Contrôle des vitesses de débit des fluides actifs 3D à base de microtubules à l'aide de la température

La matière active a été utilisée dans diverses applications comme les ombres moléculaires. Pour amener l’application au niveau suivant, nous devons développer la capacité de contrôler la matière active localement. Nous fournissons une méthode facile à utiliser qui ne nécessite pas de modification du fluide actif.

Ni la nécessité de modifier la trajectoire optique du microscope pour atteindre le contrôle local du fluide actif. Notre méthode peut être appliquée à un large éventail de systèmes où les principales réactions obéissent à la loi erronée comme l’analyse de glisse microtubule ou les systèmes à base d’enzymes. La configuration implique un système de circulation d’eau.

En cas de fuite, l’eau peut endommager le microscope. Par conséquent, avant d’adopter notre protocole, il est important de s’assurer que le système est exempt de fuites. Notre protocole exige le montage de l’échantillon de verre sur une étape de température.

Bien que le manuscrit décrit la procédure de montage, il manque de subtilités mécaniques telles que la sécurisation de l’échantillon à la scène. Teagan Bate, Edward Jarvis et Megan Varney feront la démonstration de la procédure. Teagan et Edward sont des étudiants diplômés, et Megan est étudiante de premier cycle dans un laboratoire.

Pour préparer les fluides actifs dans un tube d’Eppendorf, mélanger 16 points sept microlitres de huit milligrammes par millilitre microtubules avec six points sept microlitres d’un point huit grappes de moteurs de kinésine micromolaire, et un point un microlitres de 500 millimolar DTT en M2B riche en sel. Empaquetez les microtubules en ajoutant 11 points quatre microlitres de sept pour cent de poids par le glycol de polyéthylène de poids. Activez ensuite les moteurs kinésine en ajoutant deux points huit microlitres de 50 millimolar ATP.

Maintenir les concentrations d’ATP en ajoutant deux points huit microlitres de kinase pyruvate de stock/déshydrogénase lactate, et 13 points trois microlitres de pyruvate de phosphenol de 200 millimolaires. Réduisez l’effet de blanchiment photo en ajoutant 10 microlitres de Trolox de 20 millimlaires, un point un microlitres de trois points cinq milligrammes par catalase millilitre, un point un microlitres de 20 milligrammes par oxidase de glucose millilitre, et un point un microlitre de 300 milligrammes par glucose millilitre. Suivez le mouvement du fluide en ajoutant un point six microlitres de zéro point zéro deux cinq pour cent de volume par particules traceurs de volume.

Ajouter m2B à haute teneur en sel pour atteindre un volume total de 100 microlitres. Ensuite, rincez une glissière en verre enduit de polyacrylamide et recouvrez-la d’eau DI. Sécher les verres avec de l’air pressurisé.

Placez les verres sur une surface propre et plane. Couper un canal de trois millimètres de large dans le film de cire. La largeur totale est la même largeur que le glissement de couverture en verre à 20 millimètres.

Insérez la cire entre la glissière et le glissement de couvercle pour former un canal cellulaire d’écoulement pour le fluide. Adhérez le verre au film de cire en plaçant le complexe de cire de verre sur une plaque chaude de 80 degrés Celsius pour faire fondre la cire. Pendant la fonte, appuyez doucement sur le couvercle à l’aide d’une pointe de pipette pour coller uniformément le film de cire aux surfaces vitrées.

Après l’adhérence, refroidir le complexe de verre à température ambiante. Chargez rapidement les fluides actifs préparés jusqu’au canal d’écoulement avec la pointe de la pipette à un angle éloigné de l’ouverture du canal et en contact avec la surface de la glissière en verre. Sceller le canal avec de la colle UV.

Après avoir construit une configuration de contrôle de température, placez l’échantillon de fluide actif sur la surface du saphir avec le côté de la glissière en contact avec la surface. Fixez la glissière en verre avec du ruban adhésif. À l’aide de ruban de cuivre, fixez le ThermoSensor à la surface du glissement du couvercle.

Pour monter l’installation sur une scène de microscope, avec la glissière de glissement de couverture orientée vers les objectifs, fixez la configuration avec des pinces d’aiguille d’étape de microscope. Allumez le contrôleur de température et la pompe à réservoir de poisson. Suivez le guide des fabricants pour fixer la température cible.

Activer le contrôle de la température. Et enregistrez les données de température ThermoSensor. Imagez l’échantillon avec un intervalle de temps constant sur une microscopie fluorescente équipée d’un cube de filtre GFP pour surveiller les particules traceurs étiquetées Alexa 488 dans le mélange actif.

Ajustez l’intervalle de temps pour permettre au déplacement du traceur entre les images d’être à moins de neuf pixels. Pour les traceurs d’imagerie se déplaçant à 10 micromètres par seconde, à l’aide d’un objectif quatre fois, l’intervalle de temps est recommandé d’être de une à cinq secondes. Enregistrez les images sous forme de fichiers TIF, nommez les fichiers en fonction du numéro d’image et stockez-les dans un dossier distinct.

Pour ces fluides actifs à base de microtubules entraînés par la kinésine, la température a été contrôlée à 10, 20, 30 et 40 degrés Celsius. La fluctuation de température a été dans zéro point un à zéro point trois degrés Celsius pendant quatre heures démontrant la stabilité et la fiabilité de cette configuration de contrôle de la température. Les traceurs étaient photographiés toutes les deux secondes, ce que les images séquentielles permettaient de suivre les trajectoires des traceurs.

Les vitesses moyennes mesurées entre 20 et 36 degrés Celsius semblaient être presque indépendantes du temps à zéro à deux heures. Là où, à 10 et 40 degrés Celsius, les vitesses moyennes se sont rapidement détériorées en fonction de la dépolymerisation des microtubules inférieure à 16 degrés Celsius et des grappes de kinésine qui dysfonctionnement au-dessus de 36 degrés Celsius respectivement. Lorsque les températures du système ont été alternées entre 20 et 30 degrés Celsius toutes les 30 minutes, les vitesses moyennes des fluides actifs ont non seulement accéléré et ralenti en conséquence, mais elles ont également réagi au changement de température dans les 10 secondes.

Les liquides actifs commencent à mal fonctionner lorsqu’ils sont refroidis en dessous de 16 ou chauffés au-dessus de 36 degrés. Ainsi, lors de la manipulation du contrôleur de température, assurez-vous que la température est comprise entre 16 et 36 degrés. La capacité d’accorder le fluide actif localement, permet de diriger la puissance du fluide comme la livraison de cargaisons du point A au point B ou le développement d’un dispositif de microfluidité qui ne nécessite pas de valve physique.

L’acrylamide utilisé pour enduire la verrerie est une neurotoxine qui peut absorber à travers la peau. Portez l’équipement protecteur approprié tel que des gants, des manteaux de laboratoire et des lunettes de sécurité pour réduire au minimum le risque.