Étudier les effets des ligands paracriné sécrétés par les tumeurs sur l'activation du macrophage à l'aide de la co-culture avec des supports membranaires perméables

Cette méthode de co-culture Transwell est utilisée pour étudier la signalisation paracrine utilisée par les cellules tumorales pour supprimer la réponse immunitaire. Cette méthode peut être utilisée pour découvrir de nouveaux ligands sécrétés, ainsi que les fondements mécanistes de leurs effets immunosuppresseurs. Nous avons précédemment employé cette méthode pour montrer comment les facteurs tumeur-sécrètent peuvent amortir la transcription pro-inflammatoire de gène de macrophage.

Nous croyons que cet outil a des implications étendues dans l’étude de la suppression immunisée tumeur-dérivée. Un des principaux avantages de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour étudier la signalisation paracrine entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires sans la variable potentiellement confusionnante du contact cellule à cellule. Cette plate-forme est également accessible à une variété de techniques biologiques moléculaires pour l’analyse en aval.

Après la récolte des macrophages péritonéaux, plaquez-les directement dans les chambres supérieures d’une membrane polyester de 0,4 micromètre insérant une plaque de six puits de co-culture. Puis ajouté complété DMEM au puits de sorte que la chambre supérieure contient un millilitre et la chambre inférieure contient 1,5 millilitres. Incuber pendant trois jours à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.

Tout d’abord, la culture des cellules tumorales disponibles dans le commerce dans leur milieu respectif, suivant les méthodes de culture des tissus recommandées par l’ATCC. Ensuite, lavez les cellules tumorales adhérentes une fois avec PBS. Ajouter 0,05% trypsine dans EDTA et incuber à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules se détachent.

Puis re-suspendre les cellules dans les médias contenant FBS. Utilisez un hémocytomètre ou un compteur cellulaire pour quantifier le nombre total de cellules et de centrifugeuses à 220 fois G pendant cinq minutes pour pelleter. Pendant la centrifugation, aspirer le milieu des chambres supérieures et inférieures du macrophage contenant des plaques de support membranaires perméables et remplacer par un milieu frais.

Pour les chambres inférieures où les cellules tumorales seront plaquées, remplir d’un millilitre de milieu au lieu de 1,5 millilitres pour laisser un volume suffisant pour l’ajout cellulaire. Quand la centrifugation est complète, aspirez le milieu des cellules tumorales granulées et suspendez les cellules dans le DMEM complété à une concentration de 300.000 cellules par millilitre. Ajouter 0,5 millilitres de cette suspension cellulaire à la chambre basse des puits désirés.

Pour induire l’expression pro-inflammatoire des gènes macrophages, traitez les macrophages sings ou co-cultivés en ajoutant des gamma d’interféron à une concentration de 100 nanogrammes par millilitre et de LPS à une concentration de 50 nanogrammes par millilitre. Varier la durée des temps de traitement en culture au besoin. L’activation de macrophage se produit dans les deux heures, et une certaine suppression tumeur-médiatisée se produit par huit heures.

La co-culture pendant 24 heures donne la suppression tumeur-dérivée robuste et cohérente. En tant que contrôle négatif, les macrophages de culture chantent et ne sont pas traités. Comme un contrôle positif, traiter les macrophages cultivés ment avec interféron gamma et LPS aux mêmes concentrations utilisées pour les échantillons.

Une fois le temps d’incubation désiré écoulé, isoler le lysate cellulaire ou le milieu de culture de l’état selon les besoins d’essai. Pour isoler le lysate cellulaire pour l’analyse quantitative de la réaction en chaîne de polymésase, aspirez le milieu des deux chambres du puits et lavez-le une fois avec deux millilitres de PBS. Appliquez le tampon de lyse d’ARN à la chambre supérieure contenant les macrophages.

Après cela, grattez doucement la membrane pour libérer la cellule lysate et transférez-la dans un tube de collecte pour un traitement ultérieur selon le protocole du fabricant du kit d’isolation arn. La méthode de co-culture décrite ici implique la culture des macrophages et des cellules tumorales sans contact physique. Les macrophages péritonéaux cultivés en l’absence de cellules tumorales sont utilisés comme témoins négatifs et positifs.

Les macrophages péritonéaux co-cultivés en présence de cellules tumorales B16F10 mais sans activer les stimuli n’augmentent pas l’expression des gènes associés pro-inflammatoires. Ceci implique que les ligands tumeur-sécrètent ne sont pas suffisants pour induire l’expression pro-inflammatoire de gène par eux-mêmes, ou s’il y a activation immunisée par des sécrétions de tumeur, ligands paracrines sont suffisants pour la supprimer à ses niveaux indigènes. Cette méthode de co-culture illustre que lorsque les macrophages polarisés par interféron gamma et LPS sont cultivés en présence de cellules tumorales, la suppression de l’expression des gènes associée à l’inflammation a été réduite jusqu’à 60%Un niveau comparable de suppression des gènes pro-inflammatoires macrophages est observé lorsque la lignée cellulaire macrophage murine J774 est remplacée par des macrophages péritonéaux.

Les travaux précédents ont identifié la protéine S comme un facteur sécrètement de tumeur qui peut empêcher l’activation de macrophage, ainsi le modèle perméable de co-culture de support de membrane est employé en conjonction avec un lysA pour apaiser la concentration de protéine S dans le support conditionné après 24 heures. Dans les médias conditionnés provenant des cellules de mélanome B16F10 traitées par interféron gamma et LPS, la protéine S est exprimée en une concentration d’environ 475 nanogrammes par millilitre. Les macrophages péritonéaux traités dans les mêmes conditions exprimaient la protéine S à environ 61 nanogrammes par millilitre.

Fait intéressant, lorsqu’elle est co-cultivé, la concentration de protéines S dans l’interféron gamma et le puits traité par LPS était d’environ 86 nanogrammes par millilitre. Ceci suggère que les macrophages ingèrent la protéine S tumeur-sécrétée ou que la quantité de protéine S sécrétée par les cellules de B16F10 soit sensiblement diminuée quand en présence des macrophages. Ces résultats mettent en évidence des changements profonds de l’activation des macrophages et de la signalisation paracrine lorsque les macrophages sont co-cultivés avec les cellules tumorales.

La méthode de co-culture Transwell peut répondre à une variété de questions relatives à la signalisation paracrine. L’analyse occidentale de tache pourrait être conduite pour déterminer comment les protéines tumeur-sécrètent modifient diverses voies de signalisation dans les macrophages.