Name: Détection des transcriptions de lARN de type 1 (VIH-1) de protéine antisens (ASP) de détection du virus de limmunodéficience humaine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Découvrez une technique de détection spécifique des ARN antisens chez VIH-1 utilisant des amorces biotinylées et une dénaturation à haute température. Cette méthode permet d'identifier la protéine ASP comme nouvel antigène thérapeutique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick et Matthieu Perreau d'être toujours disponibles pour discuter de notre travail et de toutes les personnes du Laboratoire d'immunopathogenèse du sida pour leur précieuse assistance technique. Nous tenons également à remercier John et Aaron Weddle de VSB Associated Inc. qui ont contribué avec d'excellentes œuvres d'art. Enfin, un grand merci à tous les patients, sans qui ce travail n'aurait pas été possible. Ces travaux n'ont reçu aucune subvention spécifique d'un organisme de financement.

Cette étude a été approuvée par la Commission d'examen institutionnel du Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV).
1. Infection des cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC) par soucheHXB2 VIH-1
<ol><li>
Jour 1: PBMCs STIMULATION
	<ol>
<li>Isoler les PBMC d'un pelage velauve de donneur sain.</li>
		<li>Compter et resuspendre les PBMC à une concentration de 1x106/mL dans le milieu complet du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine (R-10), avec l'ajout de 50 U/mL d'interleukine-2 (IL-2) et de 3 g/mL phytomagglutine (PHA).</li>
		<li>Pipet de haut en bas et diviser les cellules en deux plaques de six puits (3 ml de suspension cellulaire / puits).</li>
		<li>Incuber pendant 3 jours à 37 oC et 5 % de CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Jour 3: PBMCs INFECTION REMARQUE : Utilisez l'une des deux plaques comme à l'étape 1.1.3 comme contrôle négatif (ne pas infecter ces cellules). CAUTION: Effectuer l'ensemble de la procédure dans un laboratoire de niveau de biosécurité III (P3).<ol>
<li>Mettre en commun les PBMC d'une assiette dans un tube de faucon de 50 ml et une centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min.</li>
		<li>Jeter le supernatant et resuspendre les cellules dans 2,2 mL de R-10 contenant 20 U/mL d'IL-2 et 2 polybrenes g/mL.</li>
		<li>Décongeler les flacons contenant le virusVIH-1 HXB2 et ajouter 1,8 ml de suspension virale (0,376 ng/L) aux cellules.</li>
		<li>Incuber les cellules pendant 2 h à 37 oC, en faisant tourbillonner doucement le tube toutes les 30 minutes.</li>
		<li>Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min.</li>
		<li>Jeter le supernatant et resuspendre les cellules à 1x106/mL dans R-10 contenant IL-2 (50 U/mL).</li>
		<li>Transférer la suspension cellulaire dans une plaque de 24 puits à une concentration de 1 ml/puits et incuber pendant 5 jours à 37 oC et 5 % de CO2.</li>
		<li>Récoltez 1 puits chaque jour et transférez les cellules dans un tube de 1,5 ml (étiqueté le jour de l'infection). REMARQUE : Avant la centrifugation, transférer 150 l de suspension cellulaire dans un tube de cytométrie d'écoulement pour le contrôle de la qualité de l'infection par les PBMC (voir l'étape 1.3)</li>
		<li>Centrifuger les tubes à 400 x g pendant 10 min et jeter le supernatant.</li>
		<li>Congeler les granulés de cellules à -80 oC jusqu'à l'utilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Infection des PBMC : contrôle de la qualité
	<ol>
<li>Pour chaque jour d'infection, collectez 150 L de PBMC infectés et transférez-les dans un tube de cytométrie d'écoulement.</li>
		<li>Ajouter 1 ml de saline tamponnée en phosphate (PBS) et centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Jeter le supernatant et ajouter 50 OL de PBS contenant 1 l de colorant Aqua vivant/mort (précédemment dilué 1:10 avec PBS).</li>
		<li>Incuber à 4 oC pendant 15 min.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de PBS, centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min, et jeter le supernatant.</li>
		<li>Ajouter 250 l de solution de fixation/perméabilisation et incuber pendant 20 min à température ambiante dans l'obscurité.</li>
		<li>Ajouter 1 ml de 1x Perm/Wash Buffer (10x solution de bouillon contenant à la fois FBS et saponin eillue 1:10) et centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Jetez le supernatant et ajoutez 50 L de PBS contenant le VIH Gag p24 isorescéine isothiocyanate (FITC) anticorps conjugués (dilué 1:10).</li>
		<li>Incuber pendant 20 min à température ambiante dans l'obscurité.</li>
		<li>Ajouter 1 ml de PBS, centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min, et jeter le supernatant.</li>
		<li>Ajouter 150 l de x CellFIX (10x solution de stock contenant 10% de formaldéhyde, 3,55% de méthanol, 0,93% d'azide de sodium dilué 1:10) et analyser les cellules par cytométrie de flux.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Stimulation des lymphocytes T CD4MD humains avec des anticorps anti-CD3/CD28
<ol><li>Isoler les lymphocytes T CD4MD des PBMC des patients infectés par le VIH-1 et des donneurs en bonne santé.</li>
	<li>Préparer le mélange humain d'anticorps anti-CD3/CD28 en diluant les anti-CD3 (1:100) et les anti-CD28 (1:50) en PBS.</li>
	<li>Enrober une assiette de 48 puits en ajoutant 200 l de mélange d'anticorps par puits à un nombre approprié de puits et incuber à 37 oC pendant 2 h.</li>
	<li>Aspirez la solution d'anticorps et ajoutez 1 mL de cellules CD4-T à 1x106/mL aux puits anti-CD3/CD28 enduits d'anticorps. REMARQUE : Stimulez les lymphocytes T CD4MD jusqu'à 5 jours.</li>
</ol>3. Transcription inversée
REMARQUE : Pour obtenir des amorces spécifiques au patient, l'ADN proviral isolé des cellules CD4-T de chaque patient a été amplifié à l'aide d'amorces DE PNS PanHXB2 VIH-1. Les amorces spécifiques aux patients ont été conçues à l'aide de la séquence provirale interne aux amorces Pan ASP. Toutes les amorces et sondes utilisées dans cette étude sont énumérées dans le tableau 2.
<ol><li>
Isoler l'ARN total des cellules
	<ol>
<li>Quantifier l'ARN et éliminer la contamination par l'ADN en traitant les échantillons avec dNase.</li>
		<li>Effectuer des réactions de RT dans un volume de 50 L. Transférer 0,1-1 g d'ARN total dans un nombre approprié de puits d'une plaque PCR de 96 puits. Préparer le mélange d'ARN en ajoutant les composants suivants à l'ARN : 5 L d'amorce inverse ASP biotinylated (20 M) 2,5 L de triphosphates de désoxynucléotide (dNTP) (10 mM) 25 ldddadien (DEPC) d'eau distillée traitée par diethylpyrocarbonate (dH2O). Préparer les contrôles RT endogènes en ajoutant 5 L d'eau sans nucléane à la place de l'amorce inverse ASP biotinylated.</li>
		<li>Placer la plaque DE 96 puits PCR dans un thermocycler et chauffer le mélange d'ARN à 94 oC pendant 5 min.</li>
		<li>Refroidir immédiatement le mélange d'ARN dans l'eau glacée pendant au moins 1 min.</li>
		<li>Préparer le mélange de réaction en ajoutant les composants suivants à un tube de 1,5 ml (calculer le nombre total d'échantillons plus 1) : 10 l de tampon DE 5x RT 2,5 L de 0,1 M de 1,4-dithiothreitol (TNT) 2,5 L de RNase out (40 unités/L) 2,5 l d'enzyme RT (200 unités/L)</li>
		<li>Transférer 17,5 L de ce mélange dans chacun des puits contenant de l'ARN. Préparer les commandes RT-moins remplaçant la transcriptase inverse par 2,5 L d'eau sans nucléane.</li>
		<li>Mélanger délicatement et incuber la plaque à 55 oC pendant 60 min à l'aide d'un thermocycleur.</li>
		<li>Inactiver les réactions en chauffant à 70 oC pendant 15 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Purification d'affinité de l'ADNc biotinylated ASP
REMARQUE : Ne purifie pas les réactions RT-moins.
<ol><li>Préparer 1 L de 2x tampon de lavage/liaison contenant 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA) et 2 M NaCl. Filtrer la solution.<ol>
<li>Préparer 50 ml de tampon de lavage/liaison 1x à l'aide d'eau de qualité PCR.</li>
		<li>Pour chaque réaction, utilisez 10 L de perles magnétiques conjuguées à la streptavidine. Sur la base du nombre de réactions, transférer un volume approprié de perles dans un tube de 1,5 ml.</li>
		<li>Laver les perles en ajoutant un volume égal de 2x tampon de lavage/ de liaison et de vortex pendant 15 s.</li>
		<li>Placer le tube dans un support de séparation magnétique et couver pendant 3 minutes à température ambiante.</li>
		<li>Retirez soigneusement le supernatant sans déranger les perles et ajoutez le même volume de tampon 2x de lavage/liaison que le volume initial de perles.</li>
		<li>Vortex pour 30 s et transférer 10 l de la suspension de perles à un nombre approprié de tubes de 1,5 ml.</li>
		<li>Placer les tubes dans un support de séparation magnétique et couver pendant 3 min à température ambiante.</li>
		<li>Jeter le supernatant et ajouter 50 l de tampon de lavage/liaison 2x.</li>
		<li>Ajouter 50 L d'ADNc biotinylated aux tubes correspondants contenant les perles.</li>
		<li>Incuber pendant 30 min à température ambiante en tournant doucement.</li>
		<li>Séparer les perles du supernatant par un support de séparation d'aimant pendant 3 min à température ambiante.</li>
		<li>Laver les perles en ajoutant 200 ll de 1x tampon de lavage/liaison. Placer les tubes dans un support de séparation de l'aimant pendant 3 min à température ambiante et jeter le supernatant. Répétez deux fois.</li>
		<li>Resuspendre les perles dans 10 L d'eau de qualité PCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. PCR standard
REMARQUE : Le but du PCR standard est d'amplifier l'ensemble de l'ORF du gène ASP. Les produits d'amplification sont ensuite clonés en plasmide pCR2.1 pour développer des courbes standard pour la quantification de l'ARN ASP par PCR en temps réel (voir le paragraphe PCR en temps réel).
<ol><li>Effectuez des PCR standard dans un volume total de 50 L. Préparer un volume approprié de mix principal PCR (nombre d'échantillons plus 1). Pour chaque échantillon, ajouter les composants suivants à un tube de 1,5 ml : 1 L de 10 amorces ASP M (avant et inverse) 1 L de 10 mL dNTP Chlorure de magnésium (MgCl2) (la concentration dépend des amorces utilisées) dH2O à un volume final de 49 L<ol>
<li>Bien mélanger, faire tourner rapidement le contenu et transférer 49 L/puits du mix PCR master sur une plaque PCR de 96 puits.</li>
		<li>Vortex soigneusement les tubes contenant les perles utilisées pour la purification d'affinité ASP cDNA pour 15 s.</li>
		<li>Ajouter 1 l de perles dans les puits correspondants et exécuter le PCR en utilisant le programme suivant : 95 oC pendant 2 min, 40 cycles de 95 oC pour 30 s, 55 oC pour 30 s et 68 oC pour 40 s, puis 68 oC pour 7 min.</li>
		<li>Séparez les produits PCR sur le gel agarose à 1 %, coupez les bandes et clonez les produits amplifiés en plasmide pCR2.1.</li>
		<li>Séquenceetetet et analyse des séquences de chaque clone.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. PCR quantitatif en temps réel (qPCR)
REMARQUE : Développer des amorces et des sondes spécifiques au patient à l'aide de l'approche décrite à l'étape 3 « Transcription inversée ». Pour qPCR inclure ASP dilutions plasmide pour les courbes standard. Les plasmides contenant des inserts spécifiques au patient sont développés comme mentionné dans la note au début de l'étape 5 « PCR standard ».
<ol><li>Préparer la courbe standard à l'aide de 1:10 ASP plasmides dilutions série à partir de 3 x 106 copies / L jusqu'à 3 copies / L.<ol>
<li>
Premier tour PCR (pré-ampli). Effectuer des réactions dans un volume total de 25 L. Préparer un volume approprié de mix principal PCR (nombre d'échantillons plus 1). Pour chaque échantillon, ajouter les composants suivants à un tube de 1,5 ml : 0,5 L de mélange d'APA ou d'env (concentration finale de 0,2 M chacun) (avant et revers) 0,5 l de mélange de dNTP (concentration finale de 0,2 mM chacun) MgCl2 (la concentration dépend des paires d'amorces) dH2O à un volume final de 24 L</li>
		<li>Transférer 24 L de mélange maître PCR à un nombre approprié de puits d'une plaque PCR de 96 puits.</li>
		<li>Vortex soigneusement les tubes contenant les perles avec l'ADNc pendant 15 s.</li>
		<li>Ajouter 1 l de perles aux puits correspondants. Faites de même pour les dilutions plasmides.</li>
		<li>Exécuter le PCR à l'aide de l'algorithme suivant : dénaturation pendant 2 min à 95 oC ; 30 s à 95 oC, 30 s à 55 oC, 40 s à 68 oC pendant 18 cycles; extension à 68 oC pendant 7 min.</li>
		<li>Diluer les réactions pcR premier tour 1:5 avec l'eau de qualité PCR.</li>
		<li>
Deuxième tour qPCR. Effectuer des réactions dans un volume total de 20 L. Préparer un volume approprié de mix principal PCR (nombre d'échantillons plus 1). Pour chaque échantillon, ajouter les composants suivants à un tube de 1,5 ml : 1,8 L 10 M amorces (avant et revers) 1 l de sonde de 5 M 6,2 l de dH2O</li>
		<li>Transférer 19 l de mélange de maître qPCR dans un nombre approprié de puits d'une plaque qPCR de 96 puits et ajouter 1 L des réactions PCR diluées du premier tour aux puits correspondants. Faites de même pour les dilutions plasmides.</li>
		<li>Exécuter le qPCR avec l'algorithme suivant : dénaturation pendant 10 min à 95 oC; 15 s à 95 oC, 1 min à 60 oC pendant 40 cycles.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+may+encode+a+novel+protein+on+the+genomic+DNA+plus+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand.</a> Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).</li>
<li>Vanheebrossollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Natural+Antisense+Rna+Derived+from+the+Hiv-1+Env+Gene+Encodes+a+Protein+Which+Is+Recognized+by+Circulating+Antibodies+of+Hiv%2B+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals.</a> Virology. 206 (1), 196-202 (1995).</li>
<li>Briquet, S., Vaquero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolocalization+studies+of+an+antisense+protein+in+HIV-1-infected+cells+and+viral+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles.</a> Virology. 292 (2), 177-184 (2002).</li>
<li>Clerc, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+expression+of+the+membrane+ASP+protein+derived+from+HIV-1+antisense+transcription+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells.</a> Retrovirology. 8, 74(2011).</li>
<li>Landry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+characterization+and+regulation+of+antisense+transcripts+in+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 71(2007).</li>
<li>Kobayashi-Ishihara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1-encoded+antisense+RNA+suppresses+viral+replication+for+a+prolonged+period%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period.</a> Retrovirology. 9, 38(2012).</li>
<li>Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+asp+expression+by+alternative+splicing+in+the+upstream+untranslated+region%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region.</a> DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).</li>
<li>Laverdure, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Antisense+Transcription+Is+Preferentially+Activated+in+Primary+Monocyte-Derived+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).</li>
<li>Zapata, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Immunodeficiency+Virus+1+ASP+RNA+promotes+viral+latency+by+recruiting+the+Polycomb+Repressor+Complex+2+and+promoting+nucleosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly.</a> Virology. 506, 34-44 (2017).</li>
<li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10 (5), 0120043(2015).</li>
<li>Lerat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+detection+of+hepatitis+C+virus+minus+strand+RNA+in+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).</li>
<li>Tuiskunen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-priming+of+reverse+transcriptase+impairs+strand-specific+detection+of+dengue+virus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA.</a> J Gen Virol. 91, Pt 4 1019-1027 (2010).</li>
<li>Mancarella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+antisense+protein+%28ASP%29+RNA+transcripts+in+individuals+infected+with+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).</a> Journal of General Virology. , (2019).</li>
<li>Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+in+vitro+falsely-primed+cDNAs+that+prevent+specific+detection+of+virus+negative+strand+RNAs+in+dengue-infected+cells%3A+improvement+by+tagged+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR.</a> J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).</li>
<li>Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+approaches+to+the+analysis+of+deformed+wing+virus+replication+and+pathogenesis+in+the+honey+bee%2C+Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera.</a> Virol J. 6, 221(2009).</li>
<li>Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+purification+of+biotinylated+cDNA+removes+false+priming+and+ensures+strand-specificity+of+RT-PCR+for+enteroviral+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs.</a> J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).</li>
<li>Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+strand-specific+RT-PCR+based+assay+to+detect+the+replicative+form+of+hepatitis+C+virus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA.</a> J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).</li>
<li>Barbeau, B., Mesnard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+sense+out+of+antisense+transcription+in+human+T-cell+lymphotropic+viruses+%28HTLVs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs).</a> Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu'il n'y a pas de conflitdds d'intérêts.

Dans ce rapport, nous décrivons un essai de RT spécifique au brin appliqué à la détection de l'ARN ASP dans les cellules T CD4MD isolées chez des personnes infectées par le VIH-1. L'occurrence de l'amorçage non spécifique pendant RT entrave la détection des transcriptions d'ARN avec la polarité droite, menant à l'interprétation erronée des résultats. Les groupes précédents ont développé plusieurs stratégies visant à empêcher la synthèse d'ADNc amorce-indépendante pendant la réaction de RT. Le marquage de l'amorce inverse...

Le gène de protéine antisens (ASP) est un cadre de lecture ouvert (ORF) situé sur le brin négatif du gène de l'enveloppe du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) (env), couvrant la jonction gp120/gp411. Au cours des 30 dernières années, plusieurs rapports ont montré que le gène DUVIH est en effet transcrit et traduit2,3,4,5,6,7,8,9. Bien que les transcriptions antisense d'ASP aient été entièrement caractérisées in vitro,jusqu'à récemment l'information au sujet de la production réelle de l'ARN d'ASP dans les patients était toujours manquante.
La séquence de l'ASP est inversée et complémentaire à env. Cela représente un obstacle majeur lorsque vous essayez de détecter les transcriptions pour ASP. Les méthodes standard de réaction en chaîne de transcription-polymérase inverse (RT-PCR) utilisent des amorces antisens spécifiques aux gènes pour synthétiser les ANN complémentaires (CDNA) de la polarité droite. Cette approche, cependant, ne permet pas de déterminer l'orientation (sens ou antisens) du modèle initial d'ARN, puisque les épingles à cheveux ou les boucles d'ARN peuvent primer RT dans les deux directions en l'absence des amorces10,un phénomène connu sous le nom d'auto-amorçage de RT. La plupart des chercheurs de l'ASP écartent le problème de l'auto-amorçage de RT à l'aide d'amorces étiquetées avec des séquences qui ne sont pas liées au VIH-111,12. Toutefois, cette stratégie n'élimine pas l'occurrence du phénomène et peut entraîner un report potentiel des ADCD non spécifiques dans le PCR11.
Nous avons récemment mis au point un nouvel essai RT-PCR spécifique au brin pour l'étude de l'ARN antisens et nous l'avons utilisé pour la détection de l'ARN ASP dans une cohorte de six patients infectés par le VIH, comme le montre le tableau 1. La procédure décrite ci-dessous a déjà été publiée par Antonio Mancarella et coll.13. Dans notre protocole, nous évitons la production de CDNA non spécifiques par une double approche. Tout d'abord, nous éliminons les structures secondaires de l'ARN en dénaturant l'ARN à haute température (94 oC), et deuxièmement, nous rincions l'ARN ASP à l'aide d'une amorce spécifique à l'ASP biotinylated et l'affinité purifie l'ADNc résultant. Par cette approche, nous sommes en mesure d'amplifier seulement notre cDNA cible, puisque d'autres produits NON spécifiques de RT sont empêchés d'être générés (dénaturation à haute température de l'ARN) ou éliminés avant PCR (purification d'affinité).

<table><tbody><tr><td>BD LSR II</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v1.1 Kit de séquençage de cycle</td><td>Biosystème appliqué, Thermo Fisher Scientific</td><td>4337450</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set (100 mM)</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>11205D</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human CD4+ Lymphocyte T Kit d’isolement</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin fœtal</td><td>Biowest</td><td>S1010-500</td><td></td></tr><tr><td>Kit de solution de fixation/perméabilisation</td><td>Becton Dickinson</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>HIV Gag p24 anticorps de cytométrie en flux - Kc57-FITC</td><td>Beckman Coulter</td><td>6604665</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-743</td><td></td></tr><tr><td>Lectine de Phaseolus vulgaris (PHA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61764-1MG</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de coloration à cellules mortes jaunes fixables, pour excitation à 405 nm</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>L34967</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-humaine CD28</td><td>Becton Dickinson</td><td>55725</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-humaine CD3</td><td>Becton Dickinson</td><td>55329</td><td></td></tr><tr><td>Amorces et sondes</td><td>ADN intégré Technologies (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq ADN polymérase Haute Fidélité</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene Infection / Transfection Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Medium Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master</td><td>Mix Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>4369016</tr><tr><td>Kit de clonage TOPO TA pour le sous-clonage, avec des cellules E. coli chimiquement compétentes One Shot TOP10</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>K450001</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNase (2 U/&micro ; L)</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Veriti Thermocycleur</td><td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td><td>4375786</td><td></td></tr></tbody></table>

détection des transcriptions de l'arn de type 1 (vih-1) de protéine antisens (asp) de détection du virus de l'immunodéficience humaine

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Dans les rétrovirus, la transcription d'antisense a été décrite dans le type 1 de virus d'immunodéficience humaine (HIV-1) et le virus T-lymphotropic humain 1 (HTLV-1). Dans LE VIH-1, le gène ASP de protéine antisens est situé sur le brin négatif de l'env, dans le cadre de lecture -2, couvrant la jonction gp120/gp41. Dans le sens de l'orientation, la fin de 3' du cadre de lecture ouverte ASP chevauche avec les régions hypervariables gp120 V4 et V5. L'étude de l'ARN ASP a été contrecarrée par un phénomène connu sous le nom de RT-auto-amorçage, par lequel les structures secondaires d'ARN ont la capacité de premier rinçage RT en l'absence de l'amorce spécifique, générant des cDNAs non spécifiques. L'utilisation combinée de la dénaturation à haut ARN avec des amorces inverses biotinylated dans la réaction de RT, avec la purification d'affinité de l'ADNc sur les perles magnétiques streptavidin-enduites, nous a permis d'amplifier sélectivement l'ARN d'ASP dans les cellules De T CD4MD dérivées des individus infectés par HIV-1. Notre méthode est relativement peu coûteuse, simple à exécuter, très fiable et facilement reproductible. À cet égard, il représente un outil puissant pour l'étude de la transcription antisens non seulement dans le VIH-1, mais aussi dans d'autres systèmes biologiques.

La dénaturation à haute température de l'ARN couplée à la purification d'affinité de l'ADNc biotinylated empêche l'amplification des produits ASP non spécifiques pendant PCR dans les PBMCs infectés in vitro et dans les cellules T CD4MD isolées des patients. RT auto-amorçage a été montré pour se produire lors de la transcription inverse des ARN antisens10,14,15,16,<sup class=...

Les épingles à cheveux et les boucles d'ARN peuvent fonctionner comme amorces pour la transcription inverse (RT) en l'absence des amorces séquence-spécifiques, interférant avec l'étude des transcriptions antisense de chevauchement. Nous avons mis au point une technique capable d'identifier l'ARN spécifique aux brins, et nous l'avons utilisée pour étudier la protéine antisens HIV-1 ASP.

Détection des transcriptions de l'ARN de type 1 (VIH-1) de protéine antisens (ASP) de détection du virus de l'immunodéficience humaine

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

Les RT-PCR conventionnels ne permettent pas la discrimination entre les séquences de sens et d’anti-sens lorsqu’ils sont utilisés pour détecter les ARN codés par des gènes qui se chevauchent. Ce protocole permet de détecter spécifiquement les ARN anti-sens. L’utilisation d’amorces biotynylated avec des températures élevées de dénaturation d’ARN permet l’amplification des cDNA anti-sens, empêchant la formation des produits non spécifiques de RT.Nous avons utilisé cette méthode pour démontrer que l’ASP, soit comme anti-sens arn, soit comme précurseur de protéines, c’est un nouvel antigène anti-VIH, est-ce potentiellement une nouvelle cible pour le VIH pour le traitement. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel système, dans lequel des ARN anti-sens provenant de gènes qui se chevauchent peuvent être détectés. Commencez par concevoir des amorces spécifiques aux patients à l’aide de la séquence d’ADN pro-virale interne aux amorces PanASP.Ensuite, quantifier l’ARN et éliminer la contamination par l’ADN en traitant les échantillons avec du DNase. Transférer entre 0,1 et un microgramme d’ARN total dans les puits appropriés sur une plaque PCR de 96 puits. Ensuite, configurer la transcription inverse, ou réaction RT, selon les instructions manuscrites.Préparez les commandes endogènes de RT en ajoutant cinq microlitres d’eau libre de nucléase au lieu de l’amorce inverse d’ASP. Mettez la plaque dans le thermocycleur et chauffer l’ARN à 94 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, refroidissez-le immédiatement dans de l’eau glacée pendant au moins une minute.Préparer le mélange de réaction dans un tube de 1,5 millilitre tel que décrit dans le manuscrit du texte, puis transférer 17,5 microlitres à chacun des puits contenant de l’ARN. La dénaturation de l’ARN doit être effectuée à 94 degrés Centigrades. Sans dénaturation totale, des synthèses de produits non spécifiques à partir d’ARN de sens peuvent se produire, conduisant à l’amplification des ADNN non spécifiques.Mélanger délicatement le contenu des puits et incuber la plaque à 55 degrés Celsius pendant 60 minutes. Ensuite, inactivez les réactions en chauffant la plaque à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes. Préparez un litre de tampon de lavage et de liaison 2X selon les instructions manuscrites et filtrez la solution.Ensuite, préparez 50 millilitres de tampon de lavage et de liaison 1X à l’aide d’eau de qualité PCR. Transférez le nombre approprié de perles magnétiques conjuguées à la streptavidine dans un tube de 1,5 millilitre, puis lavez-les en ajoutant un volume égal de tampon de lavage et de liaison 2X et en vortexant le tube pendant 15 secondes. Placez le tube dans un support de séparation magnétique et incubez-le pendant trois minutes à température ambiante.Ensuite, retirez soigneusement le supernatant sans déranger les perles et ajoutez le même volume du tampon de lavage et de fixation 2X que le volume initial des perles. Vortex les perles pendant 30 secondes et transférer 10 microlitres de la suspension à un nombre approprié de tubes de 1,5 millilitre. Placez les tubes dans le support de séparation magnétique et incubez-les pendant trois minutes à température ambiante.Ensuite, jetez le supernatant et ajoutez 50 microlitres de tampon de lavage et de liaison 2X. Ajouter 50 microlitres de cDNA biotynylé aux tubes correspondants avec les perles et les incuber pendant 30 minutes tout en tournant doucement. Après l’incubation, placer les tubes sur la grille de séparation magnétique pendant trois minutes, puis laver les perles avec 200 microlitres de tampon de lavage et de liaison 1X, suivi d’une incubation de trois minutes sur la grille de séparation.Jeter le surnatant et répéter le lavage deux fois. Ensuite, resuspendez les perles dans 10 microlitres d’eau de qualité PCR. Préparez un volume approprié de PCR Master Mix selon les instructions manuscrites.Bien mélanger et le faire tourner rapidement vers le bas, puis transférer 49 microlitres par puits à une plaque PCR 96 bien. Vortex soigneusement les tubes avec le cDNA purifié pendant 15 secondes et ajouter un microlitre de la suspension aux puits correspondants. Exécutez le PCR et séparez les produits sur un gel agarose de 1%.Couper les bandes du gel et cloner les produits amplifiés dans un plasmide PCR 2.1. Séquencez ensuite les clones et analysez chaque séquence. Les réactions initiales de RT ont été exécutées avec l’amorce anti-sens non biotynylated régulière et ont eu comme conséquence l’amplification réussie d’ASP.Cependant, une bande du même poids moléculaire et des contrôles d’amorce moins a également été amplifiée. Pour contourner ce problème, l’amorce anti-sens spécifique a été étiquetée avec du biotyn et l’ADN anti-sens qui en a résulté a été purifiée avant pcr. Cela a permis d’amplifier la séquence ASP avec une contamination considérablement réduite de l’ADNC non spécifique dans l’amorce moins les contrôles.D’autres optimisations de cette méthode ont été réalisées par dénaturation complète de l’ARN à 94 degrés Celsius avant rt, suivie d’un refroidissement immédiat sur l’eau glacée, ce qui a entraîné une amplification efficace de la bande ASP et aucun produit non spécifique. La cinétique de l’ARN ASP a été mesurée et les cellules CD4 isolées de trois sujets séropositifs atteints de viremia détectable et d’une absence de thérapie après stimulation avec anti-CD3/CD28. La quantification de l’ARN d’ASP était également possible dans les patients subissant la multithérapie, avec viremia non détectable.Dans deux patients sur trois, l’ARN d’ASP a été détecté dans les niveaux bas à trois à cinq jours après stimulation. Deux patients ont été analysés pour ASP et ENV ARN, un non traité et un traité. Pour le patient non traité, les deux ARN pourraient être détectés.Pour le patient traité, ASP et env étaient à peine détectables après plusieurs jours de stimulation. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de se rappeler que la dénaturation linéarise l’ARN de sorte que les structures secondaires capables d’amorce RT sont détruites. Attendu que le lavage des perles chasse les CDA non biotynylés.Après purification des CDA avec la polarité correcte, qPCR peut être effectué pour analyser l’expression des gènes. En outre, les ADN peuvent également être clonés et utilisés pour l’analyse des séquences. Cette méthode permet d’étudier les gènes qui se chevauchent dans une orientation opposée et peut être utile pour élucider la régulation et la pathogénie d’une bactérie et d’une maladie liée au virus, y compris certains types de cancer.

detection-human-immunodeficiency-virus-type-1-hiv-1-antisense-protein

Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

VIH tropisme peut être déduite de la région V3 de l'enveloppe virale. V3 est amplifié par PCR en triple en utilisant RT-PCR nichée, séquencé, et interprétées en utilisant un logiciel de bioinformatique. Les échantillons ayant des séquences 1 ou plusieurs (s) avec des scores faibles G2P sont classés comme non-virus R5.

Inférence génotypique de tropisme du VIH-1 en utilisant la population basée séquençage du V3

Plusieurs 2'-fluoro aptamères d'ARN contre le VIH-1BA-L gp120 avec nanomole affinité sont isolées à partir d'une bibliothèque d'ARN...

Développement d&#39;un type de cellule spécifique anti-VIH gp120 aptamères pour la livraison de siRNA

La quantification des niveaux d'ARN VIH-1 dans le plasma et le séquençage seule VIH-1 génomes d'individus ayant une charge virale en dessous de la limite de détection (50-75 copies / ml) est difficile. Nous décrivons ici comment extraire et de quantifier les ARN viral plasmatique à l'aide en temps réel PCR que les mesures de manière fiable ARN VIH-1 à 0,3 copies / ml et comment amplifier les génomes viraux par séquençage du génome unique, à partir d'échantillons à très faible charge virale.

Amplifier et quantifier l&#39;ARN VIH-1 chez les individus infectés par le VIH ayant une charge virale sous le seuil de détection par Standard tests cliniques

La détection de l&#39;ARN viral par fluorescence<em&gt; In situ</emHybridation&gt; (FISH)

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

tests de résistance des médicaments pour le VIH-1 individus infectés échec d'un traitement antirétroviral (ART) peut guider les futurs traitements et d'améliorer les résultats du traitement. Optimisation des individus et des populations résultats pour la santé de la prévalence élevée du VIH, mais les pays à ressources limitées finira par exiger le génotypage de la résistance aux médicaments abordables et accessibles et méthodes d'interprétation.

Une méthode de surveillance abordable VIH-1 pour la résistance aux médicaments à ressources limitées

La présence de VPH à risque élevé dans le tissu tumoral tête et du cou est associé à des résultats favorables. L'ARN a récemment mis au point une technique d'hybridation in situ appelé RNAscope permet la visualisation directe de l'ARNm E6/E7 de HPV dans des coupes de tissu FFPE.

RNAscope pour<em&gt; In situ</em&gt; Détection des actifs de transcription virus du papillome humain dans la tête et du cou carcinome spinocellulaire

La compétition de croissance entre virus quasi isogéniques fournit une mesure sensible pour déterminer la valeur relative de réplication. Les protocoles décrits ici comprennent la construction de clones recombinants du VIH-1, la propagation et la compétition de croissance du virus et des méthodes d’analyse optimisées pour produire des résultats sensibles et cohérents.

Pairwise croissance de la concurrence analyse pour déterminer la condition physique réplication du virus de l&#39;immunodéficience humaines

Fournit un protocole pour développer un test d’amplification de la polymérase recombinase en temps réel afin de quantifier la concentration initiale d’échantillons d’ADN à l’aide d’un thermocycleur ou d’un microscope et d’un réchauffeur de platine. Le développement d’un contrôle positif interne est également décrit. Des scripts sont fournis pour le traitement des données brutes de fluorescence en temps réel.

Développement d&#39;un Quantitative recombinase polymérase L&#39;amplification Assay avec un contrôle positif interne

Nous présentons une approche de séquençage en profondeur qui fournit une détermination impartiale du naissant 3'-termini ainsi que des profils de mutations des molécules d’ADN simple brin. L’application principale est la caractérisation de naissants DNAs rétrovirales complémentaires (ADNc), les intermédiaires générés lors du processus de transcription inverse rétrovirale.

Déterminant des séquences de molécules monocaténaires naissant de l’ADN Viral au cours du VIH-1 et 3'-Termini Reverse Transcription dans les cellules infectées

Découvrez une technique de détection spécifique des ARN antisens chez VIH-1 utilisant des amorces biotinylées et une dénaturation à haute température. Cette méthode permet d'identifier la protéine ASP comme nouvel antigène thérapeutique.

Détection des transcriptions de lARN de type 1 (VIH-1) de protéine antisens (ASP) de détection du virus de limmunodéficience humaine (Vidéo) | JoVE Journal

Détection des transcriptions de l'ARN de type 1 (VIH-1) de protéine antisens (ASP) de détection du virus de l'immunodéficience humaine

Explorer plus de vidéos