Name: Étudier les effets des ligands paracriné sécrétés par les tumeurs sur lactivation du macrophage à laide de la co-culture avec des supports membranaires perméables (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Découvrez la méthode de co-culture Transwell pour étudier les effets immunosuppresseurs des signaux paracrines tumoraux sur les macrophages. Cette technique permet d'analyser les facteurs sécrétés sans contact cellulaire direct.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Eric Ubil a été financé, en partie, par l'American Cancer Society Postdoctoral Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). Les travaux ont été appuyés par une subvention des NIH (R01-CA205398) et un prix de la Fondation de recherche sur le cancer du sein (BCRF-18-041) à HSE.

Toutes les procédures liées à la récolte et à l'utilisation de macrophages péritonés murine ont été menées à l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill (UNC) et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'UNC.
1. Culture Macrophage
REMARQUE : Cette procédure peut utiliser des macrophages péritonéaux primaires (décrits en détail ci-dessous), des macrophages dérivés de la moelle osseuse ou des lignées cellulaires macrophages comme J774 (ATCC) ou RAW264 (ATCC).
<ol><li>Les macrophages péritonéaux de récolte tels que décrits précédemment16,17 et la plaque directement dans la chambre supérieure (s) d'un 0.4 'm polyester membrane insert co-culture 6 plaque de puits (Figure 1A). REMARQUE : Le rendement approximatif des macrophages de chaque isolement est de 1 x 106 cellules au total, de sorte que le nombre moyen de cellules par puits est de 1,5 à 1,6 x 105 cellules dans une plaque de 6 puits.</li>
	<li>Culture des macrophages récoltés dans le facteur stimulant de la colonie d'aigles modifiés (DMEM) de Dulbecco (DMEM)/F12, 10 % sérum bovin fœtal (FBS), 1x pénicilline/streptomycine, facteur de stimulation de la colonie de macrophage de 20 ng/mL (M-CSF) pendant 3 jours à 37 oC, 5 % CO2. REMARQUE: La chambre haute contient 1 ml de milieu de culture tandis que la chambre inférieure est remplie de 1,5 ml. Le support doit être ajouté à chaque chambre.</li>
</ol>2. Coculture de cellules tumorales avec macrophages
<ol><li>Avant l'utilisation, la culture a disponible commercialement des cellules de tumeur dans leur milieu respectif suivant des méthodes de culture de tissu ATCC-recommandées.</li>
	<li>Laver les cellules tumorales adhérentes une fois avec du phosphate tamponné saline (PBS), ajouter 0,05% trypsine et acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA), et incuber à 37 oC jusqu'à ce que les cellules se détachent. Resuspendre les cellules dans FBS contenant milieu, quantifier le nombre total de cellules à l'aide d'un hémocytomètre ou compteur cellulaire, puis centrifugeuse pendant 5 min à 220 x g à granulés.</li>
	<li>Pendant la centrifugation, aspirez le milieu des chambres supérieures et inférieures des plaques de support perméables à membrane contenant des macrophages et remplacez-les par un milieu frais.<ol>
<li>Pour les chambres inférieures où les cellules tumorales seront plaquées, remplissez avec 1 ml de milieu au lieu de 1,5 ml pour permettre un volume suffisant pour l'ajout cellulaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirer le milieu des cellules tumorales granulées et des cellules de resuspend dans DMEM/F12 avec 10% FBS, 1x pénicilline/streptomycine, et 20 ng/mL M-CSF à une concentration de 3 x 105 cellules/mL.</li>
	<li>Ajouter 0,5 ml de 3 x 10 cellules/mL cellules tumorales à la chambre inférieure des puits désirés (Figure 1B). REMARQUE : Les cellules peuvent être traitées immédiatement.</li>
</ol>3. Traitement des cellules co-cultivées
<ol><li>Pour induire l'expression des gènes pro-inflammatoires macrophages, traitez les macrophages individuellement ou co-cultivés en ajoutant 100 ng/mL IFNet et 50 ng/mL LPS.<ol>
<li>Variez la durée des temps de traitement en culture au besoin. L'activation de macrophage se produit dans un délai de 2 h et une certaine suppression tumeur-négociée se produit par 8 h. Co-culture pour 24 h donne la suppression tumeur-dérivée robuste et cohérente. REMARQUE : Alternativement, les macrophages peuvent être induits pour adopter un phénotype curatif pro-blessure par l'addition des facteurs tels que l'interleukin-10 (IL10), et l'effet du ligand tumeur-secret évalué.</li>
	</ol>
</li>
	<li>En tant que contrôle négatif, les macrophages de culture individuellement et laisser non traités. Comme un contrôle positif, traiter les macrophages cultivés individuellement avec 100 ng/mL IFN et 50 ng/mL LPS.</li>
</ol>4. Analyse en aval des cellules co-cultivées
<ol><li>Après le temps d'incubation souhaité s'est écoulé, isolez le lysate cellulaire ou le milieu de culture conditionné comme désiré, selon les besoins d'essai.</li>
	<li>Pour isoler le lysate cellulaire pour l'analyse quantitative de la réaction en chaîne de polymérase (qPCR), aspirer le support des deux chambres du puits et laver une fois avec 2 ml de PBS. Appliquer le tampon de lyse d'ARN à la chambre supérieure contenant les macrophages. Gratter doucement la membrane pour libérer le lysate de la cellule, et le transférer dans un tube de collecte pour un traitement ultérieur selon le protocole du fabricant du kit d'isolement de l'ARN.</li>
</ol>

<ol><li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li>
<li>Agata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+PD-1+antigen+on+the+surface+of+stimulated+mouse+T+and+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes.</a> International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).</li>
<li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+B7-H1+promotes+T-cell+apoptosis%3A+a+potential+mechanism+of+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion.</a> Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).</li>
<li>Sznol, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonist+antibodies+to+PD-1+and+B7-H1+%28PD-L1%29+in+the+treatment+of+advanced+human+cancer--response%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response.</a> Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542(2013).</li>
<li>Kortylewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+IL-23+and+IL-12+balance+by+Stat3+signaling+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).</li>
<li>Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-induced+interleukin-10+inhibits+type+1+immune+responses+directed+at+a+tumor+antigen+as+well+as+a+non-tumor+antigen+present+at+the+tumor+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site.</a> Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+innate+and+adaptive+immune+responses+by+Stat-3+signaling+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells.</a> Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).</li>
<li>Mazzoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+suppressor+lines+inhibit+T+cell+responses+by+an+NO-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).</li>
<li>Zea, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginase-producing+myeloid+suppressor+cells+in+renal+cell+carcinoma+patients%3A+a+mechanism+of+tumor+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion.</a> Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).</li>
<li>Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+macrophage+content+in+human+breast+cancer+is+not+associated+with+favourable+prognostic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors.</a> British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).</li>
<li>Evans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T-+and+B+lymphocyte+responses+to+mitogens+by+tumor-associated+macrophages%3A+the+dependency+on+the+stage+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth.</a> Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).</li>
<li>Noy, R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages%3A+from+mechanisms+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy.</a> Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).</li>
<li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).</li>
<li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).</li>
<li>Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Proximal+Culture+Method+to+Study+Paracrine+Signaling+Between+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58144(2018).</li>
<li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li>
<li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).</li>
<li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+proinflammatory+and+chemokine+genes+by+lipopolysaccharide+and+paclitaxel+%28Taxol%29+in+murine+and+human+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines.</a> Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

L'analyse de co-culture présentée ici est une modification des essais précédemment établis qui permet l'étude des facteurs tumoraux-sécrétés sur l'activation de cellules immunitaires. Tandis que le contact de cellule-cellule est connu pour induire des changements dans l'activité immunisée, la capacité des ligands tumeur-sécrétés pour moduler l'activation immunisée est moins bien comprise. Nous décrivons une méthode qui, contrairement à la co-culture directe, peut être employée pour interroger comment les facteurs sécrété...

Des études récentes ont porté sur la capacité des cellules cancéreuses à éviter la détection par les cellules immunitaires, à supprimer l'activation immunitaire locale ou à produire un milieu tolérogène de tumeur-permissive dans le microenvironnement de tumeur. Deux grandes classes d'interactions de tumeur et de cellules immunitaires ont été décrites qui facilitent ces effets : interactions contact-négociées ou ligands tumeur-scrétés. L'un des mécanismes les plus bien étudiés et cliniquement traitables de l'inhibition immunitaire par contact-négociée utilisée par les tumeurs est l'expression de PD-L1, qui interagit avec PD-1 sur les lymphocytes T pour inhiber leur activation et leur fonction1,2. En réponse à l'interféron-gamma (IFN), qui est exprimé par un certain nombre de cellules immunitaires activées, les cellules tumorales peuvent augmenter l'expression de PD-L1 pour induire l'épuisement des lymphocytes T activés PD-1-exprimant, les empêchant ainsi d'éradiquer efficacement les cellules tumorales3. L'utilisation d'anticorps pour bloquer l'interaction entre PD-L1 et PD-1 est actuellement utilisée pour traiter plusieurs types de cancer chez l'homme4. À la lumière de ce succès clinique et d'autres, l'identification et le ciblage des mécanismes immunosuppresseurs tumeur-dérivés a reçu l'attention croissante.
Au-delà de la suppression de l'immunité adaptative, les tumeurs sont également connues pour sécrétiser des facteurs qui suppriment les réponses pro-inflammatoires des cellules immunitaires innées. Les sécrétions tumorales ou induites par la tumeur, y compris IL-6, IL-10, VEGF, IL-23, et le facteur stimulant de colonie (CSF-1), ont été montrées pour inhiber des réponses antitumorales des cellules de tueur naturel (NK), des granulocytes, et des cellules dendritiques dans le microenvironnement de tumeur5,6,7. Les cellules tumorales peuvent également sécréte des facteurs qui faussent le recrutement et la différenciation des cellules dérivées du myéloïde dans le microenvironnement tumoral pour favoriser la suppression de l'activation des lymphocytes T8,9.
Un type de cellule immunitaire innée qui a un effet profond sur la progression tumorale est le macrophage. Pendant de nombreuses années, la présence de macrophages tumeur-associés (TAMs) a été employé comme pronostic négatif de la surviepatiente 10. Le concept que les TAM immunosuppresseurs amortissent le dégagement immuno-négocié des tumeurs de cellules a été présenté il y a plus de 40 ans11. Plus récemment, il a été démontré que la réponse macrophage pro-inflammatoire peut être régulée tandis qu'un phénotype pro-tumoral peut être induit dans le microenvironnement tumoral. Ces macrophages immunosuppresseurs peuvent contribuer à une réponse tolérogène, conduisant la progression de tumeur et la résistance à la chimio- et à l'immunothérapie12. Étant donné que les macrophages sont souvent l'un des leucocytes les plus abondants avec la tumeur, la restauration de leur activité immunitaire tumeur-spécifique représente une cible potentielle pour les thérapies anticancéreuses13.
Tandis que les interactions contact-négociées entre les cellules de tumeur et les macrophages peuvent être modélisées par la coculture directe, l'utilisation des supports perméables de membrane peut élucider quels facteurs tumeur-sécrétés sont immunomodulatifs sans l'influence potentiellement confondante du contact tumeur-cellule-cellule immun. En utilisant des méthodes quelque peu similaires, d'autres ont démontré le potentiel d'identifier les facteurs sécrétés dans les microglies / interactions neuronales14 ainsi que les cellules tumorales avec des cellules méthéliales15. Nous avons également utilisé avec succès cette technique de co-culture pour caractériser le rôle d'une protéine tumeur-sécrétée, Pros1, comme un suppresseur de l'expression pro-inflammatoire de gène après la stimulation des macrophages péritonéaux avec LPS et interféron-gamma16. Ici nous décrivons une méthodologie simple qui peut être employée pour interroger comment les facteurs tumeur-sécrétés peuvent affecter l'activation de macrophage.

<table><tbody><tr><td>B16-F10</td><td>ATCC ATCC</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>kit de synthèse d’ADNc</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>milieu ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Millipore</td><td>TMS-013-B</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-67</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides d’Escherichia coli O111 :B4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5293-2ML</td><td></td></tr><tr><td>Murin M-CSF</td><td>Prospec</td><td>CYT-439</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pros1 ELISA</td><td>MyBioSource</td><td>MBS2886720</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante IFN&gamma ;</td><td>BioLegend</td><td>575302</td><td></td></tr><tr><td>Sensimix SYBR Low-ROX kit</td><td>Bioline</td><td>QT625-05</td><td></td></tr><tr><td>Supports perméables Transwell</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-170</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

Étudier les effets des ligands paracriné sécrétés par les tumeurs sur l'activation du macrophage à l'aide de la co-culture avec des supports membranaires perméables

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

La signalisation paracrine dérivée de tumeur est un composant négligé de l'immunosuppression locale et peut mener à un environnement permissif pour la croissance continue de cancer et la métatasie. Les signaux paracrines peuvent impliquer le contact cellule-cellule entre différents types de cellules, tels que PD-L1 exprimé sur la surface des tumeurs interagissant directement avec PD-1 sur la surface des cellules T, ou la sécrétion de ligands par une cellule tumorale pour affecter une cellule immunitaire. Ici nous décrivons une méthode de co-culture pour interroger les effets des ligands tumeur-sécrétés sur l'activation de cellules immunitaires (macrophage). Cette procédure simple utilise des supports perméables de la membrane de polycarbonate de 0,4 m disponible dans le commerce et des plaques de culture tissulaires standard. Dans le processus décrit, les macrophages sont cultivés dans la chambre supérieure et les cellules tumorales dans la chambre inférieure. La présence de la barrière de 0,4 m permet d'étudier la signalisation intercellulaire sans la variable confondante de contact physique, car les deux types de cellules partagent le même milieu et l'exposition aux ligands paracènes. Cette approche peut être combinée à d'autres, comme les altérations génétiques du macrophage (p. ex., l'isolement des souris génétiques knock-out) ou la tumeur (p. ex., les altérations négociées par CRISPR) pour étudier le rôle de facteurs et de récepteurs sécrétés spécifiques. L'approche se prête également à des analyses biologiques moléculaires standard telles que la réaction quantitative en chaîne de polymérase de transcription inversée (qRT-PCR) ou l'analyse occidentale de tache, sans la nécessité de trier le flux pour séparer les deux populations cellulaires. Les essais immunosorbent enzymatiques (ELISA) peuvent également être utilisés pour mesurer les ligands sécrétés afin de mieux comprendre l'interaction dynamique de la signalisation cellulaire dans le contexte du type de cellules multiples. La durée de la co-culture peut également être modifiée pour l'étude des événements temporels. Cette méthode de co-culture est un outil robuste qui facilite l'étude des signaux sécrétés par la tumeur dans le contexte immunitaire.

Pour déterminer l'effet des ligands tumeur-sécrétés sur la polarisation de macrophage, la procédure décrite a été employée. Les macrophages péritonéaux cultivés en l'absence de cellules tumorales ont été utilisés comme témoins négatifs (non traités à l'extrême gauche) et positifs (IFNet et LPS stimulés àpartir de la gauche) (Figure 2A). Alternativement, les macrophages péritonéaux ont été co-cultivés avec les cellules de tumeur de mélanome b16F10 (ATCC) (figur...

Ici, nous présentons une méthode utilisant des supports perméables de membrane pour faciliter l'étude de la signalisation de paracrine de non-contact employée par des cellules de tumeur pour supprimer la réponse immunitaire. Le système est disposé à étudier le rôle des facteurs tumeur-sécrétés en amortissant l'activation de macrophage.

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Cette méthode de co-culture Transwell est utilisée pour étudier la signalisation paracrine utilisée par les cellules tumorales pour supprimer la réponse immunitaire. Cette méthode peut être utilisée pour découvrir de nouveaux ligands sécrétés, ainsi que les fondements mécanistes de leurs effets immunosuppresseurs. Nous avons précédemment employé cette méthode pour montrer comment les facteurs tumeur-sécrètent peuvent amortir la transcription pro-inflammatoire de gène de macrophage.Nous croyons que cet outil a des implications étendues dans l’étude de la suppression immunisée tumeur-dérivée. Un des principaux avantages de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour étudier la signalisation paracrine entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires sans la variable potentiellement confusionnante du contact cellule à cellule. Cette plate-forme est également accessible à une variété de techniques biologiques moléculaires pour l’analyse en aval.Après la récolte des macrophages péritonéaux, plaquez-les directement dans les chambres supérieures d’une membrane polyester de 0,4 micromètre insérant une plaque de six puits de co-culture. Puis ajouté complété DMEM au puits de sorte que la chambre supérieure contient un millilitre et la chambre inférieure contient 1,5 millilitres. Incuber pendant trois jours à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.Tout d’abord, la culture des cellules tumorales disponibles dans le commerce dans leur milieu respectif, suivant les méthodes de culture des tissus recommandées par l’ATCC. Ensuite, lavez les cellules tumorales adhérentes une fois avec PBS. Ajouter 0,05% trypsine dans EDTA et incuber à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules se détachent.Puis re-suspendre les cellules dans les médias contenant FBS. Utilisez un hémocytomètre ou un compteur cellulaire pour quantifier le nombre total de cellules et de centrifugeuses à 220 fois G pendant cinq minutes pour pelleter. Pendant la centrifugation, aspirer le milieu des chambres supérieures et inférieures du macrophage contenant des plaques de support membranaires perméables et remplacer par un milieu frais.Pour les chambres inférieures où les cellules tumorales seront plaquées, remplir d’un millilitre de milieu au lieu de 1,5 millilitres pour laisser un volume suffisant pour l’ajout cellulaire. Quand la centrifugation est complète, aspirez le milieu des cellules tumorales granulées et suspendez les cellules dans le DMEM complété à une concentration de 300.000 cellules par millilitre. Ajouter 0,5 millilitres de cette suspension cellulaire à la chambre basse des puits désirés.Pour induire l’expression pro-inflammatoire des gènes macrophages, traitez les macrophages sings ou co-cultivés en ajoutant des gamma d’interféron à une concentration de 100 nanogrammes par millilitre et de LPS à une concentration de 50 nanogrammes par millilitre. Varier la durée des temps de traitement en culture au besoin. L’activation de macrophage se produit dans les deux heures, et une certaine suppression tumeur-médiatisée se produit par huit heures.La co-culture pendant 24 heures donne la suppression tumeur-dérivée robuste et cohérente. En tant que contrôle négatif, les macrophages de culture chantent et ne sont pas traités. Comme un contrôle positif, traiter les macrophages cultivés ment avec interféron gamma et LPS aux mêmes concentrations utilisées pour les échantillons.Une fois le temps d’incubation désiré écoulé, isoler le lysate cellulaire ou le milieu de culture de l’état selon les besoins d’essai. Pour isoler le lysate cellulaire pour l’analyse quantitative de la réaction en chaîne de polymésase, aspirez le milieu des deux chambres du puits et lavez-le une fois avec deux millilitres de PBS. Appliquez le tampon de lyse d’ARN à la chambre supérieure contenant les macrophages.Après cela, grattez doucement la membrane pour libérer la cellule lysate et transférez-la dans un tube de collecte pour un traitement ultérieur selon le protocole du fabricant du kit d’isolation arn. La méthode de co-culture décrite ici implique la culture des macrophages et des cellules tumorales sans contact physique. Les macrophages péritonéaux cultivés en l’absence de cellules tumorales sont utilisés comme témoins négatifs et positifs.Les macrophages péritonéaux co-cultivés en présence de cellules tumorales B16F10 mais sans activer les stimuli n’augmentent pas l’expression des gènes associés pro-inflammatoires. Ceci implique que les ligands tumeur-sécrètent ne sont pas suffisants pour induire l’expression pro-inflammatoire de gène par eux-mêmes, ou s’il y a activation immunisée par des sécrétions de tumeur, ligands paracrines sont suffisants pour la supprimer à ses niveaux indigènes. Cette méthode de co-culture illustre que lorsque les macrophages polarisés par interféron gamma et LPS sont cultivés en présence de cellules tumorales, la suppression de l’expression des gènes associée à l’inflammation a été réduite jusqu’à 60%Un niveau comparable de suppression des gènes pro-inflammatoires macrophages est observé lorsque la lignée cellulaire macrophage murine J774 est remplacée par des macrophages péritonéaux.Les travaux précédents ont identifié la protéine S comme un facteur sécrètement de tumeur qui peut empêcher l’activation de macrophage, ainsi le modèle perméable de co-culture de support de membrane est employé en conjonction avec un lysA pour apaiser la concentration de protéine S dans le support conditionné après 24 heures. Dans les médias conditionnés provenant des cellules de mélanome B16F10 traitées par interféron gamma et LPS, la protéine S est exprimée en une concentration d’environ 475 nanogrammes par millilitre. Les macrophages péritonéaux traités dans les mêmes conditions exprimaient la protéine S à environ 61 nanogrammes par millilitre.Fait intéressant, lorsqu’elle est co-cultivé, la concentration de protéines S dans l’interféron gamma et le puits traité par LPS était d’environ 86 nanogrammes par millilitre. Ceci suggère que les macrophages ingèrent la protéine S tumeur-sécrétée ou que la quantité de protéine S sécrétée par les cellules de B16F10 soit sensiblement diminuée quand en présence des macrophages. Ces résultats mettent en évidence des changements profonds de l’activation des macrophages et de la signalisation paracrine lorsque les macrophages sont co-cultivés avec les cellules tumorales.La méthode de co-culture Transwell peut répondre à une variété de questions relatives à la signalisation paracrine. L’analyse occidentale de tache pourrait être conduite pour déterminer comment les protéines tumeur-sécrètent modifient diverses voies de signalisation dans les macrophages.

studying-effects-tumor-secreted-paracrine-ligands-on-macrophage

Research

Recherche

JoVE Journal

Cancer Research

Recherche sur le cancer

Cette vidéo présente un test pour étudier la régulation de la phagocytose des macrophages par cellules souches mésenchymateuses (CSM) dans une co-culture. Lors de la co-culture de CSM avec des macrophages, des particules zymosanes non opsonisées conjuguées à un fluorophore sensible au pH sont ajoutées pour être phagocytées par les macrophages. Avec l’augmentation de la phagocytose, l’intensité de la fluorescence augmente, ce qui permet de déterminer la régulation de l’activité phagocytaire par...

Un test pour étudier la régulation de la phagocytose des macrophages par les cellules souches mésenchymateuses

Ici, nous présentons un protocole de co-culture en trois dimensions, qui est utile pour étudier les interactions multicellulaires et la modulation dépendante de la matrice extracellulaire du comportement des cellules cancéreuses. Dans ce modèle expérimental, les cellules cancéreuses sont cultivées sur des gels de collagène intégrés à des fibroblastes humains associés au cancer.

En trois dimensions modèle de co-culture tumeur stromale-Interaction

Pour comprendre le comportement malin du cancer, il faut créer des modèles précis de la façon dont les cellules tumorales interagissent avec les composants du microenvironnement tumoral, tels que les macrophages. Ici, nous décrivons deux méthodes pour étudier l’interaction des cellules de glioblastome avec les macrophages associés aux tumeurs et la microglie où l’effet sur l’invasion du glioblastome est évalué.

Coculture Assays pour étudier macrophage et microglie Stimulation de glioblastome Invasion

Nous avons adapté un insert de membrane microporeuse perméable pour imiter le microenvironnement tumoral (TME). Le modèle consiste en une culture cellulaire mixte, permet la génération simplifiée de populations cellulaires individuelles hautement enrichies sans utiliser le marquage fluorescent ou le tri cellulaire, et permet d’étudier la communication intercellulaire au sein du TME dans des conditions normales ou de stress.

A Mimic du microenvironnement de la tumeur: Une méthode simple pour générer des populations de cellules enrichies et enquête intercellulaire Communication

Nous décrivons ici une méthode de culture en trois dimensions pour analyser la morphologie des principales cellules cancéreuses du sein, aussi bien quant à étudier leurs interactions directes/indirectes avec les monocytes et les résultats tels que la dégradation du collagène et le recrutement de cellules immunitaires, cellules invasion et la promotion de l’inflammation liée au cancer.

Analyser la Communication entre les Monocytes et les cellules cancéreuses du sein primitif dans une matrice extracellulaire extrait (ECME)-système tridimensionnel

Interactions cellulaires paracrine et juxtacrine jouent un rôle important dans de nombreux processus biologiques, y compris la progression tumorale, réponse immunitaire, l’angiogenèse et le développement. Ici, une méthode de culture proximale est utilisée pour étudier la signalisation paracrine où les concentrations localisées des facteurs sécrétés sont entretenues tout en empêchant le contact cellulaire direct.

Une méthode de Culture Proximal pour étudier la signalisation Paracrine entre cellules

Cet article représente un analyse in vitro utile pour évaluer la capacité du milieu conditionné des cellules de tumeur pour attirer des macrophages.

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction (en)

L'activité phagocytique de Macrophage contre des cellules cancéreuses, spécifiquement les cellules mammaires de carcinome de souris 4T1, a été imaged dans cette étude. Le modèle de coculture des cellules vivantes a été établi et observé à l'aide d'une combinaison de microscopie fluorescente et de contraste d'interférence différentielle. Cette évaluation a été imageà l'aide d'un logiciel d'imagerie pour développer une vidéo en accéléré multipoints.

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Ici, nous présentons un protocole pour étudier l’interaction des macrophages primaires dérivés de monocytes humains avec un sphéroïde tumoral dans une matrice tridimensionnelle (3D) de collagène I, avec la possibilité de comparer l’impact des propriétés solubles et physiques du microenvironnement sur l’invasion cellulaire.

Un test de co-invasion macrophage-tumeur sphéroïde

Étant donné le nombre limité de modèles de xénogreffes disponibles pour étudier les interactions entre les cellules CART humaines et les cellules myéloïdes, nous avons établi des modèles in vitro et in vivo pour comprendre les impacts des macrophages humains sur les cellules CART. Les résultats peuvent potentiellement être généralisés pour évaluer les rôles des macrophages dans le microenvironnement tumoral et tester des immunothérapies ciblées sur les macrophages.

Étude des interactions entre les cellules myéloïdes et les cellules CAR-T in vitro et in vivo

Découvrez la méthode de co-culture Transwell pour étudier les effets immunosuppresseurs des signaux paracrines tumoraux sur les macrophages. Cette technique permet d'analyser les facteurs sécrétés sans contact cellulaire direct.

Étudier les effets des ligands paracriné sécrétés par les tumeurs sur lactivation du macrophage à laide de la co-culture avec des supports membranaires perméables (Vidéo) | JoVE Journal

Étudier les effets des ligands paracriné sécrétés par les tumeurs sur l'activation du macrophage à l'aide de la co-culture avec des supports membranaires perméables

Explorer plus de vidéos