Imagerie en temps réel de bioluminescence de la dynamique de signalisation d'encoche pendant la neurogenèse de Murine

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur l’importance de la dynamique d’expression des gènes dans la prolifération cellulaire et la différenciation, en particulier la dynamique des molécules de signalisation cran dans les cellules souches neurales. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons surveiller l’expression des gènes in vitro et in vivo avec une très grande précision par imagerie en direct. Hiromi Shimojo, le professeur adjoint de mon laboratoire qui a développé cette nouvelle technologie, démontrera la procédure.

Pour l’introduction de journaliste de Dll1 F luciferase dans NPC, confirmez un manque de réponse au réflexe de pédale dans un jour embryonnaire 12.5 à 14.5 souris enceinte avant de faire une incision de deux à trois centimètres par l’abdomen, le long de la ligne médiane. Placez la gaze imbibée de PBS autour de l’incision et utilisez des forceps en forme d’anneau pour extraire soigneusement la corne utérine droite. Après avoir compté les embryons, utilisez un micro capillaire pour injecter un à deux microlitres d’ADN mixte de reporter Dll1 F luciferase dans le ventricule du télencéphale de chaque embryon.

Une injection réussie se traduira par l’observance de la teinture bleue sur la surface de l’utérus. Pour l’électroporation, mouiller l’utérus et l’électrode avec PBS, et saisir doucement la tête du premier embryon. Réglez l’électrode chargée positivement sur le côté de l’hémisphère dans lequel l’ADN a été injecté, et fournissez cinq impulsions de 30 à 50 volts et de 50 millisecondes, avec une pause d’une seconde entre les impulsions, en vérifiant que les bulles sont générées à partir de l’électrode chargée négativement.

Lorsque tous les embryons ont été injectés, retourner la corne utérine gauche à l’abdomen, et utiliser une aiguille de 17 millimètres pour fermer l’incision avec une suture de soie 4-0, plaçant PBS chaud dans la cavité abdominale avant de terminer la fermeture. Pour mettre en place une culture dissociée de PNJ, placez d’abord l’utérus d’un jour embryonnaire 12,5 à 14,5 souris transgéniques d’ubiquitinated Dll1 enceinte dans une boîte de Petri de 10 centimètres contenant 25 millilitres de PBS glacé, et utilisez des micro ciseaux et des forceps fins pour enlever les embryons de l’utérus. Après avoir décapité les embryons, placez les têtes dans une nouvelle boîte de Pétri de 10 centimètres contenant du DMEM/F12 glacé, et enlevez l’épiderme et le cartilage entourant chaque cerveau.

Transférer le cerveau dans un plat de 35 millimètres sous un microscope disséquant contenant trois millilitres de N2B27 moyen glacé. Retirer le télencéphale droit et gauche du diencéphale. Utilisez des forceps fins pour enlever les méninges qui recouvrent la surface du télencéphale et pour disséquer la partie dorsolateral du cortex du télencéphale.

Lorsque tous les tissus neuronaux d’intérêt ont été isolés, utilisez une pipette P1000 pour transférer les échantillons dans des tubes individuels de 1,5 millilitre, et utilisez une pipette P200 pour aspirer n’importe quel milieu supplémentaire de chaque tube. Ajouter 100 microlitres de solution de papain par paire de cortex, et placer les échantillons à 24 degrés Celsius pendant 15 minutes. À la fin de l’incubation, pipette doucement les échantillons 10 fois avec une nouvelle pipette P1000, et retourner les tubes à 24 degrés Celsius pendant 15 minutes supplémentaires.

À la fin de l’incubation, pipette doucement les échantillons à nouveau avant de recueillir les tissus digérés par centrifugation. Aspirez les supernatants et résuspendez doucement chaque granulé avec un millilitre de milieu DMEM/F12. Centrifugeuse les échantillons trois fois de plus comme il vient de le démontrer, en résusant doucement chaque granulé avec un millilitre frais de milieu après chaque centrifugation.

Après la dernière centrifugation, resuspendez les granulés dans 500 microlitres de N2B27 moyen complété par une luciferine d’un millimolaire, et les graines une fois 10 aux six cellules de chaque échantillon sur les plats individuels poly-L-lysine-enduits de fond en verre. Ensuite, placez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pendant une heure. Une fois que les cellules ont adhéré au plat, ajouter deux millilitres de N2B27 frais moyen plus luciferin d’un millimère à chaque assiette.

Pour visualiser l’expression des journalistes de luciferase dans les cultures de dissociation des PNJ, sélectionnez l’objectif d’immersion d’huile et placez le plat d’échantillon sur l’étape du microscope. Visualisez le champ manuellement pour déterminer la meilleure position pour visualiser les cellules, et concentrez-vous sur les cellules d’intérêt. Cliquez en direct pour acquérir l’image de test et utilisez le programme d’acquisition multidimensionnelle pour exécuter l’acquisition en accéléré par luminescence bidimensionnelle et acquisitions à champ lumineux pendant 24 heures.

Pour préparer le développement des cultures de tranches de cortex, un jour après l’injection de journaliste, récolter le jour embryonnaire 13,5 à 14,5 cerveaux embryonnaires comme démontré, et placer le plat contenant le cerveau sur le stade d’un microscope stéréoscopique fluorescence. Confirmez que chaque cortex exprime le journaliste fluorescent injecté sous la lumière d’excitation appropriée, et transférez les cerveaux à une planche à découper en caoutchouc de silicone remplie de 30 millilitres de DMEM/F12 moyen, bulles avec 100% de gaz d’oxygène. Utilisez un couteau micro chirurgical et des forceps fins pour couper la bordure entre la partie médiale et latérale du télencéphale dorsal, et séparer le tissu en deux hémisphères.

Ensuite, utilisez le couteau pour couper le cortex comme des rayures pour obtenir des tranches corticales, en transférant les tranches en milieu de la planche à découper dans une nouvelle boîte petri de 35 millimètres au fur et à mesure qu’elles sont acquises. Lorsque toutes les tranches ont été récoltées, placez la surface coupée de chaque tranche sur un insert de culture placé dans un plat de fond en verre contenant du milieu enrichi, en ajustant l’orientation de chaque tranche avec des forceps fins au besoin. Ensuite, retirez tout excès de milieu avec une pipette, et placez le plat dans un incubateur multi-gaz réglé à 40% d’oxygène, 5% de dioxyde de carbone, et 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

À la fin de l’incubation, ajouter 300 microlitres de milieu enrichi complétés par une luciferine d’un millimère au plat de culture. Pour visualiser l’expression de journaliste de luciferase dans les cultures de tranche, sélectionnez l’objectif de 40x, et placez le plat d’échantillon sur l’étape de microscope. Acquérir une image d’essai de la fluorescence, et définir la position et le plan de mise au point à la région d’intérêt sous l’éclairage de la lumière d’excitation appropriée.

Ensuite, exécutez l’acquisition en accéléré par luminescence tridimensionnelle, fluorescence et acquisitions de champs lumineux pendant 24 heures. Pour surveiller l’activité du promoteur du gène oscillant Dll1, la luciferase ubiquitinated, un journaliste de luciferase déstabilisé avec une demi-vie d’environ 10 minutes, peut être employée. Comme un journaliste fluorescent, le journaliste luciferase peut être utilisé pour surveiller la dynamique d’expression d’une protéine en étant fusionné à la séquence de codage génétique d’intérêt.

Pour visualiser l’expression des journalistes au niveau d’une seule cellule dans les cultures tissulaires, le gène reporter peut être transitoirement transfecté en PNJ par électroporation in utero comme démontré. De plus, l’imagerie au microscope permet l’acquisition d’images à champ lumineux, en fluorescence et en chimioluminescence. Le journaliste de l’activité promoteur Dll1 montre une expression oscillatoire dans les PNJ dérivés du télencéphale de Dll1 ubiquitinated F luciferase souris reporter, avec le journaliste luciferase déstabilisé indiquant une réglementation forte de haut en bas de l’expression de l’activité promoteur.

Dans les cellules fluorescentes positives fluorescentes vertes adjacentes transportant le journaliste hes1 et les cellules mCherry-positives exprimant le journaliste de protéine de Dll1 qui ont pris contact les uns avec les autres pendant l’observation, l’expression de journaliste de Hes1 semble commencer environ 60 minutes après contact, suggérant que le délai pour la transmission de la signalisation d’encoche entre les cellules adjacentes est environ une heure. De plus, lors de la transmission du signal, l’expression des protéines Dll1 présente une translocation dynamique. Lors de l’acquisition de l’imagerie par bioluminescence, gardez la salle de microscope complètement sombre, car la lumière extranée peut empêcher une acquisition optimale.

Les développements récents en optogénétique nous permettent de contrôler l’expression des gènes avec la lumière. Avec cette technique, nous pouvons simultanément introduire divers modèles d’expression génique et surveiller les réponses des journalistes luciferase.