Name: Optocardiographie et études délectrophysiologie des coeurs perfusés dEx Vivo Langendorff (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Découvrez l'optocardiographie et l'électrophysiologie sur cœur isolé de porc en système Langendorff. Cette méthode combine cartographie optique du voltage et du calcium pour étudier la dynamique cardiaque et évaluer des substances pharmacologiques.

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Les auteurs remercient le Dr Matthew Kay pour ses conseils expérimentaux utiles, et Manelle Ramadan et Muhaymin Chowdhury pour l'assistance technique. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (R01HL139472 à NGP, R01 HL139712 à NI), l'Institut de recherche pour enfants, l'Institut national de cardiologie pour enfants et l'Institut Sheikh Zayed pour l'innovation chirurgicale pédiatrique.

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Bien que les modèles de recherche cardiovasculaire s'étendent des préparations cellulaires aux préparations in vivo, il y a un compromis inhérent entre la pertinence clinique et l'utilité expérimentale. Sur ce spectre, le cœur isolé perfused Langendorff reste un compromis utile pour l'étude de la physiologie cardiaque48. Le modèle du cœur entier représente un niveau plus élevé d'intégration fonctionnelle et structurelle que les monocouches à cellule unique ou tissulaire, mais évite également les complexités confondantes associées aux modèles in vivo. Un avantage majeur au cours des expériences de cartographie optique double est que la surface épicardique du cœur isolé peut être observée, et l'imagerie par fluorescence du potentiel transmembranaire et la manipulation du calcium peuvent être utilisés pour surveiller la physiologie cardiaque34.
Les modèles de rongeurs sont le plus souvent utilisés pour les préparations cardiaques isolées plutôt que pour les animaux plus gros, en partie en raison du coût associé de l'augmentation de la taille de tous les éléments impliqués (p. ex., volume de solution, circuit de perfusion, quantité de colorants et découpleurs mécaniques) avec une plus grande instabilité et la propension pour les arythmies chez les grands animaux10,36,49. Un avantage à l'aide de coeurs de porc est qu'ils ressemblent étroitement au coeur humain dans la structure, la taille et le taux de contraction, donc plus précisément modelant des paramètres hémodynamiques comme le flux sanguin coronaire et la sortie cardiaque. De même, les humains et les porcs ont la manipulation semblable de calcium, les intervalles d'électrocardiogramme37,et la morphologie potentielle d'action comprenant les canaux sous-jacents qu'il représente12,50,51, 52. Ce protocole décrit en détail les étapes de la création d'un modèle animal reproductible pour caractériser en détail la fonction myocardique. L'imagerie simultanée de la tension transmembranaire (RH237) et du calcium intracellulaire (Rhod2), utilisée en conjonction avec des protocoles électrophysiologiques établis, offre la possibilité de repérer les mécanismes responsables de l'altération du Fonction. La méthodologie décrite peut être utilisée pour les tests de sécurité précliniques, le dépistage toxicologique et l'étude de pathologies génétiques ou autres. En outre, la méthodologie décrite peut être modifiée et adaptée pour une utilisation avec d'autres modèles cardiaques (par exemple, canine, humain) en fonction de l'accent de recherche spécifique53,54,55.
Il y a quelques modifications critiques à garder à l'esprit lors de la transition d'un modèle de rongeur plus petit à un modèle de porc plus grand pour les préparations isolées et entières de coeur. Pendant la préparation et la configuration, nous recommandons d'ajouter l'albumine au perfusate pour maintenir la pression oncotique et réduire l'oœdème (plus antifoam, si nécessaire)56,57,58,59. En outre, perfusate contenant de l'albumine peut également aider dans les études métaboliques qui nécessitent également l'acide gras-supplémentation pour le média60,61. Contrairement aux cœurs de rongeurs, le cœur de porc plus grand n'a pas besoin d'être immergé dans les médias chauds en raison de son rapport surface/volume plus faible et du volume accru de médias réchauffés qui circulent à travers les vaisseaux coronaires, ce qui maintient mieux la température. Comme nous l'avons mentionné précédemment, nous avons placé des sondes de température à l'intérieur du ventricule droit et sur la surface épicardique des ventricules droit et gauche, en n'observant que de légères fluctuations de température de 1 à 2 oC dans les trois endroits de l'étude. Fait important, de tels débits plus rapides peuvent également augmenter la probabilité de bulles et d'une embolie potentielle. Pour contourner ce problème, nous vous recommandons d'utiliser un piège à bulles avec de grands tubes de forage menant directement jusqu'à la canule aortique. De même, nous avons trouvé plus utile d'avoir deux individus travaillant en tandem pour cannuler l'aorte sur un cœur plus grand (et plus lourd); une personne pour tenir l'aorte ouverte avec des hemostats robustes et une autre pour fixer l'aorte au canule à l'aide de ruban ombilical. Dans la méthodologie décrite, nous avons constaté que la perfusion avec la cardioplégie et la défibrillation étaient essentielles au rétablissement cardiaque, qui est contraire aux préparations de coeur de rongeur. Dans notre expérience, seulement quelques coeurs excisés ont repris l'activité sinus-conduite normale sans cardioversion.
Pour améliorer les paramètres de l'imagerie optique, une préparation cardiaque suspendue a limité l'effet de l'éblouisser qui peut se produire avec un cœur submergé. En outre, le cœur suspendu évite également toute compression ou compromis des vaisseaux coronaires sur l'aspect postérieur du cœur qui peut se produire lors de la pose du cœur horizontalement pour l'imagerie verticale. Nous avons également constaté que le chargement de colorants fluorescents après le piège à bulles (près de la canule aortique) a grandement amélioré la coloration des tissus et des signaux optiques. Enfin, pour améliorer les paramètres d'électrophysiologie cardiaque, l'utilisation d'une plus grande électrode de stimulation coaxiale a facilité le rythme auriculaire réussi. Bien que nous décrivions l'utilisation d'électrocardiogrammes pour identifier la capture et la perte de capture pour divers paramètres d'EP, des cathéters intracardiaques ou des électrodes d'enregistrement bipolaires peuvent également être employés.
Notre étude s'est concentrée sur le développement d'une méthodologie pour la cartographie optique double et l'évaluation électrophysiologique cardiaque dans un modèle de coeur porcin isolé et intact. En raison de similitudes avec le cœur humain juvénile, le coeur porcin reste un modèle populaire pour des études focalisés sur la cardiologie pédiatrique ou les défauts congénitaux de coeur. Fait important, l'approche décrite peut être adaptée à l'utilisation avec des cœurs adultes de plus grande taille et/ou différentes espèces d'intérêt. En effet, d'autres laboratoires peuvent constater que l'utilisation de cœurs canins ou humains (donneur ou malade) sont plus applicables pour leur objectif de recherche spécifique53,54,55. Une autre limitation potentielle à cette étude est l'utilisation d'un découpleur mécanique pour réduire l'artefact de mouvement pendant l'imagerie. Blebbistatin est devenu le découpleur de choix dans les applications d'imagerie cardiaque en raison de ses effets minimes sur les paramètres ECG, l'activation et les périodes réfractaires41,62,63. Le BDM est un choix moins coûteux, qui peut être particulièrement important dans les grandes études animales qui nécessitent de plus grands volumes de perfusate et de découpleur mécanique, mais il est connu pour avoir un plus grand impact sur les courants de potassium et de calcium qui peuvent modifier le potentiel d'action morphologie64,65,66,67. Si BDM est utilisé, notez que le raccourcissement APD augmente la vulnérabilité des cœurs aux arrythmias induites par le choc68. Inversement, la principale limitation à l'utilisation de la blebbistatin est sa photosensibilité et sa phototoxicité, bien que des formulations alternatives qui ont réduit ces effets69,70,71. Enfin, la méthodologie décrite utilise un système de caméra unique pour l'expérimentation de cartographie optique double, mais il est important de noter que les études de recherche axées sur la fibrillation ventriculaire et / ou le suivi des ondes électriques à travers la surface épicardique devrait modifier cette approche pour inclure l'imagerie panoramique en trois dimensions, telle que décrite par d'autres15,19,72,73,74,75 .

Les maladies cardiovasculaires sont l'une des principales causes de maladie et de décès dans le monde. En tant que tel, un objectif de recherche primaire est d'optimiser les méthodologies qui peuvent être utilisées pour étudier la physiologie cardiaque normale et les mécanismes sous-jacents qui peuvent contribuer à la morbidité et la mortalité chez l'homme. La recherche cardiovasculaire fondamentale s'est traditionnellement appuyée sur de petits modèles animaux, y compris les rongeurs et les lapins1,2,3, en raison de la disponibilité d'espèces génétiquement modifiées4,5, une empreinte expérimentale plus faible et un débit plus élevé. Cependant, l'utilisation d'un modèle porcin a le potentiel de fournir des données plus pertinentes sur le plan clinique6. En effet, des études antérieures ont documenté des similitudes en électrophysiologie cardiaque (EP) entre les humains et les porcs, y compris les courants ioniques similaires7, forme potentielle d'action8, et les réponses aux tests pharmacologiques9. En outre, le cœur porcin a contractile et la cinétique de relaxation qui sont plus comparables à l'homme que les rongeurs ou les lapins10. Comparé à un modèle canin, l'anatomie coronaire porcine ressemble plus étroitement à un coeur humain11,12 et est le modèle de choix pour des études axées sur le développement cardiaque, la cardiologie pédiatrique et/ou les malformations cardiaques congénitales 13. Bien qu'il existe des différences entre le porc et le cœur humain8, ces similitudes font du cœur porcin un modèle précieux pour la recherche cardiovasculaire14.
Perfusion rétrograde du cœur est devenu un protocole standard pour l'étude de la dynamique cardiaque ex vivo15 depuis la première création par Oskar Langendorff16. En conséquence, Langendorff-perfusion peut être utilisé pour soutenir un cœur isolé et intact en l'absence d'influences autonomes. Ce modèle est un outil utile pour comparer directement l'électrophysiologie cardiaque et la contractilité entre les cœurs sains et les cœurs non sains. Puisque la dynamique cardiaque est à la fois temporellement et spatialement complexe, une légère altération dans une région peut affecter considérablement la capacité du cœur entier à travailler comme un syncytium17. Par conséquent, l'imagerie spatiotemporal élevée des colorants sensibles de paramètre est un outil utile pour surveiller la fonction cardiaque à travers la surface du coeur18,19. En effet, la double imagerie simultanée des sondes fluorescentes sensibles au calcium et à tension permet d'évaluer l'activité électrique, la manipulation du calcium et le couplage excitation-contraction au niveau tissulaire20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Les techniques de cartographie langendorff-perfusion et/ou optique ont déjà été utilisées pour documenter le déclin de la performance cardiaque due au vieillissement ou aux mutations génétiques, et pour évaluer la sécurité des agents pharmacologiques ou des expositions environnementales29 ,30,31,32,33.
Dans le cadre clinique, une étude d'électrophysiologie cardiaque invasive est souvent utilisée pour étudier les troubles du rythme cardiaque, identifier les pathologies et identifier les options de traitement possibles. De même, nous décrivons un protocole d'EP qui peut être employé pour évaluer la fonction de noeud de sinus, mesurer la conduction atrioventriculaire, et identifier la réfractaire du tissu myocardique. L'étude EP décrite peut être réalisée en conjonction avec la cartographie optique, ou optocardiographie34, pour caractériser pleinement la physiologie cardiaque dans les cœurs isolés. Dans le protocole décrit, la formation image de fluorescence de résolution spatiotemporal élevée a été exécutée avec une combinaison de tension (RH237) et de calcium (Rhod-2AM) colorants dans une configuration dual emission. En outre, les paramètres d'électrophysiologie cardiaque ont été surveillés sous le rythme de sinus et en réponse à la stimulation électrique programmée.

<table><tbody><tr><td>(-)-Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0560-5MG</td><td>Découpleur mécanique</td></tr><tr><td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753-100G</td><td>Découpleur mécanique</td></tr><tr><td>Albumine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Interface de signal analogique</td><td>emka Technologies</td><td>itf16USB</td><td></td></tr><tr><td>Antimousse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5758-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Émulsion antimousse Y-30</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A5758</td><td></td></tr><tr><td>Canule aortique, 5/16"</td><td>Cole-Parmer</td><td>45509-60</td><td></td></tr><tr><td>Piège à bulles</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641U-100EA</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>C77-500</td><td></td></tr><tr><td>Caméra, sCMOS</td><td>Andor Technology</td><td>Zyla 4.2 PLUS</td><td></td></tr><tr><td>Électrode de stimulation coaxiale (oreillette)</td><td>Appareil de Harvard</td><td>73-0219</td><td></td></tr><tr><td>Défibrillateur</td><td></td><td>Zoll M Series</td><td></td></tr><tr><td>Miroir dichroïque</td><td>Chroma Technology</td><td>T660lpxrxt-UF2</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur différentiel</td><td>Warner Instruments</td><td>DP-304A</td><td></td></tr><tr><td>Filtre d’émission, calcium</td><td>Chroma Technology</td><td>ET585/40m</td><td></td></tr><tr><td>Filtre d’émission, tension</td><td>Chroma Technology</td><td>ET710lp</td><td></td></tr><tr><td>Stimulateur EP (Bloom)</td><td>Fisher Medical</td><td>DTU-215B</td><td></td></tr><tr><td>Filtre</td><td>d’excitation Chroma Technology</td><td>CT510/60bp</td><td></td></tr><tr><td>Lampes d’excitation</td><td>Thorlabs</td><td>SOLIS-525C</td><td></td></tr><tr><td>Filtre</td><td>McMaster-Carr</td><td>8147K52</td><td></td></tr><tr><td>Cartouche filtrante, polypropylène</td><td>Pentair</td><td>-5-934</td><td></td></tr><tr><td>Boîtier de filtre</td><td>McMaster-Carr</td><td>9979T21</td><td></td></tr><tr><td>Transducteur de débit</td><td>Transonic</td><td>ME6PXN</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>Bobine chauffante</td><td>Radnoti</td><td>158821</td><td></td></tr><tr><td>Hémofiltre</td><td>Hemocor</td><td>HPH 400</td><td></td></tr><tr><td>Pince hémostatique</td><td>World Precision Instruments</td><td>501326</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur d’images</td><td>Cairn Research</td><td>OptoSplit II</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>423-316</td><td></td></tr><tr><td>Tube de grand calibre, D.I. 3/8"</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-169-7H</td><td></td></tr><tr><td>Objectif 50 mm, 0,95 f-stop</td><td>Navitar</td><td>DO-5095</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Alignement d’image</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>M-7506</td><td></td></tr><tr><td>Détergent Mucasol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z637181-2L</td><td></td></tr><tr><td>Na Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>S-233</td><td></td></tr><tr><td>Électrodes à aiguille 29 G, 2 mm</td><td>AD Instruments Inc.</td><td></td><td></td>MLA1204</tr><tr><td>Éliminateur de bruit</td><td>Quest Scientific</td><td>Humbug</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à perfusion</td><td>PolyStan</td><td>A/S 1481</td><td></td></tr><tr><td>Transducteur de pression</td><td>World Precision Instruments</td><td>BLPR2</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir, 2 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34541-07</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21480</td><td></td></tr><tr><td>Rhod2-AM</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21062</td><td></td></tr><tr><td>Électrode de stimulation (ventricule)</td><td>Appareil de Harvard</td><td>73-0160</td><td></td></tr><tr><td>Suture chirurgicale</td> McKesson Amplificateur <td>de 890186</td><td></td>de transducteur <td>médico-chirurgical</td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>TBM4M</td><td></td></tr><tr><td>Console d’écoulement</td><td>de tube Transonic</td><td>TS410</td><td></td></tr><tr><td>Bande ombilicale</td><td>Jorvet</td><td>J0025UA</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie/circulateur</td><td>VWR</td><td>89400-970</td><td></td></tr><tr><td>Outils chirurgicaux</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cisailles à bandages</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8448</td><td>Lister Bandage Ciseaux, coudés, émoussés/émoussés, longueur de lame de 42,0 mm, 17,0 cm</td></tr><tr><td>Électrocautérisation</td><td>Dalwha Corp. Ltd.</td><td>BA2ALD001</td><td>Modèle : 200 Basic</td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Roboz</td><td>RS-7476</td><td>Pince d’occlusion à tube de Saint-Vincent Pince</td></tr><tr><td>hémostatique</td><td>Appareil de Harvard</td><td>72-8960</td><td>Pince hémostatique Hartmann, incurvée, dentelée Largeur de pointe de 2,2 mm, 9,5 cm</td></tr><tr><td>Hémostatiques Appareil de</td><td>Harvard</td><td>72-8985</td><td>Pince hémostatique Halstead-Mosquito Courbée, dentelée, pointe de 2 mm</td></tr><tr><td>Ciseaux Mayo</td> de 14 cm<td>WPI</td><td>501749</td><td>14,5 cm,</td></tr><tr><td>Ciseaux Metzenbaum</td> droits <td>WPI</td><td>501747</td><td>11,5 cm, Pince</td></tr><tr><td>à moustiques</td> droite <td>Harvard Apparatus</td><td>72-8980</td><td>Pince hémostatique Halstead-Mosquito Droite, lisse, largeur de pointe de 2 mm 12 cm</td></tr><tr><td>Porte-aiguille</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8828 Porte-aiguilles</td><td>Webster, droits, lisses, longueur totale 13,0 cm</td></tr><tr><td>Croix pédiatrique pince</td><td>Roboz</td><td>RS-7660</td><td>Cooley-Derra Clamp 6.25" 5 mm Calibrations</td></tr><tr><td>Pince à angle droit</td><td>WPI</td><td>501240</td><td>Baby Mixter Pince hémostatique, 14 cm, Scalpel à angle droit</td></tr><tr><td></td><td>Ted Pella</td><td>549-4</td><td>Manche de scalpel n° 4, 13,7 cm Acier inoxydable et 10 n° 22</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8380</td><td>Ciseaux opératoires, droits, émoussés/émoussés, lame de 42 mm, 12 cm</td></tr><tr>Pince à pansement <td>droite dentelée</td><td>WPI</td><td>500363</td><td>15,5 cm</td></tr><tr><td>Pince à serviettes</td><td>WPI</td><td>501700</td><td>Pince à serviettes Backhaus, 13 cm, incurvée, poignée verrouillable, écarteur SS</td></tr><tr><td>Weitlaner</td><td>WPI</td><td>501314</td><td>écarteur Weitlaner, auto-retentissant, 10,2 cm, 2x 3 broches pointues</td></tr><tr><td><fort>jetables</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-0 prolene suture</td><td>Divers fournisseurs</td><td>Divers fournisseurs</td><td></td></tr><tr><td>Boucle vasculaire</td><td>Aspen chirurgical</td><td>011001PBX</td><td>Sterion&reg ; Boucle vasculaire, 0,8 mm x 406 mm</td></tr><tr><td>Cardioplégie (Plegisol)</td><td>Pfizer</td><td>00409-7969-05</td><td>Plegisol ; Solution de cardioplégie cristalloïde de Saint-Thomas 20 mL/kg</td></tr><tr><td>d’héparine</td><td>Divers fournisseurs</td><td>Divers fournisseurs</td><td>Seringue et aiguille 300 U/kg</td></tr><tr><td>Divers</td><td>fournisseurs</td><td>Divers fournisseurs</td><td>60 mL et 18 G respectivement</td></tr><tr><td>Ruban ombilical</td><td>Ethicon</td><td>U12T</td><td></td></tr></tbody></table>

optocardiographie et études d'électrophysiologie des coeurs perfusés d'ex vivo langendorff

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Les modèles de petits animaux sont le plus couramment utilisés dans la recherche cardiovasculaire en raison de la disponibilité d'espèces génétiquement modifiées et à moindre coût par rapport aux animaux plus gros. Pourtant, les grands mammifères sont mieux adaptés aux questions de recherche translationnelle liées à la physiologie cardiaque normale, à la pathophysiologie et aux tests précliniques d'agents thérapeutiques. Pour surmonter les obstacles techniques associés à l'utilisation d'un modèle animal plus grand dans la recherche cardiaque, nous décrivons une approche pour mesurer des paramètres physiologiques dans un coeur isolé et Langendorff-perfused de porcelet. Cette approche combine deux outils expérimentaux puissants pour évaluer l'état du cœur : l'étude de l'électrophysiologie (EP) et la cartographie optique simultanée de la tension transmembranaire et du calcium intracellulaire à l'aide de colorants sensibles aux paramètres (RH237, Rhod2-AM). Les méthodologies décrites sont bien adaptées aux études translationnelles sur le système de conduction cardiaque, les altérations de la morphologie potentielle d'action, la manipulation du calcium, le couplage excitation-contraction et l'incidence des alternans cardiaques ou Arythmies.

La figure 1A montre un diagramme du système isolé de perfusion cardiaque, qui comprend le circuit de tubes, la pompe, le filtre, l'oxygénant, les réservoirs et les éléments chauffants. Le placement des électrodes ECG (configuration de plomb II) et de rythme est indiqué dans la figure 1B, et la configuration d'imagerie est représentée dans la figure 1C. Un schéma des composants optiques et des chemins lumineux est montré dans la figure 1D.
Des études expérimentales ont été réalisées sur des cœurs entiers intacts isolés chez les jeunes porcs du Yorkshire (14 à 42 jours, n ' 18) dont la taille variait de 2,5 à 10,5 kg de poids corporel et de 18 à 137 g de poids cardiaque(figure 2A). Après le transfert du cœur isolé vers un système Langendorff (37 oC), la fréquence cardiaque s'est stabilisée à 70 à 4,5 bpm (moyenne et SEM) à moins de 10 minutes de défibrillation et est demeurée constante tout au long de la durée de l'étude (figure 2B). Un débit moyen de 184 à 17 ml/min (moyenne et SEM) a été mesuré, ce qui a ralenti à 70 à 7,5 ml/min après avoir perfugé avec des supports réchauffés contenant un découpleur mécanique (figure 2C).
Des ECG de Plomb II ont été enregistrés pendant toute la durée de l'étude au rythme des sinus (figure 3A) ou en réponse au rythme externe (figure 3B-E) pour quantifier les paramètres électrophysiologiques. Pour l'évaluation du PE, le rythme dynamique (S1-S1) a été appliqué à l'oreillette droite pour identifier le WBCL et le SNRT (temps de récupération après le début de S1-S1, Figure 3C), dans lequel WBCL a été désigné comme le PCL le plus court qui a initié une conduction atriale à conduction ventriculaire. Un protocole de stimulation S1-S2 a été mis en œuvre à l'aide d'une électrode de stimulation bipolaire sur le ventricule gauche afin d'identifier l'intervalle de couplage le plus court qui a déclenché la dépolarisation ventriculaire, identifiant ainsi VERP (Figure 3D). Alternativement, un protocole de stimulation auriculaire S1-S2 est appliqué pour identifier AVNERP (S1-S2), comme indiqué dans la figure 3E. Des exemples représentatifs de paramètres d'électrophysiologie du cœur de porc s'alignent étroitement avec ceux publiés précédemment37.
Des expériences de cartographie optique ont été réalisées au rythme des sinus, à la fibrillation ventriculaire spontanée (figure 4), ou au rythme dynamique (S1-S1) du ventricule gauche (LV) pour générer des courbes de restitution électrique et calcique représentées dans Figure 5. Les images représentatives d'un cœur de porcelet chargé de colorant sont montrées à la figure 4 avec des potentiels d'action optique correspondants (Vm) et des transitoires de calcium (Ca) recueillis dans deux régions d'intérêt sur la surface épicardique (ventricule droit [RV] - bleu, LV et rouge) . Les signaux non traités sont affichés pendant le rythme des sinus et pendant la fibrillation ventriculaire. Comme mentionné précédemment, le rythme épicardial dynamique (S1-S1) a également été utilisé lors d'expériences de cartographie optique pour normaliser toute légère différence dans la fréquence cardiaque intrinsèque (Figure 5A-E). Les signaux bruts sont affichés (RV - bleu, LV et rouge), qui ont été utilisés pour représenter le potentiel d'action — temps d'accouplement transitoire de calcium (figure 5C),temps d'activation et de durée (Figure 5D), restitution électrique et calcium (Figure 5E). Pour les préparations myocardiques épaisses, le filtrage spatial avec la taille du noyau 3 mm x 3 mm est approprié pour le potentiel d'action épicardique ou l'analyse transitoire de calcium19,47. En conséquence, les images à haute résolution spatiale (dans la configuration décrite 1240 x 1024 au total, ou 620 x 512 par canal, taille de 6,5 millions de pixels) sont souvent binées spatialement pendant ou après l'acquisition (figure 5C). Le traitement d'image peut être effectué pour générer des cartes d'activation et de repolarisation à l'aide d'algorithmes personnalisés23,33,43,45 ( Figure3D), avec le temps d'activation de chaque pixel sur le cœur a été défini comme le dérivé maximum du potentiel d'action ou de l'upstroke transitoire de calcium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig01.jpg"> Figure 1 : Configuration expérimentale. (A) Diagramme du système isolé de perfusion cardiaque; flèches dénotent la direction du flux. (B) Un cœur cannulé est montré avec le placement d'électrode. RA - oreillette droite, RV - ventricule droit, LV - ventricule gauche, ECG - électrocardiogramme de plomb II. (C) La plate-forme d'imagerie à proximité du tissu cardiaque. (D) L'émission de chaque sonde complémentaire (tension, calcium) est séparée par longueur d'onde à l'aide d'un dispositif de fractionnement d'image avec des filtres d'émission appropriés et un miroir dichroïque. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig02.jpg"> Figure 2 : Mesures du poids, du taux et du débit du cœur. (A) Rapport poids-coeur/poids corporel pour chaque porcelet utilisé dans l'étude (n - 18). (B) Fréquence cardiaque mesurée à 10 min après défibrillation et de nouveau à la fin de l'étude (environ 1 h). (C) Le débit coronaire diminue brusquement après la perfusion avec un découpleur mécanique (BDM) en raison de la réduction de la demande d'oxygène. Les barres d'échelle représentent la moyenne - SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig02large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig03.jpg"> Figure 3 : Exemples représentatifs d'enregistrements d'électrocardiogrammes de plomb II recueillis au rythme des sinus ou en réponse au rythme externe. (A) Rythme normal des sinus. (B) Exemple de rythme épicardial à une longueur de cycle de 400 ms (S1-S1), qui a été utilisé pour des expériences d'imagerie. (C) Top: Atrial pacing to identify WBCL; la capture réussie est observée à S1 - 250 ms où l'on observe une conduction auriculaire à ventriculaire. Notez que le rythme auriculaire peut être utilisé pour déterminer SNRT (temps de décharge noeud sinus, après avoir commencé le rythme externe). En bas : Comme la longueur du cycle S1 est réduite à 205 ms, la conduction du ventricule échoue. (D) Haut : rythme epicardial (S1-S2) pour identifier LE VERP; La capture réussie est observée à S1 - 450 ms, S2 à 300 ms. Fond : Comme la longueur du cycle S2 est réduite à 250 ms, le tissu ventriculaire ne parvient pas à se capturer. (E) Atrial pacing (S1-S2) pour identifier AVNERP. Haut : Une capture réussie est observée à S1 à 450 ms, S2 à 200 ms. Fond : Comme la longueur du cycle S2 est réduite à 199 ms, la conduction du ventricule échoue. Les flèches bleues dénotent des pointes de rythme, des flèches rouges dénotent la capture (« C ») ou aucune capture (« NC »). S1-S1 - rythme dynamique, S1-S2 - stimulation extrastimulus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig04.jpg"> Figure 4 : Données optiques pendant le rythme des sinus et la fibrillation ventriculaire. Gauche : Images représentatives d'un cœur de porc chargé de colorant (Vm - tension, RH237; Ca et calcium, Rhod2), vue antérieure. Tension transmembranaire filtrée spatialement et signaux fluorescents intracellulaires de calcium d'un coeur de porc pendant le rythme de sinus (centre). Signaux de tension et de calcium pendant la fibrillation ventriculaire (droite). Taille sa région de signal (15 x 15 pixels, 2,4 x 2,4 mm2, 30 x 30 x 4,8 x 4,8 mm2 taille salké) représentée sa taille de noyau rouge et bleu. Unités F/F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig05.jpg"> Figure 5 : Données optiques provenant des cœurs de porc perfused de Langendorff. Signaux de fluorescence du calcium non transformés et filtrés spatialement (A) et (B) intracellulaires de fluorescence du calcium provenant des ventricules droit et gauche pendant le rythme électrique au sommet. Les signaux non filtrés et moyenne spatiale représentent des potentiels d'action optique et des transitoires de calcium provenant de régions d'intérêt (les unités de signalisation sont F/F). (C) Une superposement de transitoires normalisés illustre le temps d'accouplement transitoire potentiel-calcium (faible passage filtré à 75 Hz). (D) Le traitement des signaux à travers la surface épicardique pour générer des cartes isochronales des paramètres temporels, y compris le temps d'activation (tacte) et le temps de repolarisation de 80%. (E) Courbes de restitution transitoires électriques et calciques générées à plusieurs fréquences (à gauche) avec analyse statistique (à droite) pour illustrer un temps de repolarisation plus long à des longueurs de cycle plus lentes. Barres d'échelle - moyenne - SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig05large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Chimique</td>
			<td>Formule</td>
			<td>Poids moléculaire</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chlorure de sodium</td>
			<td>Nacl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>5.26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gluconate de sodium</td>
			<td>C6H11NaO7
</td>
			<td>218.14</td>
			<td>5.02</td>
		</tr>
<tr>
<td>Trihydrate d'acétate de sodium</td>
			<td>C2H3NaO23H2O</td>
			<td>136.08</td>
			<td>3.68</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chlorure de potassium</td>
			<td>Kcl</td>
			<td>74.55</td>
			<td>0.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chlorure de magnésium (anhydre)</td>
			<td>MgCl2
</td>
			<td>95.21</td>
			<td>0.1405</td>
		</tr>
<tr>
<td>8,4 % bicarbonate de sodium</td>
			<td>NaHCO3 Annonces
</td>
			<td>84.01</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mannitol</td>
			<td>C6H14O6
</td>
			<td>182.17</td>
			<td>16.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sulfate de magnésium</td>
			<td>MgSO4
</td>
			<td>120.37</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ph</td>
			<td>7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Osmolarité (mOsmol/L)</td>
			<td>294</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Recette de cardioplégie modifiée dedel Nido.

L'objectif de cette étude était d'établir une méthode pour étudier la dynamique cardiaque à l'aide d'un modèle animal translationnel. L'approche expérimentale décrite intègre l'optocardiographie à double émission en conjonction avec une étude électrophysiologique pour évaluer l'activité électrique dans un modèle de coeur porcin isolé et intact.

Optocardiographie et études d'électrophysiologie des coeurs perfusés d'Ex Vivo Langendorff

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Le dysfonctionnement cardiovasculaire est la principale cause de décès dans le monde. Le modèle cardiaque isolé que nous présentons ici peut servir de fenêtre expérimentale sur la dynamique cardiaque humaine. Cette approche combine une étude classique d’électrophysiologie avec la cartographie optique simultanée de la tension transmembrane et du calcium intercellulaire pour évaluer l’état du cœur.Cette méthodologie peut être appliquée aux études de modélisation des maladies, de pharmacologie et de toxicologie. Par exemple, l’un de nos domaines d’intérêt est de caractériser les effets des tailleurs de verre sur l’électrophysiologie cardiaque. Bien que cette méthodologie soit plus difficile techniquement qu’un protocole qui utilise un modèle animal plus petit, dans l’ensemble, le protocole est relativement simple une fois que toutes les pièces sont en place.Il est difficile de décrire tous les composants d’un système d’imagerie et de perfusion par texte, de sorte que la démonstration visuelle de ce processus aidera à reproduire une préparation réussie. Après avoir isolé le cœur avec l’aorte ascendante intacte, plongez l’organe excisé dans une cardioplégie glacée et utilisez une paire d’hémostats pour saisir la paroi de l’aorte. Glissez le récipient sur une canule côtelée fixée à un tube relié à un litre de cardioplégie glacée moyenne suspendue à environ 95 centimètres au-dessus du cœur.Laissez le fluide remplir l’aorte jusqu’à ce que le récipient déborde pour empêcher les bulles d’entrer dans la vascularisation et utilisez du ruban ombilical pour fixer l’aorte à la canule. Attachez les hémostats pour supporter le poids du cœur pendant qu’il pend de la canule pour fixer davantage le tissu et permettre au milieu froid de rétrograder le cœur à une pression constante de 70 millimètres de mercure par gravité. Transférez l’écoute au système Langendorff à 37 degrés Celsius sans introduire d’air dans la canule.Et permettre au rythme normal des sinus de rincer la vascularisation de tout sang et cardioplégie restants. En cas d’arythmies chocables, placez des pagaies externes à l’apex et à la base du cœur pour défibriller l’organe, offrant un seul choc à cinq joules et augmentant en cinq incréments de joule jusqu’à ce que 50 joules, cardioversion, ou rythme non choquant est atteint. Puis, rincer le cœur avec au moins un litre de krebs-henseleit modifié moyen sans recirculation pour enlever tout sang résiduel et cardioplégie.Lorsque le milieu passe à travers le cœur, fermez la boucle de circulation pour recirculer le perfusate. Pour enregistrer un plomb standard à l’ECG tout au long de l’étude, fixez une électrode d’aiguille de calibre 29 à l’epicardium ventriculaire près de l’apex et fixez une autre électrode dans l’atrium droit. Connectez les entrées positives et négatives d’un bioamplificateur différentiel à l’oreillette apex et droite, respectivement, et fixez une électrode bipolaire de stimulus sur l’oreillette droite et une deuxième électrode bipolaire de stimulus au ventricule gauche latéral pour des buts de stimulation.Rythmez le cœur à l’aide d’un stimulateur d’électrophysiologie, avec le courant initial réglé à deux fois le seuil diastolique et une largeur d’impulsion d’une milliseconde. Pour identifier le seuil de stimulation, appliquez une série d’impulsions de stimulus d’un à deux milliampes avec une largeur d’impulsion d’une milliseconde à des longueurs définies de cycle de stimulation pour assurer une réponse cohérente de stimulus. Effectuez un rythme de stimulation supplémentaire à l’aide d’un train arpentage S1, S1 ou S1, S2.Diminuez le cycle de stimulation S2 dans le sens des pas de 10 millisecondes jusqu’à ce que le rythme ne se capture pas. Ensuite, montez jusqu’à l’avant-dernière longueur du cycle de stimulation et diminuez la longueur du cycle en intervalles d’une milliseconde pour déterminer la longueur du cycle de stimulation la plus précise avant la perte de capture. Pour établir la période réfractaire efficace ventriculaire, utilisez l’électrode de stimulus sur le ventricule gauche latéral pour identifier l’intervalle S1, S2 le plus court auquel le battement prématuré S2 initie la dépolarisation ventriculaire.Pour définir la longueur du cycle de Wenckebach, utilisez l’électrode de stimulus sur l’atrium droit pour trouver l’intervalle S1, S1 le plus court auquel une conduction atrioventriculaire en tête-à-tête se propage par la voie normale de conduction. Pour définir le temps de récupération des nœuds sinus, utilisez l’électrode de stimulus sur l’atrium droit pour appliquer un train de rythme S1, S1 et mesurer le délai entre la dernière impulsion dans le train de stimulation et la récupération de l’activité spontanée nœud sinoatrial médiatisé. Pour établir la période réfractaire efficace de nœud atrioventriculaire, utilisez l’électrode de stimulus sur l’atrium droit.Trouvez l’intervalle de couplage S1, S2 le plus court auquel la stimulation auriculaire prématurée est suivie d’un potentiel hisbundle qui suscite un complexe QRS, signifiant la dépolarisation ventriculaire. Pour la cartographie optique de la tension transmembrane et du calcium intracellulaire, ajoutez d’abord lentement jusqu’à cinq millilitres de colorant de tension fraîchement préparé proximal à la canule aortique suivi de l’ajout lent de colorant de calcium fraîchement préparé. Ensuite, positionner le matériel d’imagerie pour se concentrer sur un champ de vision approprié et connecter la caméra à un poste de travail.Obtenez des images à l’aide du logiciel sélectionné avec un temps d’exposition de 5 à 2 millisecondes. Et effectuer un alignement d’image à l’aide d’un logiciel qui peut diviser et superposer les régions désirées et afficher une soustraction à échelle grise ou un ajout pseudo-couleur à tout désalignements de surbrillance. Avec l’éclairage ambiant minimisé, testez les lumières LED pour assurer un éclairage épicurien uniforme et maximum, tel que déterminé par la profondeur du puits du capteur.Ensuite, imagez le myocarde pendant le rythme des sinus, la fibrillation ventriculaire ou le rythme dynamique à l’aide de l’électrode de stimulation positionnée sur le ventricule gauche, en commençant par une longueur de cycle de stimulation de 350 millisecondes et en diminuant de 10 à 50 millisecondes pour générer des courbes de restitution. Pour confirmer l’acquisition d’un signal optique de qualité tout au long de l’expérience, ouvrez un fichier vidéo, sélectionnez une région d’intérêt et tracez la fluorescence moyenne au fil du temps. À la fin de l’expérience, retirez le cœur du système et égouttez le perfusate.Rincez ensuite le tube du système et les chambres à l’eau purifiée. Pour l’entretien courant, rincez périodiquement le système avec une solution détergente au besoin. Dans ces études représentatives, la procédure a été exécutée sur des modèles intacts, comme démontré, qui ont illé dans la taille de 2.5 à 10.5 kilogrammes de poids corporel et 18 à 137 grammes de poids cardiaque.Après avoir transféré le cœur isolé à un système Langendorff, la fréquence cardiaque se stabilise à environ 70 battements par minute dans les 10 minutes suivant la défibrillation et reste constante tout au long de la durée de l’étude. Un débit moyen d’environ 184 millilitres par minute est généralement mesuré. Il ralentit à 70 millilitres par minute après perfusage avec milieu réchauffé contenant un découpler mécanique.Deux ECG de plomb peuvent être enregistrés tout au long de l’étude pendant le rythme des sinus ou en réponse à un rythme externe pour quantifier les paramètres électrophysiologiques. Des expériences de cartographie optique peuvent également être réalisées pendant le rythme des sinus et la fibrillation ventriculaire spontanée. Des images représentatives d’un cœur chargé de teinture peuvent être obtenues avec les potentiels d’action optique correspondants.Et les transitoires de calcium peuvent être recueillis à partir de deux régions d’intérêt sur la surface épicurienne. En outre, le rythme épidardial dynamique peut être employé pendant les expériences optiques de cartographie pour normaliser n’importe quelle légère différence dans les fréquences cardiaques intrinsèques. Les signaux bruts peuvent être utilisés pour décrire le temps de couplage transitoire de calcium potentiel d’action, le temps d’activation et de durée, et la restitution électrique et de calcium.Il est important d’éviter de permettre aux bulles d’entrer dans l’aorte, de minimiser le temps de transfert de l’animal au système, et de soutenir le cœur plus grand. Les données d’électrophysiologie et de signaux optiques peuvent être analysées après l’acquisition. En outre, le coeur peut être préservé après l’étude pour l’histologie, l’immunostaining, ou l’analyse d’expression de gène.Nous utilisons cette technique pour caractériser le développement cardiaque juvénile et pour examiner l’impact des expositions environnementales sur la physiologie cardiaque. Les découplers mécaniques utilisés pour minimiser le mouvement et les produits chimiques anti-mousse utilisés pour lutter contre la mousse d’albumine sont tous deux toxiques, de sorte que l’utilisation de l’équipement de protection individuelle approprié est absolument essentielle.

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Médecine

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