Name: Infection in vivo avec l’amazonense de Leishmania pour évaluer la virulence parasite chez les souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Découvrez l'infection in vivo avec Leishmania amazonensis pour évaluer la virulence parasitaire chez la souris. Cette méthode permet d'étudier simultanément la réponse inflammatoire de l'hôte et la réplication du parasite.

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Nous tenons à remercier le Professeur Niels Olsen Saraiva Câmara du Centre des Animaux de l’Institut des Sciences Biomédicales de l’Université de Sao Paulo pour son soutien et le Prof. Dr. Silvia Reni Uliana pour la fourniture du broyeur de tissu en verre. Ce travail a été soutenu par la Sao Paulo Research Foundation (FAPESP - subvention 2017/23933-3 du MFLS).

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’Institut de bioscience de l’Université de Sao Paulo (CEUA 342/2019), et ont été menées conformément aux recommandations et aux politiques relatives à l’entretien et à l’utilisation des animaux de laboratoire de l’État de Sao Paulo (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) et le gouvernement brésilien (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Toutes les étapes décrites dans les sections 1-5 doivent être effectuées aseptiquement à l’intérieur des armoires à débit laminaire. L’équipement de protection individuelle doit être utilisé tout en manipulant les parasites vivants de Leishmania.
1. In Vitro Différenciation de L. amazonensis Promastigotes en Axenic Amastigotes15,20,35,36,37,38
REMARQUE: L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La) parasite a été utilisé dans cet assay. Selon le but de l’étude, la forme de parasite infectieux peut être obtenue soit par la purification de la forme métacyclique en utilisant un gradient de densité, comme décrit précédemment14, ou par la différenciation des promastigotes en amastigotes axenique, selon le protocole suivant.
<ol><li>Cultivez La promastigotes dans un flacon de culture cellulaire de 25 cm2 contenant 10 ml de milieu pour les promastigotes (pro-moyen) (pH à 7,0).</li>
	<li>Incuber à 25 oC pendant 3 jours. REMARQUE: Utilisez des cultures promastigote qui ont été passages in vitro moins de 10x pour éviter la perte de virulence et les changements aneuploidy des parasites39,40,41,42,43,44.</li>
	<li>Pipette 5 mL de culture de promastigote de phase de croissance logarithmique dans un nouveau flacon de 25 cm2.</li>
	<li>Ajouter 5 ml de milieu pour les amastigotes axeniques (ama-moyen) (pH 5,2).</li>
	<li>Incuber à 34 oC pendant 3-4 jours.</li>
	<li>Divisez la culture en diluant avec l’ama-moyen à un rapport de 1:3 dans un nouveau flacon de 25 cm2.</li>
	<li>Incuber à 34 oC pendant 3 à 5 jours. REMARQUE: Incuber les amastigotes axenic pour un jusqu’à 5 jours, car il représente la fin de la maturation37.</li>
</ol>2. C57BL/6 Infection de Footpad avec L. amazonensis
REMARQUE : Des souris femelles C57BL/6 (6-8 semaines) ont été obtenues et maintenues au Centre animalier de l’Institut des sciences biomédicales de l’Université de Sao Paulo. Les animaux ont reçu de la nourriture et de l’eau ad libitum.
<ol><li>Comptez la culture des amastigotes axeniques en transférant un aliquot de la suspension parasite diluée en PBS à une chambre Neubauer (c.-à-d. hémocytomètre). Comptez les parasites non flagellated qui représentent des formes amastigotes. REMARQUE: Alternativement, Trypan bleu (1:1) peut être utilisé pour compter le nombre d’amastigotes viables (c.-à-d., ceux qui ne sont pas tachés de bleu Trypan).</li>
	<li>Diluer les amastigotes axeniques dans PBS selon la dose d’inoculum désirée et le nombre d’inoculums prévus (1 x 106 amastigotes axeniques dans 50 L de PBS est recommandé).</li>
	<li>Chargez une seringue de tuberculeuse avec une aiguille de 27 G avec la suspension parasite préparée.</li>
	<li>Anesthésiez une souris C57BL/6 à l’aide de 3-5% isoflurane, tel que recommandé par Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee45. Évaluez la profondeur anesthésique en testant la réponse de la souris à une pincée d’orteil.</li>
	<li>Inoculer 50 L de la suspension parasitaire homogénéisée (1 x 106 amastigotes axeniques ou la dose d’inoculum désirée) dans le tissu subplantaire de la pelle arrière gauche, à l’aide de la seringue de tubercule précédemment chargée (étape 2.3).</li>
</ol>3. Mouse Footpad Leion Développement
<ol><li>Mesurer la progression de la lésion une fois par semaine en mesurant l’épaisseur des pavés gauches (infectés) et droits (non infectés) à l’aide d’un étrier.</li>
	<li>Calculez la différence de l’épaisseur entre les pavés arrière gauche et droit chaque semaine pour évaluer la progression des lésions.</li>
	<li>Tracer les différences calculées sur l’axe Y et l’heure de l’infection sur l’axe X et calculer la signification statistique. REMARQUE : Conformément aux recommandations des comités de soins et d’utilisation des animaux, les animaux doivent être sacrifiés avant que la lésion infectée ne devienne ulcérée, car les ulcères cutanés peuvent entraîner une infection secondaire. Comme le montre la figure 1 supplémentaire,il faut environ 10 semaines pour que les lésions présentent des signes d’ulcération avec la dose parasite (106 amastigotes axenique) et la souche hôte (C57BL/6) utilisée dans ce protocole. Les souris devraient être sacrifiées pour l’extraction de lésion avant que les signes de l’ulcération soient observés.</li>
</ol>4. Souris Footpad Lésion Extraction et Parasite Limitation Dilution
<ol><li>Préparer une plaque de puits de 96 (fond plat) pour l’épreuve de dilution limitante46,47 en ajoutant 180 l l de pro-moyen à tous les puits. REMARQUE : Utiliser quatre voies de plaque (la moitié de la plaque) pour chaque animal, ce qui représente des essais de quadruplicate (c.-à-d. animaux 1 et voies A-D; animal 2 et voies E-H).</li>
	<li>Ajouter 1 ml de pro-moyen dans un tube de broyeur de tissu en verre par lésion et peser le tube. REMARQUE : Le tube doit être maintenu stérile, ainsi employer un couvercle stérile et peser le tube avec le couvercle fermé, si pesant à l’extérieur de l’armoire d’écoulement laminaire.</li>
	<li>Sacrifiez l’animal dans une chambre CO2, suivant les recommandations des comités de soins et d’utilisation des animaux. Désinfecter l’animal en pulvérisant à 70 % d’éthanol.</li>
	<li>Accise le pied de l’animal à elle talons pour extraire le pied infecté et pulvériser 70% d’éthanol sur le pied pour la désinfection. Assurer la stérilisation des ciseaux et des forceps en les gardant trempés dans 70% d’éthanol.</li>
	<li>Placez le pied infecté dans un plat stérile Petri et disséquez à l’aide de forceps stériles et d’un scalpel pour recueillir tous les tissus mous. Jetez les os. REMARQUE : L’uniformité dans l’étape de dissection est recommandée pour éviter la récupération biaisée de tissu.</li>
	<li>Transférer les tissus recueillis dans le tube de broyeur de tissu de verre avec pro-moyen, puis peser le tube à nouveau pour déterminer le poids de la lésion. REMARQUE : Évitez de placer les forceps et le scalpel directement dans le milieu, car de petits volumes peuvent être enlevés, ce qui entraîne un poids tissulaire sous-estimé. Le poids de la lésion est calculé en soustrayant le poids du tube contenant pro-moyen avec le tissu recueilli du poids du tube contenant seulement pro-moyen.</li>
	<li>Homogénéiser le tissu 10x à l’aide du broyeur pour une perturbation complète des tissus.</li>
	<li>Laisser le mélange dans les sédiments pendant 10 min, puis recueillir 20 l l du supernatant.</li>
	<li>Chargez 20 l l du supernatant dans la1ère colonne de la1ère voie de la plaque de puits 96 préparée à l’étape 4.1. Répétez cette opération pour que les trois voies suivantes aient des quadruplicates pour chaque animal (c.-à-d. pour les animaux 1, ajoutez 20 L à chaque puits et étiquetez A1, B1, C1 et D1).</li>
	<li>Homogériser chaque puits dans la1ère colonne 10x à l’aide d’une pipette multicanal. Ensuite, transférez 20 l des échantillons dilués de la colonne 1st à la colonne 2nd. REMARQUE: Il est important d’homogénéiser chaque puits 10x d’une colonne à l’autre.</li>
	<li>Répétez l’étape 4.10 à toutes les colonnes restantes jusqu’à la dernière colonne (12e) et jetez les 20 derniers L de l’échantillon dilué. REMARQUE : Modifiez les pointes après chaque dilution pour éviter la contamination croisée.</li>
	<li>Sceller les assiettes à l’aide d’un film et incuber à 25 oC pendant 7 jours dans une chambre humide.</li>
</ol>5. Détermination de charge parasite de lesion
<ol><li>Analyser les plaques après 7 jours d’incubation à l’aide d’un microscope inversé pour déterminer le dernier puits contenant du parasite pour chaque voie. REMARQUE: Il est également possible d’avoir une indication de la croissance des parasites, ou densité cellulaire, par l’analyse visuelle des changements de couleur et la turbidité du milieu.</li>
	<li>Calculez la charge de tissu parasite pour chaque voie en divisant le facteur de dilution par poids de lésion. REMARQUE : Dans une voie spécifique, si les parasites ne sont présents que dans les colonnes 1-5 (c.-à-d. que les puits A1-A5 sont positifs pour la croissance du parasite), cela signifie que la colonne 5 ne contenait qu’un parasite, la colonne 4 contenait 10 parasites, et ainsi de suite, en multiples de dix. La colonne 1 contiendrait 104 parasites, ce qui représente le nombre de parasites dans les 20 l’un initial de supernatant (l’échantillon non dilué à l’étape 4.7). Étant donné que ce tube de 20 L a été dilué avec 180 l de pro-moyen, le tube initial contenait 5 x 105 parasites : (1 x 104) / (0,02 mL) 5 x 105 parasites/1 mL. Ensuite, la charge du parasite dans cette lésion peut être calculée en divisant la concentration initiale du parasite par le poids de la lésion: (5 x 105) / poids des lésions (voir l’étape 4.6).</li>
	<li>Tracer la moyenne du résultat quadruplique pour chaque animal avec une échelle Y journal.</li>
</ol>6. Analyse statistique
<ol><li>Représenter les données comme une déviation standard moyenne à l’aide d’au moins cinq animaux par groupe expérimental comme répliques.</li>
	<li>Effectuer une analyse statistique à l’aide d’un test à deux queues non apparié, en considérant une valeur p 'lt; 0.05 comme significatif.</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

L’analyse in vivo de l’infection décrite dans ce protocole permet à n’importe quel chercheur d’évaluer la leishmaniose cutanée in vivo compte tenu de l’interaction hôte-parasite dans un scénario systémique. Ces essais ont été utilisés par de nombreux groupes22,24,27,29,31,32,34,<s...

Les leishmanimes sont des maladies infectieuses parasitaires répandues dans le monde entier représentant des défis importants dans les pays en développement et sont reconnues comme l’une des maladies tropicales négligées les plus importantes par l’Organisation mondiale de la Santé1,2. Les leishmaniose sont caractérisées par des manifestations cutanées, muqueuses et/ou viscérales. La leishmaniose cutanée est habituellement causée par L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica et L. aethiopica3. Cette forme de la maladie est souvent auto-guérison chez l’homme en raison de l’induction de la réponse immunitaire cellulaire protectrice. Cependant, la réponse immunitaire cellulaire peut échouer, et la maladie peut progresser à la leishmaniose cutanée disséminée4,5. Il n’existe pas de vaccin disponible en raison de la diversité entre les espèces leishmanimanieuses et les milieux génétiques hôtes6,7. Les options de traitement sont également limitées car la plupart des médicaments actuellement disponibles sont soit coûteux, toxiques, et / ou peuvent nécessiter un traitement à long terme8,9. En outre, il ya eu des rapports de résistance aux médicaments contre les traitements disponibles10,11.
L’agent causal des leishmanians est le parasite protozoaire Leishmania. Le parasite présente deux formes morphologiques distinctes dans son cycle de vie : les promastigotes, la forme flagellée trouvée dans les phandres ; et amastigotes, la forme intracellulaire trouvée dans les vacuoles parasitophores des macrophages d’hôte de mammifères12,13. La capacité des amastigotes d’envahir, de survivre et de se répliquer malgré les mécanismes de défense des macrophages de l’hôte vertébré est sujette à de nombreuses études14,15,16,17. Par conséquent, plusieurs groupes de recherche ont décrit des essais d’infection in vitro de macrophage pour évaluer l’impact des facteurs environnementaux spécifiques, aussi bien que des gènes parasites et d’hôte sur l’infectiosité parasite. Cet analyse présente plusieurs avantages, tels que la capacité d’adapter les études à un format de débit élevé, une période de temps relativement plus courte pour obtenir des résultats, et une réduction du nombre d’animaux de laboratoire sacrifiés18. Cependant, les résultats des essais in vitro sont limités parce qu’ils ne reproduisent pas toujours les études in vivo14,19,20,21. Les essais in vivo fournissent un aperçu physiologique systémique de l’interaction hôte-parasite, qui ne peut pas être entièrement imité par des essais in vitro. Par exemple, les études immunologiques peuvent être exécutées par des essais immunohistochimiques des sections rassemblées de tissu de pied ou même des ganglions lymphatiques popliteal pour l’analyse des cellules immunitaires récupérées22.
Les animaux sont souvent utilisés comme modèle pour les maladies humaines dans la recherche biologique et biomédicale pour mieux comprendre les mécanismes physiologiques sous-jacents des maladies23. Dans le cas de la leishmaniose, l’itinéraire, le site, ou la dose d’inoculation influencent les résultats de la maladie24,25,26,27. En outre, la susceptibilité et la résistance à l’infection chez l’homme et les souris sont fortement réglementées par les antécédents génétiques de l’hôte et le parasite4,5,22,28,29,30,31. Les souris BALB/c sont très sensibles à l’infection cutanée de L. amazonensis, montrant une progression rapide de la maladie avec la dissémination des parasites aux ganglions lymphatiques, à la rate et au foie32. Comme la maladie peut progresser vers des métastases cutanées, l’infection peut être mortelle. En revanche, les souris C57BL/6 développent souvent des lésions chroniques avec des charges parasites persistantes dans les essais d’infection de L. amazonensis 33. Par conséquent, l’infection à L. amazonensis avec cette espèce particulière de souris a été considérée comme un excellent modèle pour étudier les formes chroniques de leishmaniose cutanée chez l’homme, parce qu’elle imite la progression de la maladie mieux que le modèle d’infection de souris BALB/c5,34.
Par conséquent, nous proposons que l’infection in vivo de murine soit une méthode utile pour des études physiologiques de virulence de Leishmania applicables à la maladie humaine, permettant une vue systémique de l’interaction hôte-parasite. Revisiter les essais bien établis22, nous présentons ici un protocole compilé étape par étape de l’infection in vivo des souris C57BL/6 avec L. amazonensis qui comprend la différenciation parasite en amastigotes hachenique, souris footpad inoculation cutanée, développement de lésions, et la détermination de la charge parasite. Ce protocole peut être adapté à d’autres souches de souris et aux espèces de Leishmania qui causent des leishmanimes cutanés. En conclusion, la méthode présentée ici est cruciale pour identifier de nouvelles cibles de médicamentsanti-Leishmania et des vaccins, ainsi que dans les études physiologiques des réponses immunitaires et métaboliques de l’hôte à l’infection à Leishmania.

<table><tbody><tr><td>Plaque à 96 puits</td><td>Greiner bio-ne</td><td>655180</td><td>Une plaque à fond plat pour le dosage de la dilution limite</td></tr><tr><td>adénine</td><td>Sigma</td><td>A8626</td><td>Complément ajouté à l’étrier de milieu de culture cellulaire M199</td></tr><tr><td></td><td>Mitutoyo</td><td>700-118-20</td><td>Un pied à coulisse pour mesurer l’épaisseur du</td></tr><tr><td>ballon de culture cellulaire</td><td>Corning</td><td>353014</td><td>Une fiole de culture cellulaire de 25 cm2 pour la culture du parasite Leishmania</td></tr><tr><td>centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Un équipement utilisé pour séparer les échantillons en fonction de sa densité</td></tr><tr><td>CO2 incubateur 34 &deg ; C</td><td>Thermo Scientific</td><td>3110</td><td>Un incubateur pour la différenciation des amastigotes</td></tr><tr><td></td><td>éthanol Merck</td><td>K50237083820</td><td>Un désinfectant pour les articles généraux</td></tr> sérum <tr><td>fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td>Supplément ajouté au milieu de culture cellulaire M199</td></tr><tr><td>tube de broyage de tissu en verre</td><td>Thomas Scientific</td><td>3431 E04</td><td>Un tube pour recueillir et perturber le tissu</td></tr> <tr><td>infecté des coussinets plantairesglucose</td><td>Synth</td><td>G1008.01.AH</td><td>Supplément ajouté au milieu de culture cellulaire M199</td></tr><tr><td>Logiciel GraphPad</td><td>Prism GraphPad</td><td></td><td>Un logiciel utilisé pour tracer les données et calculer la signification statistique</td></tr><tr><td>hemin</td><td>Sigma</td><td>H-2250</td><td>Supplément ajouté au milieu de culture cellulaire M199</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Promega</td><td>H5303</td><td>Supplément ajouté à l’incubateur de milieux de culture cellulaire M199</td></tr><tr><td>25 &deg ; C</td><td>Fanem</td><td>347CD</td><td>Un incubateur pour la culture de promastigotes microscope</td></tr><tr><td>inversé</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td>Un équipement utilisé pour l’analyse visuelle des cultures de promastigotes et d’amastigotes</td></tr><tr><td>isoflurane</td><td></td><td></td><td>Un anesthésique inhalé pour souris (3-5 %)</td></tr><tr><td>armoire à flux laminaire</td><td>Veco</td><td>VLFS-09</td><td>Une armoire de biosécurité utilisée pour la zone de travail aseptique</td></tr><tr><td>cellule M199 milieux de culture</td><td>Gibco</td><td>31100-035</td><td>Un milieu de culture cellulaire pour la culture de Leishmania</td></tr><tr><td>Tube à microcentrifuger</td><td>Axygen</td><td>MCT150C</td><td>Un microtube utilisé pour la collecte, le traitement et le stockage d’échantillons</td></tr><tr><td>Pipette multicanal</td><td>Labsystems</td><td>F61978</td><td>Une pipette multicanaux utilisée pour le dosage de dilution limite</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>6329</td><td>Supplément ajouté au milieu de culture cellulaire M199</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Complément ajouté au milieu de culture cellulaire M199</td></tr><tr><td>Chambre Neubauer</td><td>HBG</td><td>2266</td><td>Un hémocytomètre pour compter le microscope optique à suspension parasitaire</td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>E200</td><td>Un équipement optique utilisé pour compter</td></tr><tr>le<td>parasite</td><td>parasite Bemis</td><td>349</td><td>Un plastique souple et résistant pour sceller le plaque</td></tr><tr><td>pénicilline/streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Complément ajouté au milieu de culture cellulaire M199</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Une boîte stérile pour disséquer le coussinet plantaire</td></tr><tr><td>Kit pipeur</td><td>Gilson</td><td>F167360</td><td>Un kit de micropipette contenant quatre pipettes (P2 P20 P200 P1000)</td></tr><tr><td>balance</td><td>Quimis</td><td>BG2000</td><td>Un équipement utilisé pour peser le coussinet plantaire collecté lésions scalpel</td></tr><tr><td></td><td>Solidor</td><td>10237580026</td><td>Un scalpel pour couper et recueillir les tissus des coussinets plantaires</td></tr><tr><td>Pipette sérologique 10 mL</td><td>Nest</td><td>327001</td><td>Une pipette stérile utilisée pour le transfert de volumes millilitres</td></tr><tr><td>pointes</td><td>Axygen</td><td></td><td>Une pointe de pipette utilisée pour transférer des volumes de microlitres</td></tr><tr><td>Bleu trypan</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>Un colorant utilisé pour compter les parasites viables</td></tr><tr><td>trypticase peptone</td><td>Merck</td><td></td><td>Supplément ajouté au milieu de culture cellulaire M199</td></tr><tr><td>seringue à tuberculine</td><td>BD</td><td>305945</td><td>Une seringue avec une aiguille 27G pour inoculer la suspension parasitaire</td></tr></tbody></table>

infection in vivo avec l’amazonense de leishmania pour évaluer la virulence parasite chez les souris

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Leishmania spp. sont des parasites protozoaires qui causent des leishmaniose, maladies qui présentent un large éventail de manifestations cliniques des lésions cutanées aux lésions viscérales. Actuellement, on estime que 12 millions de personnes sont infectées par le Leishmania dans le monde et plus d’un milliard de personnes vivent à risque d’infection. L’amazonense de Leishmania est endémique en Amérique centrale et du Sud et mène habituellement à la forme cutanée de la maladie, qui peut être visualisée directement dans un modèle animal. Par conséquent, les souches de L. amazonensis sont de bons modèles pour les études de leishmaniose cutanée parce qu’elles sont également facilement cultivées in vitro. Les souris C57BL/6 imitent la progression de la maladie entraînée par L. amazonensisobservée chez l’homme et sont considérées comme l’un des meilleurs modèles de souches de souris pour la leishmaniose cutanée. Chez l’hôte vertébré, ces parasites habitent les macrophages malgré les mécanismes de défense de ces cellules. Plusieurs études utilisent des tests d’infection à macrophage in vitro pour évaluer l’infectiosité du parasite dans différentes conditions. Cependant, l’approche in vitro se limite à un système cellulaire isolé qui ne tient pas compte de la réponse de l’organisme. Ici, nous compilons une méthode in vivo d’infection de murine qui fournit un aperçu physiologique systémique de l’interaction hôte-parasite. Le protocole détaillé pour l’infection in vivo des souris de C57BL/6 avec L. amazonensis comprend la différenciation de parasite en amastigotes infectieux, l’inoculation cutanée de pied de souris, le développement de lésion, et la détermination de charge de parasite. Nous proposons cette méthode bien établie comme méthode la plus adéquate pour des études physiologiques des réponses immunitaires et métaboliques d’hôte à la leishmaniose cutanée.

Les parasites protozoaires de leishmaniose existent sous deux formes développementales au cours de leur cycle de vie chez les hôtes invertébrés et vertébrés : les promastigotes, les formes proliérantes trouvées dans le lumen de la mouche de sable femelle ; et amastigotes, les formes proliérantes trouvées dans les vacuoles parasitophores des cellules hôtes mammifères. Les promastigotes ont un corps allongé d’environ 1,5 m de large et 20 m de long, avec un dalle émergeant généralem...

Ici, nous présentons un protocole compilé pour évaluer l’infection cutanée des souris avec l’amazonensis de Leishmania. Il s’agit d’une méthode fiable pour étudier la virulence parasite, permettant une vue systémique de la réponse de l’hôte vertébré à l’infection.

Infection in vivo avec l’amazonense de Leishmania pour évaluer la virulence parasite chez les souris

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...

Ce protocole est approprié pour étudier la virulence de Leishmania, parce qu’il fournit une vue systémique de l’hôte vertébré à l’infection cutanée. Le principal avantage de l’adoption de ce protocole est qu’il permet aux chercheurs d’évaluer simultanément la réponse inflammatoire de l’hôte et la réplication des parasites. Cette méthode peut être utilisée pour caractériser plusieurs cibles et traitements liés à la virulence, ce qui pourrait apporter de nouvelles perspectives dans le contrôle cutané de la leishmaniose.Il peut également être appliqué à d’autres souches de souris et aux espèces de Leishmania qui causent la leishmaniose cutanée. Cet essai a quelques étapes critiques, telles que exiger le personnel formé qui sont confortables travaillant avec des souris et ont l’expérience en exécutant des injections sous-plantaires pour éviter l’exposition accidentelle au matériel infectieux. Le Dr Ricardo Zampieri, technicien de mon laboratoire, démontrera la procédure.Commencez par cultiver des promastigotes L.amazonensis dans un flacon de culture cellulaire carrée de 25 centimètres, contenant 10 millilitres de pro-moyen, pendant trois jours à 25 degrés Celsius. Après l’incubation, p

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