Utilisation du modèle De membrane chorioallantoïque de poulet In Vivo pour étudier les cancers gynécologiques et urologiques

L’engraftment des tumeurs sur la membrane chorioallantoic de poulet, ou CAM, peut être employé pour des études de la tumorigenicity, de l’efficacité de traitement ou de la tige croisée cellulaire. Cette méthode permet la croissance rapide rentable de tumeur dans un arrangement in vivo immunotolerant. En utilisant le modèle CAM, de nouvelles approches thérapeutiques peuvent être rapidement testées à l’aide de lignées cellulaires ou même de spécimens de tumeurs patientes.

Les aspects les plus cruciaux de ce protocole sont d’assurer une formation adéquate du CAM et de ne pas perturber le CAM ou la vascularisation lors de l’ouverture des œufs. Le septième ou huitième jour de développement, lorsque l’AMC s’est complètement développé, éteignez le rotateur d’oeufs et placez environ un à trois œufs dans la grille d’oeufs dans l’armoire de biosécurité. Une fois les lumières éteintes, placez un chandelier d’oeuf contre la coquille d’oeuf pour identifier et marquer l’emplacement de la cellule d’air d’un oeuf, puis déplacez le chandelier d’oeuf au-dessus de la coquille pour trouver un grand réseau de vaisseau sanguin, tournant l’oeuf si nécessaire.

Une vascularisation idéale se ram branchera près du milieu de l’œuf. Utilisez un marqueur pour tracer la vascularisation à utiliser pour l’implantation. Après avoir retourné la lumière dans le capot, utilisez un outil rotatif sans fil équipé d’une pierre de broyage de carbure de silicium pour percer un petit trou dans la coquille directement au-dessus du centre de la cellule d’air.

Lorsque la majeure partie de la coquille a été enlevée, mais avec la membrane intérieure blanche intacte, percer un autre petit trou où la fenêtre vasculaire sera ouverte comme vient de le démontrer. Lorsque le deuxième trou est prêt, utilisez une aiguille de calibre 18 pour percer doucement la membrane intérieure blanche au-dessus de la cellule d’air et de la vascularisation en prenant soin que la membrane interne blanche, mais pas le CAM, soit perturbée dans l’ensemble de la zone forée. Avec la lumière de capot éteinte encore, utilisez le chandelier d’oeuf pour vérifier que la cellule d’air a été transférée de l’extrémité de l’oeuf à la zone au-dessus de la vascularisation.

Si nécessaire, placez le tube sous vide inséré dans un contrôleur de pipette autour du trou au-dessus de la cellule d’air originale et appliquez doucement l’aspiration en rafales courtes pour déplacer la cellule d’air. Marquez le contour du nouvel emplacement de la cellule d’air d’environ 0,5 centimètre à l’intérieur de la limite de cam d’air et fixez un morceau de ruban d’emballage juste assez grand pour couvrir le trou au-dessus de la nouvelle cellule d’air. Après avoir préparé les deux autres oeufs comme nous venons de le démontrer, retournez les œufs à l’incubateur et ouvrez tous les oeufs supplémentaires pour l’expérience en groupes de un à trois comme démontré.

Lorsque tous les œufs ont été ouverts, transférer un à trois œufs avec des cellules d’air déplacées à la grille d’oeufs dans une armoire de biosécurité et utiliser un outil rotatif sans fil équipé d’une roue de coupe circulaire pour couper une petite ligne au-dessus de la limite des cellules d’air complètement à travers la cellule sans perturber le CAM ou la vascularisation. À l’aide de ciseaux incurvés, couper autour de la cellule d’air restante pour créer une fenêtre dans la coquille et vérifier la viabilité de l’embryon. Les embryons viables afficheront une vascularisation étendue, une albumine claire, un mouvement embryonnaire et/ou un rythme cardiaque visible.

Chez les embryons non viables, le CAM peut sembler opaque avec peu de vaisseaux, le cas échéant, présents et les embryons peuvent être petits ou absents sans mouvement ni battement de cœur. À l’aide de forceps Semkin, tirez de petits morceaux de coton d’une boule de coton stérile et épongez doucement la surface CAM des embryons viables pour enlever toute poussière et débris de coquille, puis couvrez l’ouverture de la coquille d’un morceau d’un quart de six par sept centimètres de pansement transparent sans toucher le CAM et retournez les œufs à l’incubateur avec la fenêtre ouverte face vers le haut. Utilisez un morceau de porte-oeufs, le bord du rotateur d’oeufs, ou un autre article approprié pour soutenir tous les oeufs qui continuent à rouler.

Pour préparer la suspension des cellules cancéreuses à la transplantation, récoltez les cellules de la culture des cellules cancéreuses d’intérêt et sédimentez les cellules par centrifugation. Aspirer le supernatant et résusquer mécaniquement les cellules dans le milieu résiduel. Placez la suspension cellulaire sur la glace et utilisez une pipette pour mesurer le volume de cellules à moyen.

Puis résuspendez les cellules à une concentration d’un à deux millions de cellules dans 20 à 100 microlitres de milieu complété avec 2,7 à 4 milligrammes par matrice extracellulaire millilitre et tous les facteurs de croissance ou d’autres additifs d’intérêt. Pour l’implantation de cellules cancéreuses, à l’aide d’un anneau antiadhésif, placez jusqu’à six œufs à implanter sur la grille d’oeufs et roulez les bords du film transparent s’habillant vers la fenêtre ouverte pour retirer le film des coquilles. Vérifiez si les œufs sont viables et sains.

Les oeufs idéaux auront un grand récipient avec de plus petits navires de branchement dans le centre de la zone ouverte. À l’aide de forceps d’iris incurvés, placez un anneau antiadhésive stérile sur le CAM au-dessus du navire idéalement au-dessus d’un point de branche. Utilisez une tige de remue-remuer stérile en verre pour abrader doucement le CAM et pipette la suspension des cellules cancéreuses dans le centre de l’anneau.

Lorsque toutes les cellules ont été livrées, sceller l’ouverture avec un morceau d’un quart de six par sept centimètres de pansement transparent film et étiqueter l’œuf avec une désignation d’implant approprié. Ensuite, placez les œufs solidement dans l’incubateur avec l’ouverture de la coquille orientée vers la verticale. Pour implanter des cellules cancéreuses sans l’utilisation d’un anneau antiadhésif, aspirez la suspension cellulaire dans une pointe de pipette de taille appropriée et en tenant la partie supérieure de la pointe éjecter soigneusement la pointe de la pipette et placez la pointe horizontalement dans un plat stérile de culture tissulaire de 10 centimètres.

Une fois les pointes chargées, placer le plat dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes, en vérifiant la polymérisation après 15 minutes. Une petite quantité de liquide s’écoule généralement à mesure que chaque pointe est placée dans le plat. Utilisez ce liquide pour estimer l’étendue de la polymérisation à l’intérieur de la pointe.

Lorsque la matrice est prête, placez une pointe sur une pipette de taille appropriée et déprimez le piston pour forcer la suspension cellulaire partiellement polymérisée sur le CAM idéalement au-dessus du point ramifié d’un grand navire bien développé. Utilisant ces méthodes, les lignes humaines et murines de cellules de cancer ovarien et les morceaux primaires de tumeur ont eu comme conséquence l’engraftment réussi des tumeurs avec des morphologies compatibles à ceux observés dans d’autres modèles in vivo. Des types de tumeur examinés, la croissance de cancer ovarien était beaucoup moins prononcée et typiquement pas visible sans l’aide de la formation image de bioluminescence.

Les effets de l’ajout de facteurs de croissance ou d’hormones au moment de l’implantation peuvent également être testés à l’aide de ces méthodes. Pour le cancer du rein, l’implantation de cellules rénales claires carcinome cellulaire à partir de lignées cellulaires établies ou des morceaux de tumeurs rénales humaines primaires produit rapide, formation tumorale robuste. En outre, plusieurs lignées humaines et murines de cellules de cancer de la prostate et lignées humaines de cellules cancéreuses de réservoir souple et morceaux primaires de tumeur avaient été employées pour établir des tumeurs utilisant ce modèle.

Il est crucial d’éviter de perturber le CAM et la vascularisation et de s’assurer que le CAM n’adhère pas à la coque lors de l’ouverture de la fenêtre. Après l’engraftment réussi, le modèle de CAM peut être employé pour évaluer l’efficacité thérapeutique des traitements d’intérêt ou des interactions entre différents types de cellules dans une tumeur.