle représentative d'analyse de cytométrie de flux des patients enrichis de CLL. Les cellules mononucléaires-CLL enrichies du sang périphérique d'un patient individuel de CLL ont été fermées utilisant FSC-A contre SSC-A, et les doublets ont alors été exclus utilisant FSC-A contre FSC-H (A). Des cellules non tachées (tube 1) et des contrôles de compensation (tubes 2-6) ont été utilisés pour installer le cytomètre d'écoulement pour détecter les cellules et compenser entre les canaux fluorescents, assurant ainsi que les signaux de fluorescence ont été détectés correctement. (B) Exemple de coloration négative (cellules non tachées; tube 1) dans les canaux de fluorescence CD19 et CD5. Les cellules positives vivantes (DAPI négatives) et CD45 ont été fermées (C) et la proportion de CD19etCD5 (95,5 %) et CD19etCD23 (91,2%) cellules au sein de la population DAPI-CD45a été déterminée (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60426/60426fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Diagramme d’analyse par transfert de Western ; localisation des protéines dans les fractions nucléaires/cytoplasmiques ; Lammine, Tubuline, Rpb1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60426/60426fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 : Optimisation de la fractionnement nucléaire/cytoplasmique. Des fractions cytoplasmiques et nucléaires, et des lysates de cellules entières (WCL), ont été préparés à partir de granulés cellulaires (10 à 20 x 106 cellules) de la lignée cellulaire CLL (A) MEC1 ou (B) cellules CLL primaires enrichies du sang périphérique des patients tel que décrit dans Étape 3. L'optimisation de la fractionnement subcellulaire a été effectuée en utilisant une gamme de rapports de détergent (1:20 à 1:60) lors de la préparation de la fraction cytoplasmique (comme décrit à l'étape 3.4). Les échantillons résultants ont été immunoblotted et sondés avec des anticorps anti-Lamin A/C (nucléaires) et anti-tubulin (cytoplasmique) pour confirmer la fractionnement réussi de cellules aux côtés de WCL. Les marqueurs de poids moléculaires sont indiqués à gauche de la tache (M). indique les conditions détergentes optimales pour la lyse cellulaire. (C) Immunoblot des fractions nucléaires et cytoplasmiques des cellules MEC1 avec des conditions de contrôle (NDC) ou un traitement médicamenteux (8055) en présence de l'absence de stimulation (md ou - BCR crosslinking respectivement). Des blots ont été sondés avec des anticorps anti-Rbp1 CTD (clone 4H8 ; reconnaissant la polymérase d'ARN II b1), anti-Lamin A/C, anti-tubulin ou anti-tubulin (clone GTU-88) anticorps, pour identifier des fractions subcellulaires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60426/60426fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Analyse par transfert Western, localisation des protéines nucléaires et cytoplasmiques, BCR, FOXO1, Lamin, β-tubuline." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60426/60426fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 : La fractionnement subcellulaire démontre l'enfermant de FOXO1 entre le noyau et le cytoplasme dans CLL. (A) mec-1 et (B) cellules cLL primaires ont été pré-traités pendant 30 min avec 100 nM AZD8055 (8055) ou laissés non traités (NDC) comme indiqué et puis BCR a été ligated pendant 1 h ou à gauche des ÉTATS-Unis. Des fractions nucléaires et cytoplasmiques ont alors été préparées et immunoblotted. Après confirmation de fractionnement en sondant avec des anticorps anti-Lamin A/C (nucléaire) et anti-tubulin (cytoplasmique), l'effet du traitement médicamenteux et de la ligature de BCR a été évalué sur l'expression de protéine DE FOXO1, utilisant un anticorps anti-FOXO1. M indique le marqueur de poids moléculaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60426/60426fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Analyse de l’expression des protéines, immunotransfert FOXO1, résultats de densitométrie ; Expérience, cytoplasmique vs nucléaire." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60426/60426fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4 : Exemple travaillé d'analyse quantitative de tache occidentale (densitométrie). (A) La densitométrie a été réalisée à l'aide du logiciel d'analyse western blot disponible en ligne. En bref, à l'intérieur du ruban d'analyse, des rectangles ont été dessinés autour de bandes protéiques dans l'image pour calculer l'intensité du signal. La densitométrie d'une image occidentale représentative d'un échantillon de patient de CLL qui a subi la fractionnement cytoplasmique/nucléaire est dépeinte. Les fractions cytoplasmiques et nucléaires se distinguent par l'expression des marqueurs cytoplasmiques (tubuline) et nucléaires (Lamin A/C). L'expression normalisée de FOXO1 pour une condition donnée peut être calculée en divisant le signal obtenu pour FOXO1 par le signal correspondant pour 'Tubulin ou Lamin A/C, selon la fraction analysée. L'expression relative FOXO1 (par rapport au contrôle du véhicule américain) peut être calculée en divisant l'expression NORMALISÉe DE FOXO1 d'une condition donnée par l'expression FOXO1 normalisée du contrôle du véhicule américain d'une fraction cellulaire donnée. (B) Graphique montrant les niveaux d'expression FOXO1 dans les fractions cytoplasmiques (gauche) ou nucléaires (droite) normalisées au contrôle US-NDC dans chaque fraction cellulaire. Le point rouge sur le graphique est l'exemple travaillé montré. Ces données montrent que le changement moyen de pli dans l'expression FOXO1 par rapport aux valeurs US-NDC - SEM. P ont été déterminés par le test t apparié des étudiants à deux queues. n - 5 échantillons individuels de patients CLL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60426/60426fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Ce protocole permet l'optimisation et la production efficace subséquente de fractions nucléaires et cytoplasmiques à partir de cellules lymphocytiques chroniques primaires. Ces échantillons sont utilisés pour déterminer la localisation des protéines ainsi que les changements dans le trafic de protéines qui ont lieu entre les compartiments nucléaire et cytoplasmique lors de la stimulation cellulaire et le traitement médicamenteux.

Fractionnement subcellulaire des cellules de leucémie lymphocytique chronique primaire pour surveiller le trafic de protéines nucléaires/cytoplasmiques

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Il est essentiel de mettre au point des techniques pour étudier le transport des macromolécules entre le noyau et le cytoplasme, et d’identifier la mauvaise localisation des protéines suppressrices tumorales pour mieux comprendre la pathogénie de la LLC et aider au développement de nouvelles thérapies. Ce protocole fournit une méthode rapide et efficace pour produire des fractions nucléaires et cytoplasmiques à partir de cellules CLL primaires. Ces fractions peuvent être utilisées dans des expériences en aval, y compris les analyses d’activité enzymatique, l’analyse protéomique et le ballonnement occidental.Cette technique élargira notre compréhension de la façon dont les thérapies et les signaux micro-environnementaux dans les tumeurs modifient le shuttling des protéines entre le noyau et le cytoplasme dans les cellules de CLL et potentiellement d’autres malignités de cellules B. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer l’emplacement des protéines et/ou attirer le mouvement des protéines, le cas échéant. Effectuez un gradient de détergent sur chaque lignée cellulaire que vous prévoyez utiliser pour assurer la génération optimale de fractions nucléaires et cytoplasmiques hautement enrichies.Aux côtés de Jodie Hay et Michael Moles, jennifer Cassels, technicienne de mon laboratoire, démontrera cette procédure. Obtenir des échantillons de sang périphériques auprès de patients atteints de leucémie lymphoïde chronique précédemment consentie dans des tubes de collecte de sang EDTA, accompagnés du nombre de globules blancs. Les échantillons de sang humains doivent être considérés comme dangereux car ils contiennent potentiellement des virus transmissibles par le sang.Veuillez vous assurer que ces échantillons sont manipulés dans une armoire de biosécurité de classe deux et que l’utilisateur porte un manteau de laboratoire et des gants en tout temps. Éliminer les matières contaminées par le sang dans les désinfectants. Si le nombre de globules blancs est égal ou supérieur à 40 millions de cellules par millilitre, diluer l’échantillon à un rapport d’un pour un avec rt CLL tampon de lavage.Puis aliquot RT gradient de densité moyenne dans un tube de centrifugeuse conique de taille appropriée pour l’échantillon. Superposer délicatement l’échantillon sur le dessus du milieu et la centrifugeuse à 400 x g pendant 30 minutes à RT. À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, récoltez doucement la couche blanche de cellules mononucléaires qui se sont accumulées à l’interface du milieu de gradient de densité dans le tampon de lavage CLL. Transférer ce monocouche isolé dans un tube de centrifugeuse conique de 50 millilitres frais.Pour laver les cellules, ajouter 40 millilitres de tampon de lavage CLL à cette monomeuse et centrifugeuse à 300 x g pendant 10 minutes à température ambiante. Jetez le supernatant, feuilletez le fond du tube pour suspendre à nouveau la pastille, et répétez ce lavage. Jetez le supernatant, feuilletez à nouveau le fond du tube, puis suspendez la pastille cellulaire dans un volume défini de tampon de lavage CLL selon la taille de la pastille.Après avoir compté les cellules et après la cytométrie d’écoulement pour vérifier la pureté cellulaire, placez les cellules dans des plaques de culture tissulaire à la densité cellulaire requise prête pour la stimulation ou le traitement médicamenteux. Après la stimulation et/ou le traitement médicamenteux, l’incubation est terminée. Transférer les cellules dans des tubes de microfuge et des granulés de 1,5 millilitre étiquetés individuellement en centrifugant à 200 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Après avoir jeté le supernatant, suspendez la pastille cellulaire dans un millilitre de PBS glacé avec des inhibiteurs de phosphatase. Centrifugeuse à 200 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnatant et gardez ces granulés d’extrait de cellules entières sur la glace pour d’autres préparations.Pour préparer les fractions cytoplasmiques, suspendez doucement les granulés cellulaires dans 50 microlitres de tampon hypertonique 1x. Pour permettre aux cellules de gonfler, incubez-les sur la glace pendant 15 minutes. Après avoir effectué un gradient détergent pour déterminer la concentration optimale de détergent à utiliser pour un type de cellule spécifique, ajouter 0,8 à 2,5 microlitres de détergent dans chaque échantillon et vortex sur le réglage le plus élevé pendant 10 secondes.Pour vérifier la lyse cellulaire, observez les cellules sous un microscope à contraste de phase avant et après l’ajout de détergent. Toutes les cellules ont un noyau dense et sombre entouré par le cytoplasme qui apparaît comme un halo lumineux. Une fois lysés, centrifuger les échantillons à 14 000 x g pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius.Soigneusement, sans déranger la pastille, transférer le supernatant dans un tube de microfuge étiqueté pré-réfrigéré et conserver cette fraction cytoplasmique à 80 degrés Celsius jusqu’à une analyse plus approfondie. Assurer l’élimination complète de la fraction cytoplasmique pour éviter la contamination de la fraction nucléaire. À la pastille restante, qui contient la fraction nucléaire, ajouter 50 microlitres de tampon de lyse complète et re-suspendre par pipetting de haut en bas.Pour solubiliser les protéines associées à la membrane nucléaire, ajouter 2,5 microlitres de détergent, vortex sur le réglage le plus élevé pendant 10 secondes, et incuber sur la glace pendant 30 minutes. Vortex sur le réglage le plus élevé pendant 30 secondes et centrifugeuse. Ensuite, transférez le supernatant dans un tube de microfuge étiqueté pré-réfrigéré et conservez cette fraction nucléaire à 80 degrés Celsius jusqu’à une analyse plus approfondie.Pour les lysates de cellules entières, suspendre à nouveau les granulés d’extrait de cellules entières dans 100 microlitres de tampon de lyse complète par pipetting de haut en bas. Pour assurer une lyse cellulaire complète, ajouter cinq microlitres de détergent et incuber sur la glace pendant 30 minutes. Vortex sur le réglage le plus élevé pendant 30 secondes, puis centrifugeuse à 14 000 x g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.Transférer le supernatant dans un tube de microfuge pré-réfrigéré et conserver toute cette cellule lysate à 80 degrés Celsius jusqu’à une analyse plus approfondie. Pour quantifier le trafic de protéines entre les fractions nucléaires et cytoplasmiques, effectuez une analyse quantitative des taches occidentales et importez les images. Pour afficher l’image dans le ruban image, cliquez sur le bouton Choisir dans le groupe Display et cliquez sur Chemi Channel.Le dialogue Choose Display s’ouvrira pour permettre d’autres ajustements si nécessaire. Implémentez des améliorations supplémentaires à l’aide des curseurs réglables sur l’onglet de l’image LUT, y compris la luminosité ou le contraste. Utilisez l’onglet Courbes pour des réglages plus fins.Pour l’analyse des données, cliquez d’abord sur le ruban Analyse. Pour analyser un seul canal, désélectionner les canaux qui ne sont pas analysés en cliquant sur la vignette Don’t Show Channel d’un canal, ne laissant que le canal désiré affiché. Pour quantifier l’intensité du signal, cliquez sur Ajouter rectangle pour ajouter des rectangles à l’image.Cliquez sur le centre d’une entité telle qu’une bande protéique pour placer un rectangle autour d’elle. Après avoir ajouté les formes désirées, cliquez sur Sélectionnez pour retourner le curseur à l’outil de sélection. Pour soustraire le bruit de fond, cliquez sur le premier bouton du groupe Arrière-plan et sélectionnez Médiane dans le menu dropdown.Réglez la largeur de la bordure à trois dans le dialogue d’arrière-plan et sélectionnez les segments qui représentent le mieux l’arrière-plan de l’image à utiliser pour le calcul d’arrière-plan. Pour exporter les données, cliquez sur l’onglet Formes au-dessus de la table. Pour la densitométrie, des valeurs dans la colonne Signal sont requises.Le signal est la somme des valeurs d’intensité pixel ou total pour une forme moins le produit de l’arrière-plan dans la zone. Cliquez ensuite sur le bouton Rapport, cliquez sur Enregistrer comme ou lancer la feuille de calcul. Pour calculer l’expression normalisée de la protéine d’intérêt pour chaque plan ou variable dans la feuille de calcul enregistrée, divisez le signal obtenu pour la protéine d’intérêt par le signal de la bande de contrôle de chargement des protéines correspondante.Pour exporter l’image, cliquez sur l’onglet Images trouvé au-dessus de la table, puis cliquez sur l’image à exporter. Si vous utilisez l’image pour une présentation de diapositives ou d’autres formats numériques, cliquez sur l’icône logicielle, passez au-dessus d’Export, cliquez sur Image pour les médias numériques, puis enregistrez l’image au besoin. L’enrichissement des cellules CLL avec un COE supérieur à 40 millions par millilitre à l’aide de centrifugation de densité permet une récupération cellulaire élevée.L’analyse de l’échantillon par cytométrie d’écoulement après avoir pâlifié sur FSC et SSC révèlent la pureté des cellules CLL sont plus de 95%, comme indiqué par l’expression à double surface des marqueurs cellulaires CLL, CD19 et CD5. Quand des taches immuno ont été exécutées sur les fractions qui en résultent de la lignée cellulaire de CLL, Mac-1, et des cellules primaires de CLL, la fractionnement a indiqué que le niveau optimal de détergent pour des cellules de Mac-1 était à une à 60 dilution, comparée à un à 30 pour des cellules primaires de CLL. Quand la localisation subcellulaire de FOXO1 dans les fractions nucléaires et cytoplasmiques a été déterminée dans Mac-1 et les cellules primaires de CLL, la génération des fractions fortement enrichies a été montrée par l’expression presque exclusive de lamin dans la tubuline nucléaire et bêta dans les fractions cytoplasmiques.L’expression foxo1 a été réduite dans le cytoplasme suivant le traitement avec AZD 8055, comparé à NDC, accompagné d’une augmentation de l’expression foxo1 dans le compartiment nucléaire, démontrant ainsi la translocation de protéine. Après que les taches immunos individuelles de cinq échantillons primaires de CLL aient été quantifiées dans les fractions subcellulaires, AZD 8055 s’est trouvé pour réduire les niveaux d’expression de FOXO1 dans le cytoplasme et augmenter l’expression dans le noyau. BCR cross-linking augmentation de l’expression cytoplasmique FOXO1.N’oubliez pas de garder tous les reagents et échantillons sur la glace pour prévenir la dégradation des protéines. Les fractions subcellulaires générées dans cette procédure peuvent également être utilisées dans des analyses d’activité enzymatique comme un test d’activité FOXO, qui permet de faire des parallèles entre l’emplacement cellulaire de FOXO1 et son activité de liaison de l’ADN. Le développement de cette technique nous a permis de lutter contre le trafic de protéines spécifiques dans les cellules CLL en réponse à des inhibiteurs sélectifs et soutient nos études parallèles d’immunofluorescence pour générer un ensemble de données robustes et quantifiables.

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Fractionnement subcellulaire des cellules de leucémie lymphocytique chronique primaire pour surveiller le trafic de protéines nucléaires/cytoplasmiques (Vidéo) | JoVE Journal

Fractionnement subcellulaire des cellules de leucémie lymphocytique chronique primaire pour surveiller le trafic de protéines nucléaires/cytoplasmiques

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