Name: Dépistage des inhibiteurs de la pyrophosphatase Thermotoga maritima Membrane-Bound (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Découvrez un criblage d'inhibiteurs de la pyrophosphatase membranaire de Thermotoga maritima par réaction au bleu de molybdène en plaque 96 puits. Cette méthode simple et économique permet d'identifier des composés thérapeutiques potentiels contre les maladies parasitaires.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par les subventions de la Fondation Jane et Aatos Erkko et du BBSRC (BB/M021610) à Adrian Goldman, l'Académie de Finlande (no 308105) à Keni Vidilaseris, (no 310297) à Henri Xhaard, et (no 265481) à Jari Yli-Kauhaluoma, et les fonds de recherche de l'Université d'Helsinki à Gustav Boije af Genns. Les auteurs remercient Bernadette Gehl pour son aide technique pendant le projet.

1. Préparation des protéines
REMARQUE: L'expression et la purification de TmPPase a été décrite ailleurs13.
<ol><li>Préparer 10 ml de la solution tampon de réactivation contenant 20 mM 2-( N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) pH 6.5, 3.5% (v/v) glycerol, 2 mM dithiothreitol (DTT), et 0.05% dodecyl maltoside (DDM).</li>
	<li>Préparer 10 ml du mélange de réaction contenant 200 mM Tris-Cl pH 8,0, 8,0 mM MgCl2, 333 mM KCl, et 67 mM NaCl. REMARQUE : Mg2est nécessaire pour chélater le pyrophosphate comme substrat de mPPase, K- est nécessaire pour augmenter l'activité enzymatique car TmPPase est un mPPase dépendant du potassium, et Naest nécessaire pour l'activité enzymatique pendant la translocation d'ion de sodium par TmPPase.</li>
	<li>Préparer des liposomes de 30 mg/mL pour la réactivation des enzymes.<ol>
<li>Ajouter 10 ml de 20 mL de tris-HCl pH 8,0 avec 1 mM DTT à 0,3 g de L-phosphatidylcholine du soja à 10 ml de 20 mM Tris-HCl pH 8,0 avec 1 mM DTT.</li>
		<li>Mettre le liposome sur la glace, et sonicate avec 1 seconde d'intervalle d'impulsion pendant 1 minute, pause pendant 1 minute, et répéter jusqu'à ce que la solution devienne jaune transparent.</li>
		<li>Aliquot les liposomes, congeler dans l'azote liquide et stocker à -80 oC jusqu'à ce qu'ils soient utilisés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Réactiver l'enzyme.<ol>
<li>Mélanger 40 L de la solution liposomes avec 22,5 'L de 20% DDM.</li>
		<li>Chauffer le mélange à 55 oC pendant 15 min et laisser refroidir à température ambiante.</li>
		<li>Ajouter 36,5 L de la solution tampon de réactivation, mélanger et ajouter 1 l de protéines concentrées (13 mg/mL) pour obtenir une concentration totale de 0,13 mg/mL. REMARQUE : Les protéines sont habituellement congelées dans des aliquots de 10 l après la purification et décongelées sur la glace avant utilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prendre 20 ll de l'enzyme réactivée et ajouter à 1 480 l l du mélange de réaction, puis mélanger doucement. REMARQUE : L'ajout de l'enzyme réactivée au mélange de réaction doit être effectué juste avant qu'il ne soit utilisé.</li>
</ol>2. Préparation composée
<ol><li>Dissoudre les composés dans le sulfoxyde de diméthyle (DMSO) pour faire des solutions de stock de 25 à 100 mm dans 50'200 'L, en fonction de la disponibilité des composés. REMARQUE: Tous les composés utilisés ici (Figure 2A) ont été publiés précédemment9. Si la solubilité composée est faible, la concentration du stock peut être ajustée en conséquence.</li>
	<li>Préparer trois concentrations différentes de chaque composé dans l'eau. REMARQUE : Les concentrations finales dans le mélange de réaction seront 1, 5, et 50 micromolaires ou 1, 5, et 20 micromolar pour les composés solubles et avec parcimonie soluble, respectivement.<ol>
<li>Diluer la solution de bouillon avec de l'eau à 1 ml dans des microtubes pour donner 2 M, 10 M et 100 M pour les composés solubles, ou alternativement 2 M, 10 M et 40 M pour les composés solubles avec parcimonie.</li>
		<li>Vortex la solution composée instantanément après dilution de la solution de stock pour un bon mélange.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vérifiez l'agrégation composée à l'aide d'un néphélomètre. REMARQUE : Ceci a été étudié sous forme de triplitaux en trois concentrations (1 M, 5 M et 20 M) et normalisé au blanc dans une plaque de puits de 96.<ol>
<li>Distribuer 75 l de mélange de réaction dans chaque puits à l'aide d'une pipette multicanal.</li>
		<li>Ajouter 75 lde de chaque composé (pour le blanc, utiliser 75 l'eau à la place) et mélanger par pipetting de haut en bas de 5 degrés.</li>
		<li>Mesurer chaque puits à 300 V à l'aide d'un néphélomètre microplaque.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Réactifs pour la préparation de l'essai
<ol><li>Préparer la solution arsenit-citrate.<ol>
<li>Peser 5 g d'arsénite de sodium et 5 g de dihydrate de citrate trisodique. CAUTION: L'arsénite de sodium est toxique, donc utiliser un équipement de protection approprié et manipuler avec un soin particulier. Par mesure de précaution, ne pas gérer avant que toutes les précautions de sécurité nécessaires ont été lus et compris. Manipuler uniquement dans un capot de fumée afin de ne pas inhaler la poussière / vapeurs du composé ou de sa solution. En cas d'inhalation, passer à l'air frais et obtenir des soins médicaux. Portez des lunettes de sécurité chimiques appropriées, des gants de protection et des vêtements pour éviter l'ingestion et le contact entre les yeux et la peau. S'il est avalé, appelez immédiatement un centre antipoison ou un médecin/médecin. Si elle obtient sur la peau ou dans les yeux, laver avec beaucoup d'eau et obtenir des soins médicaux.</li>
		<li>Dissoudre dans 100 ml d'eau.</li>
		<li>Ajouter 5 ml d'acide acétique glaciaire, mélanger et ajouter de l'eau à 250 ml.</li>
		<li>Conserver à température ambiante à l'abri de la lumière. REMARQUE : La solution est stable depuis plus d'un an.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer la solution A et la solution B.<ol>
<li>Pour la solution A, ajouter 10 ml de glace froide de 0,5 M HCl à 0,3 g d'acide ascorbique. Dissoudre l'acide ascorbique par vortexing.</li>
		<li>Pour la solution B, ajouter 1 ml d'eau glacée à 70 mg d'hélimonium d'hélimolygène tétrahydrate et vortex pour se dissoudre. REMARQUE : Conservez les deux solutions sur la glace jusqu'à l'utilisation. Pour la cohérence du résultat d'analyse, les deux solutions peuvent être stockées sur la glace pendant un maximum d'une semaine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer la norme de phosphate (Pi) avec la concentration de 0 M, 62,5 M, 250 M et 500 M pour l'étalonnage.<ol>
<li>Ajouter 0 l, 25 l, 50 'L et 100 'L de 5 mM Na2HPO4 dihydrater à quatre microtubes contenant 370 'L du mélange de réaction.</li>
		<li>Garnir jusqu'à 1 ml d'eau.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Suivi d'activité pour une plaque de puits de 96
REMARQUE : Voir la figure 1 pour le flux de travail schématique de l'assay.
<ol><li>Ajouter 1 ml de solution B à 10 ml de solution A, mélanger par vortex et stocker la solution sur la glace. REMARQUE : Cette solution doit être transparente et jaune. Conserver la solution A et B sur la glace pendant au moins 30 minutes avant l'utilisation. Cependant, utilisez la solution dans les 3 h car elle ira mal après stockage à long terme.</li>
	<li>Ajouter 40 'L de 0 'M, 62,5 'M, 250 'M et 500 'MP i standard aux bandes de tube en tripler à l'aide d'une pipette multicanal. REMARQUE: Le mélange de réaction sans Pj'ai ajouté sera utilisé comme un blanc.</li>
	<li>Ajouter 25 l de solution composée aux bandes de tube à l'aide d'une pipette multicanal. REMARQUE : Chaque composé a trois concentrations différentes dans le triplicate qui est assez pour l'estimation initiale de la concentration inhibitrice moitié maximale (IC50). Pour une détermination IC50 plus précise, huit concentrations composées différentes peuvent être utilisées. Pour l'enzyme décomplexée, la solution composée est remplacée par une quantité égale d'eau. Comme contrôles positifs 2,5 M, 25 m, et 250 M de sel de sodium imidodiphosphate (IDP) ont été utilisés.</li>
	<li>Ajouter 15 ll de mélange de solution mPPase aux bandes de tube (sauf aux tubes contenant la norme Pi) à l'aide d'une pipette multicanal.</li>
	<li>Scellez les bandes tubulaires à l'effile d'étanchéité adhésive. Couper la feuille d'étanchéité pour séparer chaque bande tubulaire.</li>
	<li>Pré-incuber les échantillons pendant 5 min à 71 oC. Placez les échantillons sur le bloc de chauffage avec un intervalle de 20 s entre chaque bande afin de minimiser la consommation de temps pendant les étapes suivantes.</li>
	<li>Pour chaque bande, ouvrir l'étanchéité adhésive. Ajouter 10 l de 2 mm de dibasic pyrophosphate de sodium à l'aide d'une pipette multicanal et mélanger en pipetting de haut en bas pour 5 degrés. Scellez à nouveau la bande tubulaire en utilisant le même scellement. REMARQUE: Cette étape pourrait initialement être difficile à accomplir en 20 s; cependant, il deviendra plus facile après quelques essais.</li>
	<li>Incuber à 71 oC pendant 5 min.</li>
	<li>Placer les échantillons sur l'appareil de refroidissement avec un intervalle de 20 s entre chaque bande. Laisser refroidir pendant 10 min, mais centrifuger chaque bande peu après 5 min de refroidissement, pour décander les gouttes d'eau sous la feuille d'étanchéité, puis le remettre à l'appareil de refroidissement et enlever l'étanchéité. REMARQUE : L'appareil de refroidissement peut simplement être fabriqué en plaçant une plaque PCR de 96 puits sur un plat Petri en polystyrène (taille 150 mm et 15 mm) rempli d'eau et congelé pendant au moins 1 h. L'appareil doit être retiré du congélateur environ 5 minutes avant le début de l'assidu. Ne pas sortir l'appareil de refroidissement juste avant le refroidissement de l'échantillon car il va geler le mélange de réaction et entraver le développement des couleurs.</li>
	<li>Après 10 min de refroidissement, ajouter 60 l de la solution A et B, mélanger par pipetting de haut en bas pendant 5 degrés et garder les bandes de tube sur l'appareil de refroidissement pendant 10 min.</li>
	<li>Ajouter 90 oL de la solution de citrate d'arsénite et conserver à température ambiante pendant au moins 30 min pour produire une couleur bleue stable. CAUTION: En raison de sa toxicité, toutes les solutions contenant de l'arsénite de sodium doivent être manipulées avec une attention supplémentaire en tout temps. Ainsi, l'ajout de la solution de citrate d'arsénite devrait être fait dans une hotte de fumée.</li>
	<li>Distribuer 180 l de chaque mélange de réaction dans une microplaque claire de 96 puits de polystyrène.</li>
	<li>Mesurer l'absorption de chaque puits à 860 nm à l'aide d'un spectrophotomètre microplaque.</li>
</ol>5. Analyse des résultats
<ol><li>Moyenne des tripliques de chaque échantillon et des normes Pi. Ensuite, soustrayez avec le blanc pour éliminer le signal d'arrière-plan.</li>
	<li>Faire une courbe d'étalonnage en traçant les valeurs d'absorption (A860) par rapport à la quantité de norme Pi (nmol) et effectuer une régression linéaire pour obtenir la fonction trendline en utilisant la formule suivante : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ01a.jpg">
</li>
	<li>Calculez la quantité de phosphate (nmol) libérée de la réaction enzymatique en fonction de la formule de régression linéaire ci-dessus.</li>
	<li>Calculez l'activité spécifique à l'aide de la formule suivante : <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ02a.jpg"> où nPi est la quantité de phosphate libérée par la réaction (nmol), t est le temps de réaction (min), et mTmPPase est la quantité de TmPPase pur utilisé dans l'assay (mg).</li>
	<li>Calculez l'activité en pourcentage pour chaque concentration d'inhibiteurs à l'aide de la formule suivante : <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ03a.jpg"> où SAiis l'activité spécifique d'un échantillon avec inhibiteur et SAun est l'activité spécifique de l'échantillon décomplexé.</li>
	<li>Calculez le logIC50 (estimation) et ic50 (estimation) avec un ajustement de régression non linéaire de la courbe dose-réponse à quatre paramètres en utilisant la formule suivante : <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ04a.jpg"> où X est log de concentration (M), Y est activité (%), Top et Bottom sont des plateaux dans la même unité que Y (100% et 0%, respectivement), logIC50 a les mêmes unités de notation que X, et HillSlope - facteur de pente ou pente de colline, qui est unitaire. REMARQUE: Logiciel (Tableau des Matériaux) est utilisé pour le montage. Utilisez la concentration de 0,01 M (au lieu de 0,00 M) pour l'échantillon sans inhibiteur car le logarithme de zéro n'est pas défini.</li>
</ol>

<ol><li>Terstappen, G. C., Reggiani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+research+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">In silico research in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).</li>
<li>Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li>
<li>Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+pyrophosphatases%3A+a+novel+drug+target+for+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens.</a> AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).</li>
<li>Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrophosphate-Fueled+Na%2B+and+H%2B+Transport+in+Prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).</li>
<li>Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2B-PPases%3A+yesterday%2C+today+and+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">H+-PPases: yesterday, today and tomorrow.</a> IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vacuolar-H%2B-pyrophosphatase+%28TgVP1%29+is+required+for+microneme+secretion%2C+host+cell+invasion%2C+and+extracellular+survival+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).</li>
<li>Lemercier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyrophosphatase+regulating+polyphosphate+metabolism+in+acidocalcisomes+is+essential+for+Trypanosoma+brucei+virulence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).</li>
<li>Belogurov, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+pyrophosphatase+of+Thermotoga+maritima+requires+sodium+for+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity.</a> Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).</li>
<li>Vidilaseris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetry+in+catalysis+by+Thermotoga+maritima+membrane-bound+pyrophosphatase+demonstrated+by+a+nonphosphorus+allosteric+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor.</a> Science Advances. 5 (5), (2019).</li>
<li>Lin, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+membrane-embedded+H%2B-translocating+pyrophosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase.</a> Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).</li>
<li>Fiske, C. H., Subbarow, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+colorimetric+determination+of+phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The colorimetric determination of phosphorus.</a> Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).</li>
<li>Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molybdenum+blue+reaction+for+the+determination+of+orthophosphate+revisited%3A+Opening+the+black+box%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box.</a> Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).</li>
<li>Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+and+purification+of+membrane-bound+pyrophosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases.</a> Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).</li>
<li>Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+orthophosphate+determination+of+thermostable+membrane-bound+pyrophosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity.</a> Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).</li>
<li>He, Z. Q., Honeycutt, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+molybdenum+blue+method+for+orthophosphate+determination+suitable+for+investigating+enzymatic+hydrolysis+of+organic+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+in+Soil+Science+and+Plant+Analysis%22%5BJournal%5D)">A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates.</a> Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).</li>
<li>Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorinated+tyrosine+phosphates+to+probe+the+substrate+specificity+of+the+low+molecular+weight+phosphatase+activity+of+calcineurin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).</li>
<li>Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+strategy+to+determine+the+dependence+of+membrane-bound+pyrophosphatases+on+K%2B+as+a+cofactor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor.</a> Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Ici, nous rapportons un protocole détaillé pour le criblage simple des inhibiteurs pour la pyrophosphatase membranaire-liée de T. maritima dans un format 96 de plaque de puits basé sur Vidilaseris et autres14. Ce protocole est peu coûteux et basé sur l'acide 12-phosphomolybd, qui est formé à partir d'orthophosphate et de molybdate dans des conditions acides et réduit à des espèces de phosphomolybdène avec une couleur bleue distincte12. Cette méthode est préférée à ...

Environ 25 % des protéines cellulaires totales sont des protéines membranaires et environ 60 % d'entre elles sont des cibles médicamenteuses1,2. L'une des cibles médicamenteuses potentielles3, pyrophosphatases membranaires (mPPases), sont des enzymes dimériques qui pompent le proton et/ou l'ion de sodium à travers la membrane par hydrolyse de pyrophosphate en deux orthophosphates4. mPPases peut être trouvé dans divers organismes5 tels que les bactéries, archées, plantes, et les parasites protistes, à l'exception des humains et des animaux4. Chez les parasites protistes, par exemple Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii et Trypanosoma brucei, mPPases sont essentiels pour la virulence parasite6 et KO de cette expression dans les parasites conduire à l'échec dans le maintien du pH intracellulaire lors de l'exposition au pH de base externe7. En raison de leur importance et du manque de protéines homologues présentes chez les vertébrés, les mPPases peuvent être considérés comme des cibles médicamenteuses potentielles pour les maladies protistales3.
Le dépistage in vitro des inhibiteurs du mPPase dans ce travail est basé sur un système de modèle TmPPase. TmPPase est un pompage d'ion de sodium et de potassium ion dépendant mPPase de T. maritima et a son activité optimale à 71 c8. Les avantages de cette enzyme sont par exemple sa facilité de production et de purification, une bonne stabilité thermique et une activité spécifique élevée. TmPPase montre à la fois une forte similitude en plus de la conservation complète de la position ainsi que l'identité de tous les résidus catalytiques à la mPPases protiste3,9 et à la structure résolue de Vigna radiata10 mPPase. Les structures disponibles de TmPPase dans différentes conformations sont également utiles pour l'expérience de conception de médicaments basée sur la structure (comme le dépistage virtuel et la conception de novo).
Ici, nous rapportons un protocole détaillé pour le criblage des inhibiteurs de TmPPase dans un format de plaque de puits 96 (figure 1). Le protocole est basé sur la méthode colorimétrique de la réaction bleu molybdène, qui a d'abord été développé par Fiske et Subbarow11. Cette méthode implique la formation d'acide phosphomolybdique 12-phosphomolybd à partir d'orthophosphate et de molybdate dans des conditions acides, qui est ensuite réduite pour donner des espèces caractéristiques de phosphomolybdène de couleur bleue12.

<table><tbody><tr><td>Feuille d’étanchéité adhésive</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>Heptamolybdate d’ammonium tétrahydraté</td><td>Merck</td><td>F1412481 636</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95212-250G</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 96Well Multidish</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxyde (DMSO)</td><td>Merck</td><td>1167431000</td><td></td></tr><tr><td>Bandelettes de tubes PCR 8 puits 0,2 ml sans bouchons (120)</td><td>Nippon genetics</td><td>FG-028</td><td></td></tr><tr><td>Dodécyl maltoside (DDM)</td><td>Melford</td><td>B2010-100G</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Merck</td><td>1009901001</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Merck</td><td>1000631011</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Imidodiphosphate sodique sel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0631-1G</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha ;-Phosphatidylcholine issue de la lécithine de soja</td><td>Sigma</td><td>429415-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8147330500</td><td></td></tr><tr><td>Multiplate 96-Well PCR Plaques</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9651</td><td></td></tr><tr><td>MultiSkan Go</td><td>Thermo Scientific</td><td>10680879</td><td></td></tr><tr><td>Nepheloskan Ascent (Type 750)</td><td>Labsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrène Boîte de Pétri (taille 150 mm x 15 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5981-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Logiciel Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6 GraphPad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QBT2 Bloc chauffant</td><td>Grant Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Méta-arsénite de sodium</td><td>Fisher Chemical</td><td></td><td></td>12897692</tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique (Pi)</td><td>Sigma</td><td>S0876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Pyrophosphate de sodium dibasique</td><td>Fluka</td><td>71501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Citrate trisodique dihydraté</td><td>Fluka</td><td>71404-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

dépistage des inhibiteurs de la pyrophosphatase thermotoga maritima membrane-bound

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Les pyrophosphatases membranaires (mPPases) sont des enzymes dimériques qui se produisent dans les bactéries, les archées, les plantes et les parasites protistes. Ces protéines censent le pyrophosphate en deux molécules d'orthophosphate, qui est couplée avec le proton et/ou le pompage d'ion de sodium à travers la membrane. Comme aucune protéine homologue ne se produit chez les animaux et les humains, les mPPases sont de bons candidats dans la conception de cibles médicamenteuses potentielles. Ici nous présentons un protocole détaillé pour examiner les inhibiteurs de mPPase utilisant la réaction bleue de molybdène dans un système de plaque de puits 96. Nous utilisons le mPPase de la bactérie thermophile Thermotoga maritima (TmPPase) comme enzyme modèle. Ce protocole est simple et peu coûteux, produisant un résultat cohérent et robuste. Il ne faut qu'environ une heure pour compléter le protocole d'etoile d'activité depuis le début de l'assiduité jusqu'à la mesure de l'absorption. Étant donné que la couleur bleue produite dans cet analyse est stable pendant une longue période de temps, l'analyse ultérieure peut être effectuée immédiatement après le lot précédent, et l'absorption peut être mesurée plus tard pour tous les lots à la fois. L'inconvénient de ce protocole est qu'il est fait manuellement et peut donc être épuisant ainsi que nécessitent de bonnes compétences de pipetage et de temps. De plus, la solution de citrate d'arsenit utilisée dans cet assay contient de l'arsénite de sodium, qui est toxique et doit être manipulée avec les précautions nécessaires.

Dans ce protocole, huit composés (1 à 8) ont été testés (figure 2A) avec IDP, un inhibiteur commun des pyrophosphatases, comme un contrôle positif. Chaque composé a été testé à trois concentrations différentes (1 M, 5 M et 20 M) en triple. Le flux de travail de la présélection est représenté à la figure 1, à partir de la préparation de l'échantillon et du réactif jusqu'à la mesure de l'absorption à 860 nm.
À la fin de ce protocole, ap...

Ici nous présentons une méthode de criblage pour la pyrophosphatase membran-liée (de Thermotoga maritima) inhibiteurs basés sur la réaction bleue de molybdène dans un format 96 de plaque de puits.

Dépistage des inhibiteurs de la pyrophosphatase Thermotoga maritima Membrane-Bound

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Notre protocole fonctionne comme un outil pour trouver des composés qui inhibe la désintérorité de la pyrophosphatase liée à la membrane. Et ces inhibiteurs peuvent être utilisés dans le traitement de plusieurs maladies parasitaires. Ce protocole est bon marché et simple produisant la couleur stable pendant longtemps sans montrer n’importe quelle interférence en présence de la concentration élevée de phospholipide exigée pour la réactivation enzymatique.Préparez 10 millilitres de la solution tampon de réactivation, contenant 20 millimolaires M-E-S à PH 6,5, 3,5% volume en volume glycérol, deux millimolaireS D-T-T, et 0,05%D-D-M. Préparer 10 millilitres du mélangeur de réaction, contenant 200 millimolaires tris hydrochlorure à PH huit. Chlorure de magnésium de huit millimlaires, chlorure de potassium de 333 millimlaires et chlorure de sodium de 67 millimlaires.Préparer 30 milligrammes par liposomes millilitres pour la réactivation des enzymes. Tout d’abord, ajouter 10 millilitres de 20 millimillires de tris hydrochlorure à PH huit, avec un millimolaire D-T-T à 0,3 grammes de L alpha phosphatidylcholine de fèves de sève de sève de sève. Mettez le liposome sur la glace et sonicate avec une seconde post-intervalles pendant une minute.Faites une pause d’une minute et répétez jusqu’à ce que la solution devienne jaune transparent. Aliquot les liposomes en 100 microlitres, congeler l’azote liquide et stocker à 80 degrés Celsius négatif jusqu’à ce qu’il soit utilisé. Pour réactiver l’enzyme, décongeler la solution liposome à température ambiante.Mélanger 40 microlitres de la solution liposome avec 22,5 microlitres de 20%D-D-M. Garder le mélange à 55 degrés Celsius pendant 15 minutes. Et laissez-le refroidir à température ambiante.Ajouter ensuite 36,5 microlitres de la solution tampon de réactivation. Mélanger. Et ajouter un microlitre de protéines concentrées pour faire une concentration totale de 0,13 milligramme par millilitre. Ensuite, transférez 20 microlitres de l’enzyme réactivée à 1480 microlitres du mélange de réaction.Mélanger délicatement et utiliser immédiatement. Tout d’abord, dissoudre les composés dans D-M-S-O pour faire des solutions de stock de 50 millimolar en 200 microlitres. Pour les composés solubles diluer la solution de stock avec de l’eau à un millilitre dans des micro tubes, pour donner deux, 10, et 100 micromolaire.Pour chaque dilution, vortex la solution composée pour un bon mélange. Après cela, vérifiez la divergation composée, et à l’aide d’un pipet multicanal, distribuez 75 microlitres du mélange de réaction dans chaque puits dans une plaque de 96 puits. Ajouter 75 microlitres de chaque composé et de l’eau comme contrôle dans le triplicate, et mélanger en pipetting de haut en bas cinq fois.Mesurez chaque puits à 300 volts à l’aide d’un néphélomètre microplaqué. Pour préparer la solution de citrate d’arsénite, poids cinq grammes d’arsénite de sodium et cinq grammes de dihydrate de citrate de trisodique, dissoudre les deux composés en 100 millilitres d’eau. Ajouter ensuite cinq millilitres d’acide acétique glaciaire.Mélanger et ajouter de l’eau à 250 millilitres, conserver à température ambiante à l’abri de la lumière. Ensuite, préparer la solution A en ajoutant 10 millilitres d’acide chlorhydrique molaire de 0,5 molaire à 0,3 grammes d’acide ascorbique Dissoudre l’acide ascorbique par vortex. Préparez la solution B en ajoutant un millilitre d’eau glacée à 70 milligrammes de tétrathiomolybdate d’ammonium tétrathiomolybdate et vortex pour dissoudre.Conserver la solution A et B sur la glace. Préparer la norme de phosphate avec une concentration de zéro, 62,5, 250 et 500 micromolaires pour l’étalonnage. Ajouter zéro microlitres, 12,5 microlitres, 50 microlitres et 100 microlitres de phosphate disodique millimolaire dihydrate à quatre micro tubes contenant 370 microlitres du mélange de réaction.Garnir jusqu’à un millilitre d’eau. Maintenant, ajoutez un millilitre de solution B à 10 millilitres de solution A, mélangez à la main et stockez la solution sur la glace. À l’aide d’un pipet multicanal, ajouter 40 microlitres de zéro, 62,5, 250 et 500 micromolaires de phosphate standard aux scripts de tube en triplicate.Ajoutez ensuite 25 microlitres de solution composée et 15 microlitres de mélange de solution M-P-P-A de chaque tube. Sauf les tubes contenant de la norme de phosphate. Sceller les bandes de tube à l’intérieur d’une feuille d’étanchéité adhésive.Couper la feuille d’étanchéité pour séparer chaque bande de tube. Ensuite, précuber l’échantillon pendant cinq minutes à 71 degrés Celsius. Placez l’échantillon sur le bloc chauffant avec des intervalles de 20 secondes entre chaque bande.Pour chaque bande, ouvrez l’étanchéité adhésive. À l’aide d’un pipet multicanal, ajouter 100 microlitres de deux dibasic molaires de pyrophosphate de sodium. Et mélanger en pipetting de haut en bas pendant cinq fois.Sceller à nouveau la bande de tube à l’aide du même scellement. Incuber à nouveau à 71 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après cela, placez les échantillons sur l’appareil de refroidissement avec un intervalle de 20 secondes entre chaque bande.Laissez-les refroidir pendant cinq minutes, puis centrifugez brièvement chaque bande pour décanter les gouttes d’eau sous la feuille d’étanchéité. Remettre la bande à l’appareil de refroidissement, retirer l’étanchéité et laisser refroidir encore cinq minutes. Ajouter ensuite 60 microlitres de solution A et B, mélanger en pipetant de haut en bas pendant cinq fois, et garder les bandes de tube sur l’appareil de refroidissement pendant 10 minutes de plus.Dans une hotte fumigène, ajouter 90 microlitres de la solution de citrate d’arsène et conserver à température ambiante pendant au moins 30 minutes. Pour produire une couleur bleue stable. Distribuez 180 microlitres de chaque mélange de réaction dans une microplaque de polystyrène claire de 96 puits.Utilisez un spectrophotomètre microplaqué pour mesurer l’absorption de chaque puits à 860 nanomètres. Dans ce protocole, huit composés ont été examinés avec I-D-P, un inhibiteur commun de pyro phosphatase comme contrôle positif. Après l’ajout de la solution A et B, et du citrate d’arsénite, une couleur bleue en 30 minutes d’incubation à température ambiante.Les trois concentrations de composés non inhibants, ont montré la même intensité de couleur bleue. Ainsi que E-1 à E-3 sans aucun inhibiteur. L’intrigue de l’activité enzymatique contre la concentration de chaque composé testé, montre que le composé avec l’activité d’inhibition a formé un raccord de courbe non ligneaire.L’intrigue de l’I-D-P comme un contrôle positif, montre clairement une diminution de l’activité à des concentrations plus élevées. La courbe d’inhibition pour les composés un, cinq, six, sept et huit. Montre des concentrations inhibitrices demi-maximales à 1,7 micromolaire, 21,4 micromolaires, 58,8 micromolaires, 239,0 micromolaires et plus de 500 micromolaires, respectivement.N’oubliez pas de préparer, la solution M-P-P-A. Juste avant le début de l’analyse.

screening-for-thermotoga-maritima-membrane-bound-pyrophosphatase

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Une méthode d'évolution dirigée roman spécifique au domaine de l'ingénierie thermostabilité a été développé et validé par conséquent, pour les enzymes bactériolytiques. Après un seul tour de mutagenèse aléatoire, une enzyme bactériolytique évolué, PlyC 29C3, affichée deux fois supérieure à l'activité résiduelle par rapport à la protéine de type sauvage après incubation à température élevée.

Une nouvelle méthode de dépistage pour l&#39;évolution dirigée des enzymes thermostables bactériolytique

Source : Vidilaseris, K., et al. Dépistage des inhibiteurs de la pyrophosphatase liés à la membrane de Thermotoga maritima . J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo présente un test colorimétrique pour dépister les inhibiteurs de la pyrophosphatase liée à la membrane bactérienne (mPPase) en quantifiant la libération d’orthophosphate. La méthode permet d’identifier des composés qui inhibent la mPPase de Thermotoga maritima, une cible potentielle de médicament antimicrobien.

Inhibiteurs de criblage de la pyrophosphatase liée à la membrane bactérienne à l’aide d’un dosage colorimétrique 

Le présent rapport décrit un essai enzymatique in vitro pour mesurer l’activité de la phosphatidyléthanolamine méthyltransférase à l’aide d’extraits de cellules de Leishmania. Ce dosage est basé sur le transfert d’un groupe méthyle radioactif de la S-[méthyl-3H]adénosyl-L-méthionine sur la phosphatidyléthanolamine endogène.

Essai in vitro pour mesurer Phosphatidyléthanolamine Methyltransferase activité

Ce travail présente une méthode de criblage à haut débit utilisant un système universel de criblage enzymatique génétique qui peut théoriquement être appliqué à plus de 200 enzymes. Ici, le système de criblage unique identifie trois enzymes différentes (lipase, cellulase et phosphatase alcaline) en changeant simplement le substrat utilisé (acétate de p-nitrophényle, p-nitrophényl-β-D-cellobioside et phosphate de phényle).

Multi-enzyme préalable au moyen d&#39;un système de criblage enzymatique génétique à haut débit

Nous présentons un plan stratégique et un protocole pour identifier les variants génétiques non codants affectant la liaison à l’ADN du facteur de transcription (TF). Un protocole expérimental détaillé est fourni pour l’analyse du test de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA) et du test de précipitation d’affinité de l’ADN (DAPA) de la liaison de l’ADN TF dépendant du génotype.

Le dépistage de la fonctionnelle non-codant des variants génétiques utilisant mobilité électrophorétique Maj Assay (EMSA) et l&#39;ADN-affinité Précipitations Assay (DAPA)

La signalisation des récepteurs à péage (TLR) joue un rôle important dans la pathophysiologie de nombreuses maladies inflammatoires humaines et la régulation des réponses TLR par nanoparticules bioactives devrait être bénéfique dans de nombreuses conditions inflammatoires. Les cellules rapporteurs à base de cellules THP-1 fournissent une plate-forme de dépistage polyvalente et robuste pour identifier de nouveaux inhibiteurs de la signalisation TLR.

Criblage de nanoparticules bioactives dans des cellules immunitaires phagocytaires pour les inhibiteurs de la signalisation des récepteurs de type péage

Ce protocole a été développé pour étudier la transition dimer-dodecamer de TmPep1050, un Aminopeptidase M42, au niveau structurel. Il s’agit d’un pipeline simple qui part de la purification des protéines au traitement des données aux rayons X. Crystallogenesis, indexation d’ensemble de données, et remplacement moléculaire ont été soulignés par un cas d’étude, TmPep1050H60A H307A variante.

Cristallographie aux rayons X pour étudier la transition oligomérique de l’État de la Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

La capacité d’évaluer l’engagement cible par les inhibiteurs candidats dans les cellules intactes est cruciale pour la découverte de médicaments. Ce protocole décrit un test de décalage thermique cellulaire de format 384 qui détecte de façon fiable l’engagement cellulaire des inhibiteurs ciblant soit le SHP2 de type sauvage, soit ses variantes oncogènes.

Évaluation de l’engagement des cibles cellulaires par inhibiteurs de la phosphatase SHP2 (PTPN11)

Les ADN méthyltransférases sont des cibles potentielles de médicaments anticancéreux. Ici, un protocole est présenté pour évaluer les petites molécules pour l’inhibition de l’ADN méthyltransférase. Ce test utilise une endonucléase pour coupler la méthylation de l’ADN à la génération de fluorescence et permet de surveiller l’activité enzymatique en temps réel.

Essai de méthylation de l’ADN couplé à l’endonucléase en continu basé sur la fluorescence pour dépister les inhibiteurs de l’ADN méthyltransférase

Ce protocole introduit une méthodologie de dépistage fluorométrique optimisée pour identifier les inhibiteurs naturels de produits et petites molécules de la synthèse protéique. Sa praticité le rend adapté à la fois à l’enseignement de premier cycle en techniques de découverte de médicaments et à la mise en œuvre dans des campagnes de chimie médicinale.

Un protocole basé sur la fluorescence pour le dépistage préliminaire des inhibiteurs de synthèse protéique provenant de sources naturelles

Découvrez un criblage d'inhibiteurs de la pyrophosphatase membranaire de Thermotoga maritima par réaction au bleu de molybdène en plaque 96 puits. Cette méthode simple et économique permet d'identifier des composés thérapeutiques potentiels contre les maladies parasitaires.

Dépistage des inhibiteurs de la pyrophosphatase Thermotoga maritima Membrane-Bound

Explorer plus de vidéos