Identifier les inhibiteurs de l'interaction HBx-DDB1 à l'aide d'un système d'assay Split Luciferase
21 décembre 2019
Ici, nous présentons une méthode pour le dépistage des agents viraux anti-hépatite B qui inhibent l'interaction HBx-DDB1 à l'aide d'un système d'évaluation de la luciferase fractionnée. Ce système permet une détection facile des interactions protéines-protéines et convient à l'identification des inhibiteurs de ces interactions.
L’interaction HBX-DDB1 est une étape cruciale pour promouvoir la transcription du VPH à partir de l’AICDNA, de sorte que ce protocole peut devenir un atout clé pour découvrir de nouveaux agents thérapeutiques pour la guérison fonctionnelle du VPH. Notre procédure est simple et ne nécessite qu’un court laps de temps pour l’écran. L’interaction que je mélange peut être détectée en temps réel sans nécessiter de lyse cellulaire.
En outre, la qualité de dépistage est satisfaisante avec un score élevé Z prime. L’inhibition de l’interaction HBX-DDB1 conduit à la restauration de Smc5/6, ce qui entraîne la suppression de la transcription du VPH, de l’expression des protéines et de la production de cccDNA. Ce nouveau mécanisme d’action antivirale peut surmonter les insuffisances des thérapies actuelles de HPV.
Les interactions protéine-protéine sont une classe importante de cibles médicamenteuses. L’acide à base de luciferase fendue décrit ici, qui cible les interactions entre les protéines virales et hasS, peut fournir une nouvelle stratégie pour développer des remèdes pour d’autres maladies infectieuses. Bien que notre protocole soit simple et facile à comprendre, certaines étapes peuvent être difficiles à reproduire sans la démonstration visuelle.
Ainsi, la démonstration visuelle sera d’une grande aide pour comprendre notre protocole. Commencez par ensemencer cinq fois 10 à la 5e cellule HEK293T dans un plat de 100 millimètres avec 10 millilitres de DMEM, et les incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, diluer un microgramme chacun de HBx-LgBit et SmBit-DDB1 exprimant des plasmides d’ADN et un tampon de condensation d’ADN pour un volume total de 300 microlitres.
Ajouter 16 microlitres de solution enhancer, et mélanger les tubes par vortex pendant une seconde. Incuber l’échantillon à température ambiante pendant trois minutes, puis ajouter 60 microlitres de réavenant transfection. Vortex le tube pendant 10 secondes, et incuber l’échantillon pendant encore huit minutes.
Pendant ce temps, aspirer le milieu du plat avec les cellules et les laver avec cinq millilitres de PVS. Aspirer le PVS et ajouter sept millilitres de DMEM. Ajouter trois millilitres de DMEM au tube avec les complexes de transfection, pipette de haut en bas pour mélanger, et ajouter le mélange aux cellules.
Ensuite, incuber les cellules à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 10 heures. Après l’incubation, retirer le milieu de culture usé et laver les cellules avec cinq millilitres de PVS. Retirez le PVS à un millilitre de 0,25% trypsine EDTA, et incuber les cellules à 37 degrés Celsius pour les détacher.
Ensuite, ajouter quatre millilitres de DMEM, et disperser le milieu en le pipetting sur la surface de la couche cellulaire à plusieurs reprises, et transférer la suspension dans un tube. Centrifuger les cellules à 500 fois G pendant cinq minutes, puis jeter le supernatant, et de suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans un millilitre de PVS. Répétez la cérifugation et jetez le supernatant.
Puis, re-suspendre la pastille cellulaire avec milieu de culture cellulaire tamponné complété par 10%FBS à une densité d’ensemencement d’un million de cellules par millilitre. Pipette 50 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 96 puits, et retourner les cellules à l’incubateur de 37 degrés Celsius pendant 10 heures. Pendant que les cellules couvent, diluer les composés de criblage et le solvant à 13,5 X de concentration.
Ajouter 12,5 microlitres de substrat luminescent à chaque puits et incuber la plaque pendant cinq minutes à température ambiante. Mesurez la luminescence de base à l’aide d’un luminomètre, et ajoutez cinq microlitres des composés et dmso contrôlé à chaque puits immédiatement après. Mesurer la luminescence toutes les 30 minutes pendant deux heures, puis calculer les effets inhibiteurs des composés par rapport au traitement DMSO.
Des signaux de luminescence de ligne de base ont été mesurés, et le rapport signal-arrière-plan a été calculé pour être supérieur à 80. Le z prime était supérieur à 0,5, ce qui indique que ce système d’analyse est acceptable pour le criblage à haut débit. En fixant le seuil à plus de 40% d’inhibition par rapport au contrôle DMSO seulement, le nitazoxanide a été identifié comme un médicament candidat.
Nous avons précédemment identifié le nitazoxanide comme inhibiteur de l’interaction HBX-DDB1 en sélectionnant une bibliothèque composée à petite échelle réactive avec cette méthode. En utilisant le nitazoxanide, nous confirmons que l’inhibition de l’interaction HBX-DDB1, cette réduction de la transcription virale, et les niveaux de produits viraux ultérieurs. La partie optimale de la luciferase fendue fusionnée à une protéine cible doit être déterminée à l’avance.
Dans ce cas, HPX fusionné à Large Bit au terminus C de HPX et DDB1 fusionné à Small Bit à la fin terminus de DDB1 fourni les meilleurs résultats.
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Aperçu
Cette étude présente une méthode pour dépister les agents anti-hépatite B viraux qui inhibent l'interaction HBx-DDB1 en utilisant un système d'analyse de luciférase divisée. Le protocole permet une détection en temps réel des interactions protéine-protéine sans lyse cellulaire, facilitant la découverte de nouveaux agents thérapeutiques pour la guérison fonctionnelle du HPV.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neuroscience
- Virologie
- Pharmacologie
Contexte
- L'interaction HBX-DDB1 est essentielle pour la transcription du HPV à partir de l'ADNccc.
- Les thérapies actuelles du HPV présentent des insuffisances que cette méthode vise à résoudre.
- La restauration de Smc5/6 par l'inhibition de HBX-DDB1 peut supprimer la transcription du HPV.
- Le système d'analyse de luciférase divisée fournit un score Z prime élevé pour la qualité du dépistage.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode pour identifier les inhibiteurs de l'interaction HBX-DDB1.
- Faciliter la découverte de nouveaux agents thérapeutiques pour le HPV.
- Améliorer l'efficacité et la qualité du dépistage dans la recherche antivirale.
Méthodes utilisées
- Système d'analyse de luciférase divisée pour détecter les interactions protéine-protéine.
- Suivi en temps réel des interactions sans lyse cellulaire.
- Évaluation de la qualité du dépistage à l'aide du score Z prime.
- Évaluation des mécanismes antiviraux ciblant HBX-DDB1.
Résultats principaux
- La méthode détecte avec succès l'interaction HBX-DDB1 en temps réel.
- L'inhibition de HBX-DDB1 conduit à la restauration de Smc5/6.
- Une suppression de la transcription du HPV et de la production d'ADNccc a été observée.
- L'approche peut fournir un nouveau mécanisme d'action antivirale.
Conclusions
- Cette méthode offre une voie prometteuse pour la découverte de nouvelles thérapies contre le HPV.
- Elle répond aux limites des traitements existants en ciblant HBX-DDB1.
- L'analyse de luciférase divisée est un outil précieux pour la recherche antivirale future.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Targeting the HBx-DDB1 interaction addresses a critical mechanistic bottleneck in hepatitis B virus (HBV) drug discovery, enabling direct intervention at the level of viral protein expression. The split luciferase assay system provides real-time, quantitative readouts for inhibitor screening, supporting predictive confidence in early-stage target validation. This platform strengthens portfolio triage by enabling high-throughput identification of compounds with novel antiviral mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of the HBx-DDB1 protein-protein interaction central to HBV pathogenesis.
- Supports biological de-risking by linking inhibition to restoration of Smc5/6 and suppression of viral transcription.
- Facilitates predictive confidence in target engagement through real-time, live-cell measurement.
Screening & Assay Development
- Delivers a validated, high Z prime assay suitable for high-throughput compound screening.
- Provides robust, quantitative luminescence outputs for reliable compound ranking.
- Enables reproducible, scalable workflows for screening libraries against protein-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms by targeting viral protein expression from cccDNA.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by linking molecular inhibition to functional outcomes.
- Reduces translational risk by focusing on a mechanistically validated antiviral target.
Pipeline & Workflow Integration
This split luciferase assay system integrates at the early discovery and lead identification stages, bridging target validation and high-throughput screening for HBV and potentially other viral targets.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing of protein-protein interaction inhibitors in live cells.
- Screening: Offers assay readiness and reproducibility with high signal-to-background and Z prime metrics.
- Analytics: Generates quantitative inhibition data to compare compound efficacy and selectivity.
- Translational Research: Connects molecular inhibition to restoration of host restriction factors and suppression of viral transcription.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other protein-protein interaction targets in infectious disease research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for HBV drug discovery.
- Operational Value: Standardizes and accelerates screening workflows with robust, reproducible outputs.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of novel antiviral candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds with unique mechanisms of action.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein-protein interaction assays and live-cell luminescence measurements.
- Needs access to cell culture, transfection reagents, and plate-based luminometry infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay setup and data analysis for reproducibility.
- May require optimization of fusion protein constructs for different target pairs.
- Visual protocol demonstration aids reproducibility for complex assay steps.
