Name: Dissection et coloration des gouttelettes lipidiques des oenocytes dans les larves de Drosophila (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: Découvrez la dissection des oenocytes et la coloration des gouttelettes lipidiques chez les larves de Drosophila avec le marqueur BODIPY 493/503. Cette méthode permet d'étudier le métabolisme lipidique sous conditions normales et de stress.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ces travaux ont été soutenus par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (31671422, 31529004 et 31601112), du projet 111 (D18010), du projet local d'innovation et de recherche du Guangdong Perl River Talents Program (2017BT01S155) et du China Postdoctoral Science Foundation (2018M640767).

1. Pontde d'oeufs
<ol><li>Préparer les aliments de semoule de maïs standard pour la ponte. REMARQUE: Pour la recette et la procédure de cuisson pour les aliments de semoule de maïs standard utilisés ici, voir les détails précédemmentpubliés 15.</li>
	<li>Préparer la pâte de levure fraîche en ajoutant 6 ml d'eau distillée à 4 g de levure séchée active dans un tube centrifuge de 50 ml. À l'emploi d'une spatule, mélanger et faire une pâte.</li>
	<li>Faire des bouteilles de ponte en remplissant les aliments de semoule de maïs dans les bouteilles et étaler environ 1 g de pâte de levure sur la surface de la nourriture de semoule de maïs avec une spatule.</li>
	<li>Placez les mouches des génotypes désirés dans une bouteille de ponte et placez-les dans un incubateur avec une température constante de 25 oC et une humidité de 60 %. REMARQUE: Les croisements idéaux se composent généralement de 150 mouches vierges et d'au moins 75 mâles. Garder les mouches dans l'obscurité en plaçant une boîte à l'épreuve de la lumière sur les bouteilles de ponte augmentera le taux de reproduction.</li>
	<li>Avant la collecte des œufs, laisser les mouches pondre des œufs pendant 1 h pour permettre l'enlèvement de tous les vieux œufs qui restent stockés dans les oviductes femelles.</li>
	<li>Laisser les mouches pondre des œufs dans une nouvelle bouteille de ponte pendant 1 h et retirer les adultes de la bouteille. REMARQUE: Contrôler le temps de ponte afin de minimiser l'aire de développement afin d'obtenir des larves à un stade de développement contrôlé avec précision.</li>
	<li>Laisser les œufs se développer pendant 84 h dans la troisième larve instar de l'incubateur à 25 oC avec un cycle clair/foncé de 12 h/12 h.</li>
</ol>2. Traitement de la famine pour les larves
REMARQUE: Comme mentionné ci-dessus, dans les troisièmes larves instar, il ya peu ou pas de gouttelettes lipidiques détectables dans les ovocytes dans des conditions d'alimentation normales, mais de nombreuses grosses gouttelettes lipidiques peuvent être induites dans les ovocytes dans des conditions de stress, comme la famine. Pour vérifier davantage cette méthode, il est nécessaire de précéder ces larves pour induire la biogenèse des gouttelettes lipidiques dans les oenocytes. Ici, un cours de temps de famine de 12 h, 24 h et 36 h a été choisi comme paradigme. En particulier, une courte période de famine (p. ex., 3 h) est suffisante pour induire des gouttelettes lipidiques détectables dans les ovocytes. La durée de la famine peut varier selon des objectifs et des paramètres expérimentaux spécifiques.
<ol><li>Faites des chambres pour la famine et contrôlez les traitements.<ol>
<li>Pour les chambres de traitement de la famine : placez un papier filtre de taille appropriée dans un plat Petri de 6 cm et une pipette de 1 ml de PBS sur le papier filtre.</li>
		<li>Pour les chambres de traitement de contrôle : placez 5 ml d'aliments de semoule de maïs Standard Bloomington dans le plat Petri.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilisez une spatule pour déterrer délicatement la couche supérieure d'aliments contenant des larves qui s'enfouissent encore dans la nourriture et transférez-les dans un plat Petri rempli de 5 ml de PBS. Remuer délicatement les larves dans le PBS pour éliminer toute contamination alimentaire des larves et les rendre aussi propres que possible.</li>
	<li>Utilisez un petit pinceau pour recueillir 40 larves instar tiers de la même taille approximative. Triez-les au hasard dans une chambre de famine ou de contrôle, avec 20 larves chacune.</li>
	<li>Placez les chambres dans l'incubateur à 25 oC avec 60 % d'humidité et laissez le développement pendant 12 h, 24 h et 36 h de traitement. REMARQUE: Pour les larves dans la chambre de famine, ajouter 1 ml de PBS toutes les 12 h pour éviter la déshydratation des larves.</li>
</ol>3. Dissection des oenocytes
<ol><li>Utilisez un petit pinceau pour cueillir des larves de l'âge approprié (12 h, 24 h ou 36 h après le traitement), puis transférez-les dans un nouveau plat Petri rempli de 5 ml de PBS glacé à laver. REMARQUE: Répétez l'étape 2.2 lorsque vous traitez avec des larves dans une chambre de contrôle pour éliminer toute contamination alimentaire.</li>
	<li>Remplissez une plaque de dissection de PBS glacé et utilisez des forceps pour transférer délicatement les larves dans la plaque de dissection. Placez la plaque de dissection sous un microscope stéréo pour l'étape suivante de dissection. REMARQUE: La température glaciale aidera à ralentir les mouvements des larves et facilitera la dissection.</li>
	<li>Tourner le côté ventral des larves vers le haut et le côté dorsal vers le bas et maintenir doucement en place à l'aide de forceps. Fixer les larves à la plaque de dissection en plaçant une goupille de dissection si le pharynx à l'extrémité antérieure et une autre broche à travers le spiracle à l'extrémité postérieure. REMARQUE: Le côté dorsal est plus facilement identifié par la présence des troncs dorsaux de la trachée.</li>
	<li>Utilisez des ciseaux de printemps Vannas pour inciser (longitudinalement) à travers l'épiderme de l'antérieure à l'extrémité postérieure.</li>
	<li>Enlever le tissu interne de l'épiderme à l'aide de forceps. REMARQUE: Il faut faire preuve de prudence lors de l'enlèvement des branches trachéales afin d'éviter des dommages aux œnocytes, qui sont localisés à la surface interne de l'épiderme.</li>
	<li>Avec les forceps, récupérer les goupilles de dissection et transférer l'épiderme dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml rempli de PBS sur la glace.</li>
	<li>Continuer à disséquer d'autres larves suivant la procédure décrite ci-dessus.</li>
</ol>4. Taches de gouttelettes de lipide
<ol><li>Incuber l'épiderme disséqué dans le tampon de fixation pendant 30 min à température ambiante (RT) sur un rotateur. REMARQUE: Le tampon de fixation contient 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans PBS.</li>
	<li>Retirez le tampon de fixation, suivi d'un lavage rapide. Pour effectuer un lavage rapide, ajouter 1 mL de PBS à RT dans le tube après l'élimination de PFA, resuspendre doucement les tissus, et jeter le PBS. MISE EN GARDE: Le tampon de fixation contient PFA, qui est nocif pour la santé humaine. Il est important d'éliminer correctement le tampon de fixation en tant que déchets dangereux.</li>
	<li>Laver les échantillons 3x pendant 5 min chacun avec PBS pour laver tous les résidus possibles de PFA.</li>
	<li>Incuber l'épiderme avec BODIPY 493/503 (1 g/mL; voir Table of Materials) pendant 30 min à RT sur un rotateur. REMARQUE: À partir de cette étape, enveloppez le tube de microcentrifuge avec un morceau de papier d'aluminium pour protéger les échantillons de la lumière et minimiser le possible photo-blanchiment.</li>
	<li>Retirez la solution de coloration BODIPY 493/503 et lavez les échantillons 3x pendant 10 min chacun avec PBS pour enlever complètement les colorants résiduels.</li>
</ol>5. Montage et imagerie
<ol><li>Placer 6 'L de support de montage sur une lame de microscope propre. REMARQUE: Le support de montage est utilisé pour un temps de détection plus long en fonction de ses propriétés antifondues.</li>
	<li>Utilisez des forceps pour ramasser un épiderme et retirez délicatement le PBS résiduel à l'utilisation d'une lingette.</li>
	<li>Placez l'épiderme dans le milieu de montage et ajustez son orientation de sorte que sa surface interne contenant les ovocytes soit sur le fond et sa surface externe est sur le dessus.</li>
	<li>Placez délicatement une feuille de couverture sur l'épiderme. REMARQUE: Retirez tout support de montage supplémentaire qui fuit sous la glissière de couverture avec une lingette, si nécessaire. Pour faciliter l'imagerie, poussez doucement vers le bas sur le bordereau avec des forceps de sorte que lors de l'observation de la diapositive à travers le microscope, l'amas d'oenocytes peut être facilement représenté dans un seul plan. Alternativement, il est possible de couper l'épiderme en deux semi-épiderme à travers la ligne médiane pour éviter le roulement de l'épiderme entier lors du montage des tissus.</li>
	<li>Appliquer le vernis à ongles clair sur les bords de la glissière de couverture pour sceller.</li>
	<li>Mettez les diapositives dans une boîte d'échantillon imperméable et laissez le vernis à ongles sécher à RT, ce qui peut prendre 5-10 min.</li>
	<li>Procédez à l'analyse microscopique. Prenez des images à l'aide d'un microscope confocal (grossissement de 63x avec des réglages optimisés de filtre GFP ou FITC, excitation 488 nm, émission de 503 nm) pour acquérir des signaux propres et sensibles avec un fond réduit au minimum.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, Z., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+in+Drosophila%3A+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism in Drosophila: development and disease.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).</li>
<li>Cheng, Y., Chen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+fly+research+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Fruit fly research in China.</a> Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).</li>
<li>Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+and+Drosophila+models+to+investigate+the+mechanistic+links+between+diet%2C+obesity%2C+type+II+diabetes%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer.</a> International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).</li>
<li>Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+hepatocyte-like+cells+regulate+Drosophila+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism.</a> Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).</li>
<li>Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+functions+of+oenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">The development and functions of oenocytes.</a> Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).</li>
<li>Chatterjee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+metabolic+adaptation+to+fasting+by+dILP6-induced+insulin+signaling+in+Drosophila+oenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+suppresses+age-dependent+ectopic+fat+accumulation+by+maintaining+the+proteostasis+of+PLIN2+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila.</a> Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+regulates+lipid+droplet+turnover+in+response+to+nutrient+deprivation+via+p62-mediated+selective+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).</li>
<li>Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+finally+get+a+little+R-E-S-P-E-C-T%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T.</a> Cell. 139 (5), 855-860 (2009).</li>
<li>Murphy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+roles+of+intracellular+lipid+droplets%3A+from+archaea+to+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals.</a> Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Fowler, S. D., Greenspan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Nile+red%2C+a+fluorescent+hydrophobic+probe%2C+for+the+detection+of+neutral+lipid+deposits+in+tissue+sections%3A+comparison+with+oil+red+O%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).</li>
<li>Gocze, P. M., Freeman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+underlying+the+variability+of+lipid+droplet+fluorescence+in+MA-10+Leydig+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells.</a> Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).</li>
<li>Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+fluorescent+probes+for+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets.</a> Materials (Basel). 11 (9), (2018).</li>
<li>BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center. , Indiana University Bloomington. https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019).</li>
<li>Milon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+estrogens+regulate+lipid+status+in+testicular+steroidogenic+Leydig+cell%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell?</a> Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).</li>
<li>Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+E4+alters+astrocyte+fatty+acid+metabolism+and+lipid+droplet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation.</a> Cells. 8 (2), (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à divulguer.

Parmi ceux décrits ci-dessus, il y a plusieurs étapes critiques dans ce protocole, avec la période de ponte d'oeufs étant l'un de ces. En tant que tissu mobilisateur de lipides, l'oenocyte est très sensible au statut nutritionnel6,8. Des périodes prolongées de ponte peuvent entraîner une augmentation de la concurrence alimentaire avec les larves et les aliments, ce qui entraîne des résultats inexacts. La période de 1 h de pont utilisée dans ce protocole permet au...

Les lipides sont essentiels à la survie cellulaire. En plus de leur rôle traditionnel en tant que composants intégrals des systèmes de membrane cellulaire, les lipides jouent également des fonctions cruciales dans l'approvisionnement en énergie et la transmission de signalisation tout au long des cycles de vie des animaux individuels1. Ainsi, le métabolisme des lipides doit se conformer à des règlements stricts pour maintenir l'hémostasie physiologique dans les cellules. On sait que la dysrégulation du métabolisme des lipides entraîne diverses maladies, comme le diabète et le foie gras. En dépit de la grande importance du métabolisme de lipide dans la santé animale, les mécanismes sous-jacents à la régulation de métabolisme de lipide restent largement inconnus.
Drosophila a été largement utilisé pendant des années depuis le professeur Thomas H. Morgan a commencé à les utiliser dans des études impliquant la génétique et d'autres questions biologiques de base2. Au cours des dernières décennies, de nouvelles preuves ont montré que Drosophila est un excellent organisme modèle dans l'étude de nombreuses maladies associées au métabolisme des lipides, telles que l'obésité1,3. En particulier, Drosophila partage des gènes métaboliques hautement conservés avec les humains et possède des tissus/organes et des types cellulaires pertinents similaires pour le métabolisme des lipides.
Par exemple, le corps gras de Drosophila, qui est responsable du stockage du triacylglycéride, fonctionne comme un tissu adipeux humain. Récemment, un groupe de cellules spécialisées de l'hépatocyte (c.-à-d., les oenocytes), qui ont été rapportés pour être un analogue fonctionnel au foie humain, ont été montrés pour être impliqués dans l'acide gras et le métabolisme d'hydrocarbures dans les mouches de fruit4,5. Semblable au cas dans les foies de mammifères, les oenocytes répondent à la famine en activant la formation de gouttelettes lipidiques dans la drosophilelarvaire et adulte Drosophila , résultant en l'accumulation de gouttelettes lipidiques dans les ovocytes4,6,7,8. Anatomiquement, les oenocytes sont étroitement attachés à la surface interne basale de l'épiderme latéral en grappes d'environ six cellules par hémisegment abdominal, ce qui rend impossible d'isoler les amas d'oenocytes de l'épiderme. Ainsi, les oenocytes doivent être attachés à l'épiderme pendant la dissection et la coloration.
Les lipides sont stockés sous forme de gouttelettes lipidiques, qui sont des organites avec des membranes à une seule couche dans les cellules9. Les gouttelettes lipidiques existent dans presque tous les types de cellules à travers différentes espèces10. La dynamique des gouttelettes lipidiques, y compris sa taille et son nombre, change en réponse aux facteurs de stress environnementaux. Ceci est considéré comme un reflet de l'état métabolique en réponse au stress, comme le vieillissement et la famine7,8. Par conséquent, il est d'une grande importance de développer une méthode faisable et fiable pour déterminer qualitativement la dynamique des gouttelettes lipidiques dans les ovocytes pendant le développement et dans des conditions stressantes. En particulier, dans la troisième larve instar, les ovocytes contiennent peu ou pas de gouttelettes lipidiques détectables dans des conditions nourries, mais ils contiennent de nombreuses grosses gouttelettes lipidiques après la privation de nutrition4. Pour vérifier l'efficacité de cette méthode, il est suggéré d'effectuer la coloration des gouttelettes lipidiques dans les ovocytes dans des conditions affamées.
Actuellement, plusieurs colorants lipophiles sont disponibles pour les gouttelettes lipidiques de coloration, tels que les colorants non fluorescents Soudan Noir et Huile Rouge O et colorants fluorescents Nile Red et BODIPY 493/50311. Soudan Noir et Huile Rouge O sont couramment utilisés pour les esters de cholesteryl tissu et triacylglycérols et peuvent être facilement détectés par microscopie légère. Cependant, la coloration de fond relativement élevée et la résolution relativement basse sont deux facteurs limitants pour ses applications dans l'analyse qualitative de la dynamique de gouttelette de lipide. Pour surmonter les limites des colorants non fluorescents, Nile Red et BODIPY 493/503 sont utilisés comme substituts idéaux pour la coloration des gouttelettes lipidiques. Il a été rapporté que le rouge du Nil peut également détecter un certain cholestérol non stérilisé, ce qui rend BODIPY 493/503 un colorant plus spécifique pour les gouttelettes lipidiques cellulaires, dans une certaine mesure12,13,14.
Par-dessus tout, pour répondre à un besoin d'analyse rapide et sensible des gouttelettes lipidiques dans les ovocytes, ce protocole présente une méthode faisable et hautement reproductible de coloration à base fixative de gouttelettes lipidiques spécifiques utilisant BODIPY 493/503 comme colorant de tache. Dans ce rapport, les oenocytes sont disséqués, et BODIPY 493/503 est employé pour la coloration de gouttelette de lipide dans les oenocytes, dans lesquels des gouttelettes de lipide sont détectées par microscopie confocale. La facilité et l'abordabilité de cette procédure le rendent idéal pour la modification et l'utilisation ultérieure dans d'autres applications, telles que la cytométrie de flux.

<table><tbody><tr><td>Tube à centrifuger de 50 mL</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri de 6 cm Thermo</td><td>Fisher</td><td>150326</td><td>6 cm</td></tr><tr><td>Gélose</td><td></td><td></td><td>Pour nourriture contre les mouches</td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Protéger l’érable de la lumière</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td>D3922</td><td>Colorant de coloration des gouttelettes de lipides</td></tr><tr><td>Microscope</td> <td>confocalLeica</td><td>Leica Leica TSC SP5</td><td>Imagerie confocale Sirop</td></tr><tr><td></td><td></td> de<td>maïs</td><td>Pour l’alimentation des mouches</td></tr><tr><td>Semoule</td><td></td><td></td> de maïs <td>Pour l’alimentation des mouches</td></tr><tr><td>Lamelle</td><td>Citoglas</td><td>10212424C</td><td>20 &times ; 20 mm, 0,13-0,17 d’épaisseur</td></tr><tr><td>Goupille de dissection</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de dissection</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Diamètre : 11 cm</td></tr><tr><td>Tampon de fixation</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>4 % Paraformaldéhyde (PFA) dans 1x Pince PBS</td></tr><tr><td></td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td>#5</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Jiangnan</td><td>SPX-380</td><td>Pour la culture de mouches</td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Lame de microscopie</td><td>Citoglas</td><td>10127105P-G</td><td></td></tr><tr><td>Support de montage</td><td>VECTASHIELDAntifade Support de montage</td><td>H-1000</td><td>Support de montage anti-décoloration</td></tr><tr><td>Vernis à ongles</td><td>PanEra</td><td>AAPR419</td><td>Sceller la lamelle</td></tr><tr><td>Pinceau</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7,4)</td></tr><tr><td>Rotateur</td><td>Kylin-Bell Lab Instruments</td><td>WH-986</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Smartdata Medical</td><td>SR81</td><td>Ciseaux à ressort Vannas</td></tr><tr><td>Farine</td><td></td><td></td> de soja <td>Pour nourriture pour mouches</td></tr><tr><td>Spatule</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Aliment standard à la semoule de maïs</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Codage selon la recette standard de semoule de maïs</td></tr><tr><td>Bloomington Stéréo microscope</td><td>Leica</td><td>Leica S6E</td><td>Pour la dissection tissulaire</td></tr><tr><td>Papier essuyé</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Levure</td><td></td><td></td><td>Pour l’alimentation des mouches</td></tr><tr><td>yw</td><td>Conservé comme stock de laboratoire</td><td>N/A</td><td>Drosophile</td></tr></tbody></table>

dissection et coloration des gouttelettes lipidiques des oenocytes dans les larves de drosophila

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Les lipides sont essentiels au développement des animaux et à l'homéostasie physiologique. La dysrégulation du métabolisme lipidique entraîne divers défauts et maladies du développement, tels que l'obésité et le foie gras. Habituellement, les lipides sont stockés dans des gouttelettes lipidiques, qui sont les organites multifonctionnels de stockage de lipides dans les cellules. Les gouttelettes lipidiques varient en taille et en nombre dans différents tissus et dans des conditions différentes. Il a été rapporté que les gouttelettes lipidiques sont étroitement contrôlées par la régulation de sa biogenèse et de la dégradation. Dans Drosophila melanogaster, l'oenocyte est un tissu important pour le métabolisme des lipides et a été récemment identifié comme un analogue du foie humain en ce qui concerne la mobilisation des lipides en réponse au stress. Cependant, les mécanismes sous-jacents à la régulation du métabolisme des gouttelettes lipidiques dans les ovocytes restent insaisissables. Pour résoudre ce problème, il est de la plus haute importance de développer une méthode fiable et sensible pour visualiser directement les changements dynamiques des gouttelettes lipidiques dans les ovocytes pendant le développement et dans des conditions stressantes. Profitant du BODIPY 493/503 lipophile, un colorant fluorescent spécifique aux gouttelettes lipidiques, décrit ici, est un protocole détaillé pour la dissection et la coloration subséquente des gouttelettes lipidiques dans les oenocytes des larves de Drosophila en réponse à la famine. Cela permet une analyse qualitative de la dynamique des gouttelettes lipidiques dans diverses conditions par microscopie confocale. En outre, cette méthode rapide et hautement reproductible peut également être utilisée dans les écrans génétiques pour l'indentification de nouveaux facteurs génétiques impliquant le métabolisme des gouttelettes lipidiques dans les ovocytes et autres tissus.

L'exécution réussie de cette procédure devrait avoir comme conséquence la coloration claire de gouttelettes de lipide qui indique le nombre et la taille des gouttelettes de lipide dans les oenocytes. Figure 1A,A',A', A'' montre qu'il y a peu de gouttelettes lipidiques détectables (points verts) dans les oenocytes des larves d'alimentation normales à différents stades de développement. Figure 1B,B',B''</st...

Présentés ici sont des méthodes détaillées pour la dissection et la coloration gouttelette de lipide des ovocytes dans les larves de Drosophila à l'aide de BODIPY 493/503, un colorant fluorescent spécifique aux gouttelettes lipidiques.

Dissection et coloration des gouttelettes lipidiques des oenocytes dans les larves de Drosophila

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Cette méthode d’une dissection d’œnocyte et d’une coloration des gouttelettes lipidiques peut être utilisée pour réaliser l’apparition d’une gouttelette lipidique dans l’œnocyte des larves de drosophiles dans des conditions normales et stressées. Cette méthode fournit un outil utile pour étudier le métabolisme des lipides non seulement chez les insectes, mais aussi chez les mammifères avec seulement quelques modifications mineures. Pour induire la ponte, placez 150 mouches femelles vierges et 75 mâles des génotypes désirés dans une bouteille de ponte et placez la bouteille sous une boîte à l’épreuve de la lumière dans un incubateur de 25 degrés Celsius avec 60% d’humidité.Après une heure, transférer les mouches dans une nouvelle bouteille et laisser les mouches pondre des œufs dans la nouvelle bouteille pendant une heure avant d’enlever les adultes. Ensuite, laissez les œufs se développer en larves de troisième stade pendant 84 heures à 25 degrés Celcius avec un cycle clair-obscurité de 12 heures. Avant d’entreprendre le traitement de famine, placez un morceau de papier filtre de taille appropriée dans une boîte de Pétri de six centimètres et ajoutez un millilitre de PBS sur le papier pour créer une chambre de famine.Pour faire une chambre de traitement de contrôle, placez cinq millilitres de nourriture standard de semoule de maïs de Bloomington dans une boîte de Petri de six centimètres. Lorsque les chambres sont prêtes, utilisez un petit pinceau pour recueillir les larves de stade de la même taille approximative de la bouteille de ponte. Et 20 larves au hasard dans chaque famine et la chambre de contrôle.Placez ensuite les chambres dans l’incubateur pendant 12, 24 ou 36 heures de développement et/ou de famine. À la fin de la période de traitement, utiliser des forceps pour transférer doucement les larves de chaque chambre dans une plaque de dissection contenant du PBS glacé et placer la plaque sous un microscope stéréo. Orientez le premier côté ventral de larve vers le haut et utilisez des forceps pour maintenir doucement la larve en place.Placez une goupille à travers le pharynx et une autre broche à travers le spiracle pour fixer la larve à la plaque. Utilisez des ciseaux à ressort Vannas pour faire une incision longitudinale à travers l’épiderme de l’antérieur à l’extrémité postérieure de l’animal. Utilisez des forceps pour enlever le tissu interne de l’épiderme, en prenant soin d’éviter les dommages aux œnocytes à la surface interne de l’épiderme.Ensuite, utilisez des forceps pour récupérer les broches de dissection et transférer l’épiderme dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre de PBS sur la glace. Pour la coloration des gouttelettes lipidiques, incuber l’épiderme disséqué dans le tampon de fixation pendant 30 minutes à température ambiante sur un rotateur, suivie d’une résuspension rapide en un millilitre de PBS. Lavez ensuite les échantillons avec trois lavages de cinq minutes dans un millilitre de PBS par lavage pour éliminer tout fixatif résiduel.Après le dernier lavage, incuber les échantillons épidermiques avec une sonde lipophile appropriée pendant 30 minutes à température ambiante sur un rotateur. Pendant l’incubation, envelopper les tubes de l’échantillon dans du papier d’aluminium pour protéger les tissus de la lumière et laver les échantillons trois fois dans un millilitre de PBS pendant 10 minutes par lavage. Pour imager les œnocytes, transférez chaque échantillon d’épiderme en six microlitres de milieu de montage sur une lame de microscope propre, ajustez l’orientation du tissu, de sorte que la surface interne contenant les œnocytes touche le fond de la lame.Placez délicatement un coverslip sur l’épiderme et scellez les bords avec du vernis à ongles clair. Lorsque le vernis a séché, l’image des échantillons sur un microscope confocal, mettre un grossissement 63 X avec l’excitation appropriée et les longueurs d’onde d’émission. Il y a quelques gouttelettes de lipides détectables dans les œnocytes des larves d’alimentation normales à différents stades de développement.Comme observé dans ces images représentatives cependant, les gouttelettes de lipide augmentent en nombre dans les œnocytes en réponse aux périodes de famine de 12, 24, et 36 heures. Cette méthode fournit et facile et un protocole réalisable pour les chercheurs dans les domaines de recherche pertinents pour étudier si les manipulations génétiques ou environnementales provoquent des changements de gouttelettes lipidiques dans les cellules.

dissection-lipid-droplet-staining-oenocytes-drosophila

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Chez les insectes, les oenocytes produire des composés d'hydrocarbures cuticulaires. Ces composés se protéger contre le dessèchement et faciliter la communication chimique. Ici nous démontrons une technique de dissection utilisée pour isoler les oenocytes de...

Dissection de Oenocytes d&#39;adultes Drosophila melanogaster</em

Comment les niches et les cellules souches forment pendant le développement est une question importante avec des implications pratiques. Dans...

Dissection et la coloration des Drosophile Ovaires larvaires

Le facteur limitant dans l'utilisation de...

Simple Drosophile Dissection ommatidie et imagerie

Une approche standard pour préparer les...

Préparation des adultes Drosophile Yeux pour la coupe mince et analyse microscopique

Dissection et immunohistochimique de larve, de nymphe et adulte<em&gt; Drosophila</em&gt; Rétines

Cette vidéo démontre la coloration par gouttelettes lipidiques dans les œnocytes larvaires de la drosophile - cellules semblables à des hépatocytes - à l’aide du colorant fluorescent lipophile à base de BODIPY. Ces cellules servent de modèle pour l’étude du métabolisme des lipides au cours du développement et en réponse à un stress environnemental tel que la famine.

Coloration des gouttelettes lipidiques des œnocytes larvaires de drosophile : une technique d’évaluation de l’accumulation de gouttelettes lipidiques dans des conditions normales et stressées à l’aide d’un colorant à base de BODIPY

L’immunomarquage est une technique efficace pour visualiser des types de cellules et des protéines spécifiques dans les tissus. En utilisant la sonication, le protocole décrit ici réduit la nécessité de disséquer les tissus de Drosophila melanogaster des embryons et des larves à un stade avancé avant l’immunomarquage. Nous fournissons une méthodologie efficace pour l’immunomarquage des larves de montures entières fixées au formaldéhyde.

Sonication facilitée immunofluorescence de phase tardive embryonnaire et larvaire<em&gt; Drosophila</em&gt; tissus<em&gt; In Situ</em

Systèmes hématopoïétiques de mammifères Drosophila et partagent de nombreuses caractéristiques communes, ce qui rend la drosophile un modèle génétique attrayant pour étudier l' hématopoïèse. Ici, nous démontrons la dissection et montage du principal organe hématopoïétique larvaire pour l'immunohistochimie. Nous décrivons également des méthodes pour analyser différents compartiments hématopoïétiques larvaires dont hémocytes circulants et des cellules à cristaux sessiles.

Méthodes pour examiner la lymphe et Gland hémocytes dans<em&gt; Drosophila</em&gt; larves

L’analyse de la relation structure-fonction mitochondriale est nécessaire pour une compréhension approfondie des mécanismes de régulation de la fonctionnalité mitochondriale. Des méthodes spécifiques pour étudier la structure et la fonction mitochondriales dans les ovaires de drosophile vivants et fixes sont décrites et démontrées dans cet article.

Étudier mitochondrial Structure et fonction Drosophila ovaires

L’ovaire de la drosophile est un système excellent modèle pour étudier le développement de niche de cellules souches. Bien que les méthodes pour disséquer les ovaires larvaires et adultes ont été publiées, les dissections ovaires nymphales exigent d’autres techniques qui n’ont pas été publiées en détail. Ici, nous exposons un protocole de dissection, coloration et montage des ovaires nymphales.

Dissection et la coloration des Drosophila ovaires Pupal

Au début de l’embryon de drosophile , de nombreux organites sont mobiles. En principe, ils peuvent être photographiés en direct via des sondes fluorescentes spécifiques, mais la coquille d’œuf empêche l’application directe sur l’embryon. Ce protocole décrit comment introduire de telles sondes par microinjection, puis analyser le mouvement des organites en vrac via la vélocimétrie d’image de particules.

Visualisation du trafic dépendant du cytosquelette d’organites contenant des lipides dans des embryons de drosophiles

Découvrez la dissection des oenocytes et la coloration des gouttelettes lipidiques chez les larves de Drosophila avec le marqueur BODIPY 493/503. Cette méthode permet d'étudier le métabolisme lipidique sous conditions normales et de stress.

Dissection et coloration des gouttelettes lipidiques des oenocytes dans les larves de Drosophila

Explorer plus de vidéos