Name: Système efficace d’expression plasmide contrôlée par transcription pour l’étude de la stabilité des transcriptions de l’ARNm dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Découvrez un système d'expression plasmidique inducible pour étudier la stabilité de l'ARNm dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires par électroporation pipette. Cette méthode minimise les perturbations physiologiques cellulaires.

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Francis Migneault a reçu une bourse du Réseau de santé respiratoire du Québec et du programme de formation pulmonaire des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), d’un programme d’études de la FRSQ et d’un poste d’étudiant de la Faculté des Études Supérieures et Postdoctorales, Université de Montréal. Ces travaux ont été appuyés par la Chaire Gosselin-Lamarre en recherche clinique et les Instituts de recherche en santé du Canada [YBMOP-79544].

Toutes les procédures animales ont été menées conformément aux lignes directrices du Conseil canadien sur les soins aux animaux et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins aux animaux du Centre de recherche du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal (CRCHUM).
1. Conception et génération du plasmide de réponse exprimant le gène d’intérêt (GOI)
<ol><li>Utilisez un vecteur inductible de tétracycline, comme pTRE-Tight.</li>
	<li>Analyser la séquence du GOI et le site de clonage multiple (MCS) du vecteur afin d’identifier les sites de restriction dans le MCS qui ne sont pas présents en interne dans le GOI.</li>
	<li>Isoler les cellules épithéliales alvéolaires primaires des poumons mâles de rat Sprague-Dawley comme décrit précédemment19,20.</li>
	<li>Purifier l’ARN total des cellules épithéliales alvéolaires par extraction d’ARN à l’aide d’une méthode standard, comme l’extraction du phénol/chloroforme ou l’utilisation de colonnes de spin à base de silice.</li>
	<li>Rétro-transcrire l’ARNm en ADN complémentaire (CDNA) à l’aide d’oligo(dT) et de transcriptase inversée haute fidélité.</li>
	<li>Utilisez la polymérase Taq haute fidélité et les techniques PCR de chevauchement standard pour accompagner le GOI avec deux sites sélectionnés de reconnaissance d’enzymes de restriction à l’aide d’amorces conçues.<ol>
<li>Demandez à l’apprêt avant de contenir un site de liaison ribosome de consensus Kozak21 pour améliorer les niveaux d’expression pour étudier l’expression des protéines en parallèle avec la stabilité de l’ARNm. Une séquence codant l’épitope V5 en amont du GOI doit être incluse pour distinguer l’expression du GOI transfected de l’expression endogène(tableau 1).</li>
		<li>Demandez à l’amorce inverse de contenir un signal de polyadenylation après le codon d’arrêt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Les mutants peuvent être générés par la suppression séquentielle pour étudier les effets de différentes régions UTR de 3' sur la stabilité de l’ARN de l’IERn à l’aide d’amorces inversées codant un site de polyadenylation qui supprime progressivement la fin 3' de l’UTR GOI 3 (figure 6). Alternativement, la mutanèse dirigée par PCR peut être utilisée pour cibler une région d’intérêt spécifique dans l’UTR22de 3' .</li>
	<li>Digest le vecteur inductible et l’insert avec les enzymes de restriction précédemment choisies à la température d’incubation appropriée pendant 1 h, suivie d’un traitement avec phosphatase pendant la réaction vectorielle pendant 30 min pour éviter l’auto-ligation.</li>
	<li>Séparez le vecteur digéré et insérez des segments par électrophoresis dans un gel agarose de 1 à 1,5 % (concentration selon la taille de l’insert).</li>
	<li>À l’aide d’une lame et d’une lumière UV, recueillir les fragments d’ADN contenant l’insert et le vecteur désiré pour être ligated. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.</li>
	<li>Purifier les segments collectés à partir du gel agarose à l’aide d’un kit de purification PCR à base de silice et mesurer la concentration par spectrophotométrie à 260 nm.</li>
	<li>Ligate le GOI et le vecteur inductible avec la ligase d’ADN T4 utilisant un rapport vectoriel : insérer le rapport molaire de 1:3 pour augmenter la probabilité de ligature. Incuber la réaction à température ambiante (RT) pendant 3 h.</li>
	<li>Transformez la réaction de ligature en E. coli compétent (DH5).<ol>
<li>Ajouter 1-10 ng de vecteur et de gène à un tube contenant 100 ll de cellules compétentes. Incuber les cellules sur la glace pendant 30 min, puis les cellules à choc thermique à 42 oC pour 45 s. Placer le tube sur la glace pendant 2 min et ajouter 900 l 'L de RT LB moyen. Incuber les cellules pendant 1 h à 37 oC avec secousses à 225 tr/min.</li>
		<li>Étendre 100 l de la réaction sur une plaque d’agar LB avec un antibiotique approprié (par exemple, 100 g/mL ampicilline pour le vecteur pTRE-Tight) pour sélectionner les bactéries transformées. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 oC.</li>
		<li>Sélectionnez les colonies individuelles à l’aide d’une boucle d’inoculation ou d’une pointe de 20 L et incuber toute la nuit dans un milieu de 5 ml de LB contenant l’antibiotique approprié à 37 oC avec secousses. Les bactéries transformées peuvent être stockées dans des stocks de glycérol à -80 oC à un rapport de 400:600 de LB moyen à glycérol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extraire l’ADN plasmide à l’aide de colonnes plasmides à base de silice et mesurer la concentration par spectrophotométrie à 260 nm. Confirmer l’insertion du GOI par l’analyse de restriction et son orientation et l’absence de mutations potentiellement introduites pendant RT-PCR par séquençage.</li>
</ol>2. Transfection du plasmide de réponse exprimant le gène d’intérêt (GOI) dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires
<ol><li>Isoler les cellules épithéliales alvéolaires de type II des poumons de rat.</li>
	<li>Ensemencer les cellules à une densité de 1 x 106 cellules/cm2 en 100 mm Petri plats avec le milieu essentiel minimum complet (MEM complet). Le MEM complet est MEM complété par 10% FBS, 0,08 mg/L tobramycin, Septra (3 g/mL trimethoprim et 17 g/mL sulfamethoxazole), 0,2% NaHCO3, 0,01 M HEPES (pH - 7,3), et 2 m glutM-Lamine. Culture des cellules pendant 24 h à 37 oC en 5% de CO2 dans un incubateur humidifié.</li>
	<li>Le lendemain, placez 500 l de MEM complet sans antibiotique dans chaque puits d’une nouvelle plaque de 12 puits et avant la mise à l’avant-garde de la plaque à 37 oC pendant 30 min. Pendant cette étape, il est important d’utiliser du sérum bovin fœtal exempt de contamination des tétracyclines ou d’un niveau trop bas pour interférer avec l’inductibilité.</li>
	<li>Préparer des tubes de 1,5 mL contenant le plasmide avec le GOI inductible (GOI plasmide) et le vecteur réglementaire (p.pTet-Off) en ajoutant 1 g de plasmide GOI et 1 g de vecteur réglementaire par puits à RT. Pour les expériences de coexpression avec des protéines liant l’ARN (RBP), 1 g d’un vecteur constitutif (p. ex., pcDNA3) exprimant le RPB d’intérêt est ajouté au mélange d’ADN(figure 7).</li>
	<li>Aspirer le milieu et rincer doucement les cellules avec PBS (sans calcium et magnésium) pré-émaillée à 37 oC.</li>
	<li>Ajouter 5 ml de trypsine de 0,05 % préenchassa à 37 oC et incuber les cellules jusqu’à ce que les cellules soient détachées (2-4 min). Neutraliser la trypsine en ajoutant 10 ml de MEM complet sans antibiotique.</li>
	<li>Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml, laver le plat Petri avec 4 ml de milieu pour recueillir autant de cellules restantes que possible, puis centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Aspirez et jetez doucement le supernatant et réutilisez la pastille dans 1 ml de PBS. Comptez et calculez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min. Aspirer doucement le supernatant et réanimer la granule dans un tampon de résuspension à une concentration de 4 x 107 cellules/mL. Ajouter les cellules du tube de 1,5 mL préparé à l’étape 2.4 à une concentration de 400 000 cellules par puits et les mélanger doucement en les canalisation de haut en bas.</li>
	<li>Placer le tube dans le dispositif d’électroporation et le remplir de 3,5 ml de tampon électrolytique.</li>
	<li>Insérer une pointe d’électrode plaquée or dans une pipette en appuyant complètement sur le piston. Mélanger délicatement le contenu du tube de 1,5 mL et aspirer soigneusement les cellules avec la pipette. Veillez à empêcher les bulles d’air d’entrer dans la pointe, car cela provoquera l’arc électrique pendant l’électroporation et entraînera une diminution de l’efficacité de la transfection.</li>
	<li>Insérez la pipette dans la station d’électroporation jusqu’à ce qu’il y ait un bruit de clic.</li>
	<li>Sélectionnez le protocole d’électroporation approprié pour les cellules épithéliales alvéolaires, correspondant à une tension d’impulsion de 1 450 V et 2 impulsions d’une largeur de 20 ms, et appuyez sur Démarrer sur l’écran tactile.</li>
	<li>Immédiatement après la transfection, retirez la pipette et transférez les cellules à un puits préalablement rempli de MEM complet sans antibiotique qui a été préenchillé à 37 oC.</li>
	<li>Répéter les étapes 2.11-2.14 pour les échantillons restants.</li>
	<li>Secouez doucement la plaque pour répartir uniformément les cellules sur la surface du puits. Incuber les cellules à 37 oC en 5% de CO2 dans un incubateur humidifié. Après 2 jours, remplacer le milieu par meM complet avec des antibiotiques.</li>
	<li>Confirmer le succès de la transfection en observant l’expression de l’EGFP sous un microscope à fluorescence ou par cytométrie d’écoulement à l’aide d’un vecteur de contrôle(figure 1). REMARQUE : Cette étape est facultative et nécessite une étape transfection supplémentaire à l’aide d’un plasmide différent exprimant eGFP, comme pcDNA3-EGFP.</li>
</ol>3. Induction de l’inhibition de la transcription du GOI
REMARQUE : Les cellules peuvent être traitées à l’avance avec les traitements souhaités avant l’induction de doxycycline afin d’évaluer leur impact sur la stabilité de l’ARNm(figure 5).
<ol><li>Préparer une solution de stock de doxycycline de 1 mg/mL dans de l’eau déionisée. Conservez la solution de stock à -20 oC protégée de la lumière. La doxycycline, un dérivé de la tétracycline, est utilisée au lieu de la tétracycline parce qu’elle a une demi-vie plus longue (2x) que la tétracycline. En outre, une concentration plus faible de doxycycline est nécessaire pour l’inactivation complète de l’opéon du tet 23. REMARQUE : La doxycycline pourrait affecter l’expression d’ARNm du GOI endogène. Pour vérifier cela, l’effet d’un traitement de 24 h avec de la doxycycline sur les cellules alvéolaires devrait être testé pour confirmer l’absence de tout changement dans l’expression du goI(figure 2).</li>
	<li>Préparer une solution de doxycycline fraîche de 1 g/mL en posttransfection COMPLÈTE MEM 72 h et la réchauffer à 37 oC.</li>
	<li>Remplacer le milieu par 1 ml de MEM complet contenant 1 g/mL doxycycline par puits pour inhiber la transcription du GOI.</li>
	<li>Incuber plusieurs puits à 37 oC en CO2 à 5% pour différentes quantités de temps de 15 min-6 h pour évaluer la demi-vie de l’ARNm.</li>
	<li>À la fin du traitement, laver les cellules avec PBS glacé et les lyse avec un kit d’extraction d’ARN phénol-chloroforme disponible dans le commerce en ajoutant 500 lil de tampon par puits et en secouant la plaque pour homogénéiser les cellules.</li>
	<li>Isolez l’ARN selon le protocole du fabricant. Déterminez le rendement et la pureté de l’ARN par spectrophotométrie à 230, 260 et 280 nm. Les échantillons d’ARN avec des ratios d’ARN de 260:230 et 260:280 de 1,8 et 2,0, respectivement, sont considérés comme purs. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.</li>
</ol>4. Déterminer la stabilité de l’ARNm du GOI
<ol><li>Traiter 1 g d’ARN total avec DNAse I (qualité d’amplification) sans ARN pour enlever toute trace d’ADN plasmide qui pourrait interférer avec l’amplification ultérieure de l’ADN.<ol>
<li>Dans un tube PCR de 0,2 mL, combinez 1 g d’ARN total, 1 ll de tampon de réaction DNase I de 10x, 1 L de DNAse I (1 U/L) et eau sans ARN pour obtenir un volume total de 10 L.</li>
		<li>Incuber la réaction à RT pendant 20 min.</li>
		<li>Désactiver DNAse I en ajoutant 1 lL de 25 mM EDTA au mélange de réaction de 10 L et en incuber la réaction à 70 oC pendant 10 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Inverser-transcribe l’ARN total appauvri par l’ADN dans l’ADN cDNA à l’aide d’un kit de synthèse cDNA disponible dans le commerce avec un mélange d’amorces d’olig(dT) et d’héxamer aléatoire pour améliorer l’efficacité de la transcription inverse.<ol>
<li>En bref, ajoutez 4 L de mélange de réaction 5x, 1 l de transcriptase inverse et 4 L d’eau sans ARN à 11 lil du mélange total d’ARN appauvri par l’ADN pour obtenir un volume de réaction total de 20 L. Mélanger la réaction bien en la canalisation de haut en bas.</li>
		<li>Incuber la réaction pendant 5 min à 25 oC, suivie de 20 min à 46 oC, puis inactiver la réaction en l’incubant à 95 oC pendant 1 min. Chaque réaction produira 50 ng/L de produit d’ADN.</li>
		<li>Diluer la réaction de l’ADNC à une concentration de 5 ng/L en ajoutant 180 l 'L d’eau de biologie moléculaire-grade au mélange de réaction de 20 L. Entreposez les produits cDNA à -80 oC ou procédez immédiatement à l’exécution du PCR quantitatif en temps réel (QPCR). REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.</li>
	</ol></li>
	<li>Concevez des amorces qPCR avant et inversées spécifiques au GOI.<ol>
<li>En raison de l’expression endogène du GOI dans les cellules, les amorces doivent être conçues pour amplifier un amplicon de 100-150 bp de l’épitope V5 couplé au GOI (tableau 1).</li>
		<li>Les amorceurs de gènes de référence interne doivent également être utilisées comme témoins de normalisation. Habituellement, les gènes d’entretien ménager, tels que les gènes bêta-actin et hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1, sont utilisés comme gènes de référence. Cependant, ceux-ci ne peuvent pas être utilisés avec ce système d’induction en raison de la variation de l’efficacité transfection. Au lieu de cela, l’expression de la transcription tTA-Ad est évaluée aux fins de la normalisation, parce que son expression est constitutive dans les cellules en raison de l’activité du promoteur de cytomégalovirus. Toute variation de son expression mesurée par qPCR sera représentative de l’efficacité transfection (amorce : avant 5'-GCC TGA CGA CAGA GGA AAC TC-3' et inverser 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp amplicon) et permettra la normalisation de l’expression des clones transfectés(figure 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer chaque réaction qPCR en triplicate à l’aide d’un mélange de maître de teinture SYBR Green.<ol>
<li>Diluer le mélange d’ADNC de 5 ng/L à une concentration de 1,25 ng/L à l’aide d’eau de qualité biologique moléculaire.</li>
		<li>Combinez 5 L de SYBR Green dye master mix (2x), 0.1 'L d’eau de biologie moléculaire de qualité, 0,45 L d’apprêt avant de 7,5 M, 0,45 ll de l’amorce inversée de 7,5 M et 4 L de 1,25 ng/L cDNA pour obtenir un volume de réaction total de 10 L. Mix bien par pipe de haut en bas dans une plaque de 96 puits PCR. Utilisez un film adhésif optique pour vous assurer que le couvercle de la plaque est scellé et pour prévenir la contamination et l’évaporation.</li>
		<li>Tournez brièvement le mélange de réaction par centrifugation et placez la plaque dans un thermocycler qPCR.</li>
	</ol></li>
	<li>Amplifier les amplicons GOI et tTA-Ad étiquetés V5 en utilisant les conditions qPCR suivantes : 95 oC pendant 10 min comme étape de dénaturation, suivie de 40 cycles de 95 oC pour 10 s, 58 oC pour 15 s et 72 oC pour 20 s. Une courbe de fonte haute résolution doit être générée après l’exécution des cycles d’amplification afin d’évaluer les températures de fonte spécifiques des amplicons désirés et d’assurer l’absence de pics d’amplicone sonore.<ol>
<li>Inclure des contrôles négatifs pour le QRT-PCR en effectuant qPCR avec l’ARN comme un modèle sans transcriptase inverse pour servir de contrôle pour la contamination potentielle de l’ADN plasmide et qPCR sans cDNA ajouté au mélange qPCR pour assurer le manque de dimers apprêt ou Contaminants.</li>
		<li>La concentration optimale d’ADNC, l’efficacité et la concentration d’apprêt doivent être optimisées selon le GOI par un essai standard de courbe. Pour ce faire, effectuer une dilution en série à l’aide de l’ADP à partir de cellules non traitées (cultivée sans doxycycline). La courbe standard est générée par tracer les valeurs Cq par rapport au journal du facteur de dilution de l’ADN, et l’efficacité d’amplification (E) est calculée en fonction de la pente de la courbe standard à l’aide de la formule suivante : E 10-1/pente REMARQUE : L’efficacité de l’amplification devrait être d’environ 0,9 à 1,05. Sinon, les amorces doivent être redessinées.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyser les données qPCR à l’aide de la méthode comparative Cq en normalisant les valeurs d’expression du GOI à l’expression de tTA-Ad pour obtenir les niveaux d’expression relatifs de l’IER et pour signaler son expression en pourcentage de l’expression de l’ARN dans les cellules du même animal au point de départ (t - 0) (figure 4).</li>
	<li>La demi-vie est déterminée à partir de la constante de taux (K) de la courbe de dégradation de l’ARNm GOI en utilisant l’équation suivante : t1/2 ln 2/K.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Le faible taux de transfection des cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire a été une limitation sérieuse pour l’utilisation du système Tet-Off pour évaluer la stabilité de l’ARNm dans ces cellules. Cependant, cette limitation a été surmontée par l’électroporation de pipette, permettant une efficacité de transfection de 25-30%(figure 1 et figure 3)26.
La mesure de la stabilité de transcription...

Plusieurs techniques ont été développées pour déterminer la demi-vie des ARNm. La technique de désintégration de la chasse au pouls, qui utilise des ARNm étiquetés, permet l’évaluation simultanée d’un grand bassin d’ARNm avec une perturbation cellulaire minimale. Cependant, cette approche ne permet pas une estimation directe de la demi-vie d’une transcription génétique unique et ne peut pas être mise en œuvre pour étudier la modulation posttranscriptionnelle d’un ARNm suivant la stimulation avec des facteurs de croissance, ROS, alarmines, ou inflammation1.
L’utilisation d’inhibiteurs de transcription, tels que l’actinomycine D et l’amanitine, est une méthode relativement simple pour mesurer la cinétique de dégradation de l’ARNm au fil du temps. L’un des principaux avantages de cette approche par rapport à celui des techniques précédentes (c.-à-d. la chasse au pouls) repose sur la capacité d’estimer directement la demi-vie d’une transcription donnée et de comparer comment différents traitements pourraient affecter sa cinétique de dégradation. Cependant, l’impact délétère significatif des inhibiteurs de transcription sur la physiologie cellulaire représente un inconvénient majeur de l’approche2. En effet, l’inhibition de l’ensemble du transcriptome cellulaire avec ces médicaments a l’effet secondaire négatif de perturbing la synthèse des éléments clés impliqués dans la stabilité de l’ARNm, tels que les microARN (miRNAs), ainsi que l’expression et la synthèse des protéines liant l’ARN, qui sont importants pour la dégradation et la stabilité de l’ARNm. La perturbation sévère de la transcription de gène par ces drogues pourrait donc modifier artefactually les courbes de dégradation des transcriptions.
Le système d’induction du promoteur représente une troisième approche pour mesurer la demi-vie d’un ARNm spécifique. Cette méthode mesure la dégradation d’un ARNm spécifique de la même manière que les méthodes qui utilisent des inhibiteurs de transcription. Deux types de systèmes d’induction sont fréquemment utilisés : le promoteur c-fos induit par le sérum3 et le système inductible Tet-Off4. Avec le système c-fos, l’utilisation d’inhibiteurs de transcription qui peuvent être toxiques pour la cellule n’est pas nécessaire. Cependant, cette méthode nécessite la synchronisation du cycle cellulaire, ce qui empêche l’évaluation de la stabilité réelle d’une transcription pendant l’interphase5. En revanche, le système Tet-Off permet l’expression forte du gène d’intérêt (GOI) sous le contrôle d’un promoteur synthétique tétracycline réglementé. Ce système nécessite la présence de deux éléments qui doivent être cotransfectés dans la cellule pour être fonctionnel. Le premier plasmide (pTet-Off) exprime la protéine réglementaire tTA-Adv, un facteur hybride de transcription synthétique composé du répresseur procaryotique TetR (d’Escherichia coli) fusionné à trois domaines de transactivation de transcription de la protéine virale HSV VP16. Le GOI est cloné dans le plasmide pTRE-Tight sous le contrôle d’un promoteur synthétique (PTight), comprenant la séquence minimale du promoteur de cytomégalovirus (CMV) fusionné à sept répétitions de la séquence de l’opérateur tetO. La transcription du gène en aval de PTight dépend de l’interaction de TetR avec le tetO. En présence de tétracycline ou de son dérivé, doxycycline, le répresseur TetR perd son affinité pour l’opérateur tetO, conduisant à une cessation de la transcription4. Les caractéristiques du système Tet-Off en font un modèle idéal pour l’étude de l’expression spécifique de l’ARNm dans les cellules eucaryotes tout en évitant les effets pléiotropic potentiels qui sont secondaires à l’absence de séquences réglementaires procaryotes dans la cellule eucaryote6. Habituellement, les lignes cellulaires Tet-Off doublement stables (HEK 293, HeLa et PC12) sont utilisées avec ce système pour intégrer des copies des plasmides de régulateur et de réponse pour un accès pratique à l’expression génique contrôlable7,8,9.
Plusieurs modèles de cellules épithéliales alvéolaires en culture ont été utilisés pour étudier la biologie cellulaire et moléculaire de l’épithélium alvéolaire. Pendant des années, les chercheurs ont largement utilisé les cellules primaires humaines ou rongrices10,11 ainsi que des lignées cellulaires immortalisées telles que les cellules humaines A549 ou rat RLE-6TN12,13. Bien qu’elles soient généralement moins prolifératives et plus difficiles à culture et à transfecter, les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire demeurent l’étalon-or pour l’étude de la fonction et du dysfonctionnement de l’épithélium alvéolaire dans des conditions physiologiques et pathologiques. En effet, les lignées cellulaires immortalisées telles que les cellules A549 ne présentent pas les caractéristiques complexes et les phénotypes des cellules primaires, tandis que les cellules épithéliales alvéolaires de la culture primaire récapitulent les principales propriétés de l’épithélium alvéolaire, en particulier la capacité de former une barrière polarisée et serrée14,15. Malheureusement, ces cellules sont très résistantes aux techniques de transfection conventionnelles, telles que celles utilisant des liposomes, ce qui rend très difficile l’utilisation d’un système induit par un promoteur comme le Tet-Off.
La modulation posttranscriptionnelle des ARNm est l’une des méthodes les plus efficaces pour moduler rapidement l’expression génique d’une transcription16. La région non traduite de l’ARNM 3 (3' UTR) joue un rôle important dans ce mécanisme. Il a été démontré que, contrairement à l’UTR de 5', il existe une corrélation exponentielle entre la longueur de l’UTR de 3' et les complexités cellulaires et morphologiques d’un organisme. Cette corrélation suggère que l’UTR 3', comme les régions de codage de l’ARNm, a été soumis à la sélection naturelle pour permettre une modulation posttranscriptionnelle de plus en plus complexe tout au long de l’évolution17. L’UTR 3' contient plusieurs sites de liaison pour les protéines et les miARN qui affectent la stabilité et la traduction de la transcription.
Dans le présent travail, nous avons développé un outil pour étudier le rôle des domaines hautement conservés dans les 3' UTR d’un GOI pour le contrôle de la stabilité des transcriptions. Nous nous sommes concentrés sur le canal épithélial de sodium, sous-unité alpha (ENaC), qui joue un rôle clé dans la physiologie épithéliale alvéolaire18. Les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire ont été avec succès transitoirement transagères avec les deux composants du système Tet-Off, qui permet l’étude du rôle de l’UTR 3' dans la stabilité de l’ARNm avec un système qui affecte de façon minimale la physiologie cellulaire et le métabolisme par rapport à l’utilisation des inhibiteurs de transcription avec d’autres protocoles. Une stratégie de clonage a été développée pour différencier l’expression du GOI de celle du gène endogène à l’aide d’une épitope non endogènement exprimée (V5). La réponse et les plasmides régulateurs ont ensuite été transférés dans les cellules épithéliales alvéolaires utilisant une technique d’électroporation de pipette. Par la suite, l’expression de la transcription a été mesurée en incuber les cellules avec la doxycycline à différents intervalles de temps. La demi-vie de la transcription a été évaluée par RT-qPCR avec une méthode modifiée de Cq utilisant le produit transfected de tTA-Ad mRNA pour la normalisation. Grâce à notre protocole, nous offrons un moyen pratique d’étudier plus en détail la modulation posttranscriptionnelle d’une transcription dans différentes conditions et de définir plus en détail l’implication des régions non traduites.

<table><tbody><tr><td>Actinomycine D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1593</td><td></td></tr><tr><td>Bright-LineHemacytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme - Biologie moléculaire grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>ClaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0197S</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>DM IL LED Microscope inversé avec contraste de phase</td><td></td><td></td> Leica-DNase <td></td></tr><tr><td>I, Invitrogen</td><td></td><td>18068015</td><td></td></tr><tr><td>Hyclate de Doxycycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate (D-PBS), sans calcium ni magnésium</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol - Biologie moléculaire grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Excella E25 ConsoleIncubateurAgitateur</td><td>Eppendorf</td><td>1220G76</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7,3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51026420</td><td></td></tr><tr><td>iScript Kit de synthèse d’ADNc</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol - Biologie moléculaire grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon avec gélose (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides dePseudomonas aeruginosa10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9143</td><td></td></tr><tr><td>MEM, poudre</td><td>Gibco</td><td>61100103</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>Applied Biosystems</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>Enceintes de sécurité biologique MSC-Advantage Classe II</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51025413</td> Système d’électrophorèse <td></td></tr><tr><td>Mupid-exU</td><td>Takara Bio</td><td>AD140</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Système de transfection au néon 10 & micro ; L Kit</td><td>Invitrogen</td><td>MPK1025</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System Starter Pack</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td></td></tr><tr><td>One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C854003</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3 vecteur</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V790-20</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3-EGFP plasmide</td><td>Addgene</td><td>13031</td><td></td></tr><tr><td>PlatinumTaqDNA Polymérase Haute Fidélité</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>pTet-Off Vecteur avancé</td><td>Takara Bio</td><td>631070</td><td></td></tr><tr><td>vecteur pTRE-Tight</td><td>Takara Bio</td><td>631059</td><td></td></tr><tr><td>Cellules épithéliales alvéolaires purifiées</td> n.a.n.a.QIAEX <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>II Kit d’extraction de gel</td><td>QIAGEN</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep</td><td>Kit QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 et 7 Flex Logiciel du système de PCR en temps réel</td><td>Applied Biosystems</td><td>n.a.QuantStudio</td><td></td></tr> <tr><td>6 Flex Système de PCR en temps réel, 96-well Fast</td><td>Applied Biosystems</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>Rat recombinant TNF-alpha Protein</td><td>R& ampère; D Systems</td><td>510-RT-010</td><td></td></tr><tr><td>Septra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2487</td><td></td></tr><tr><td>Crevette Phosphatase alcaline (rSAP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725270</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV Transcriptase inverse</td><td>Invitrogen</td><td>18090010</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN Ligase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Système Tet Approuvé FBS</td><td>Takara Bio</td><td>631367</td><td></td></tr><tr><td>Tobramycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Eau d’Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td>UltraPure</tr><tr><td>, biologie moléculaire Grade</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>809-115-EL</td><td></td></tr></tbody></table>

système efficace d’expression plasmide contrôlée par transcription pour l’étude de la stabilité des transcriptions de l’arnm dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

L’étude de la réglementation posttranscriptionnelle est fondamentale pour comprendre la modulation d’un ARN messager donné (ARNM) et son impact sur l’homéostasie cellulaire et le métabolisme. En effet, les fluctuations de l’expression de transcription pourraient modifier l’efficacité de la traduction et, en fin de compte, l’activité cellulaire d’une transcription. Plusieurs approches expérimentales ont été développées pour étudier la demi-vie de l’ARNm bien que certaines de ces méthodes aient des limites qui empêchent l’étude appropriée de la modulation posttranscriptionale. Un système d’induction promoteur peut exprimer un gène d’intérêt sous le contrôle d’un promoteur synthétique tétracycline.regulated. Cette méthode permet l’estimation de demi-vie d’un ARNm donné dans n’importe quelle condition expérimentale sans troubler l’homéostasie cellulaire. Un inconvénient majeur de cette méthode est la nécessité de transfecter les cellules, ce qui limite l’utilisation de cette technique dans les cellules primaires isolées qui sont très résistantes aux techniques de transfection conventionnelles. Les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire ont été largement utilisées pour étudier la biologie cellulaire et moléculaire de l’épithélium alvéolaire. Les caractéristiques uniques et le phénotype des cellules alvéolaires primaires font qu’il est essentiel d’étudier les modulations posttranscriptionnelles des gènes d’intérêt dans ces cellules. Par conséquent, notre objectif était de développer un nouvel outil pour étudier les modulations posttranscriptionnelles des ARNm d’intérêt pour les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire. Nous avons conçu un protocole transitoire rapide et efficace de transfection pour insérer un système d’expression plasmide contrôlé par transcription dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires. Cette stratégie de clonage, utilisant une épitope virale pour marquer la construction, permet la discrimination facile de l’expression de construction de celle des ARNm endogènes. À l’aide d’une méthode modifiée du cycle de quantification (Cq), l’expression de la transcription peut ensuite être quantifiée à différents intervalles de temps pour mesurer sa demi-vie. Nos données démontrent l’efficacité de cette nouvelle approche en étudiant la régulation posttranscriptionnelle dans diverses conditions pathophysiologiques dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires.

Ce protocole a été utilisé avec succès pour générer un système d’expression plasmide transcriptionnellement contrôlé Tet-Off pour évaluer l’importance de différentes parties de l’UTR de l’ENaC 3 dans la modulation de la stabilité de transcription dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires.
La première étape de la mise en œuvre de ce système a été d’établir une technique de transfection rapide, facile et efficace pour l...

Ici, nous présentons un outil qui peut être employé pour étudier la modulation posttranscriptionale d’une transcription dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires en utilisant un système inductible d’expression couplé à une technique d’électroporation de pipette.

Système efficace d’expression plasmide contrôlée par transcription pour l’étude de la stabilité des transcriptions de l’ARNm dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

Ainsi notre modèle permet l’étude de la modulation post-transcriptionnelle d’une transcription spécifique dans les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire et leurs conditions physiologiques et pathophysiologiques. Ainsi, la transfection transitoire des cellules épithéliales alvéolaires primaires a un effet minimal sur la physiologie cellulaire et le métabolisme, ce qui pose un avantage évident sur les protocoles classiques utilisant des inhibiteurs de transcription. Pour la génération d’un plasmide de réponse exprimant un gène d’intérêt, la séquence du gène et les multiples sites de clonage du vecteur inductible doivent être analysés pour identifier les séquences de reconnaissance dans les multiples sites de clonage qui ne sont pas présents à l’intérieur du gène.Utilisant la polymése de taq de haute fidélité et les techniques standard de PCR de chevauchement, flanquent le gène d’intérêt avec deux emplacements choisis de reconnaissance d’enzyme de restriction utilisant des amorces de concepteur. Une séquence de codage de l’épitope V5 en amont du gène d’intérêt doit être incluse pour distinguer l’expression du gène transfecté de l’expression endogène. Les mutants peuvent être générés par suppression séquentielle pour étudier les effets de différentes trois régions premières non traduites sur la stabilité de l’ARNm du gène à l’aide d’amorces inversées codant un site de polyadenylation qui supprime progressivement les trois extrémités principales de la région non traduite.En fin de compte, l’insertion du gène d’intérêt peut être confirmée par l’analyse des restrictions. L’orientation génétique et l’absence de mutations potentiellement introduites pendant le rtPCR peuvent être confirmées par séquençage. Pour la transfection des cellules épithéliales alvéolaires primaires de poumon de rat deux, ensemencer les cellules à une fois 10 aux sixièmes cellules par centimètre carré dans les plats de Petri de 100 millimètres en présence du milieu essentiel minimum complet.Culture pendant 24 heures à 37 degrés Celsius en 5% de dioxyde de carbone avec humidité. Le lendemain, ajouter 500 microlitres de milieu complet sans antibiotique à chaque puits d’une nouvelle plaque de 12 puits et préchauffer la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Au cours de cette incubation, ajouter un microgramme du plasmide de réponse et un microgramme de vecteur réglementaire à un tube de 1,5 millilitre par puits.Lavez les cellules épithéliales alvéolaires avec 10 millilitres par puits de 37 degrés Celsius PBS sans calcium ni magnésium et traitez les cellules avec cinq millilitres par puits de 37 degrés Celsius 0,05% trypsine pendant deux à quatre minutes dans l’incubateur de culture cellulaire. Lorsque les cellules se sont détachées, neutraliser la trypsine avec 10 millilitres par puits de milieu complet sans antibiotique et de recueillir les cellules dans un nouveau tube de 50 millilitres. Laver le plat avec quatre millilitres de milieu frais pour recueillir les cellules restantes et sédimenter les cellules par centrifugation.Resuspendez la pastille dans un millilitre de PBS pour compter et centrifuger les cellules à nouveau. Resuspendez la pastille à une densité de quatre fois 10 à la septième cellule par millilitre de tampon de resuspension et ajoutez quatre fois 10 aux cinquièmes cellules à chaque tube de plasmide et de vecteur avec mélange doux. Placez un tube dans le dispositif d’électroporation et remplissez le tube de 3,5 millilitres de tampon électrolytique.Appuyez entièrement sur le piston pour insérer une pointe d’électrode plaquée or dans une pipette et mélanger délicatement le contenu du tube. Aspirez soigneusement les cellules avec une pipette et insérez la pipette dans la station d’électroporation jusqu’à ce qu’un bruit de cliquet soit entendu. Sélectionnez le protocole d’électroporation approprié pour les cellules épithéliales alvéolaires et appuyez sur Démarrer sur l’écran tactile.Immédiatement après la transfection, retirer la pipette et transférer les cellules dans un puits de la plaque préchauffée de 12 puits. Lorsque toutes les cellules ont été électroporées et plaquées, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire, en remplaçant le supernatant dans chaque puits par un milieu complet avec des antibiotiques après deux jours. Le succès de la transfection peut être confirmé par l’expression de l’EGFP observée par microscopie de fluorescence ou cytométrie d’écoulement à l’aide d’un vecteur de contrôle.Pour inhiber la transcription du gène d’intérêt, 72 heures post-transfection remplacent le supernatant par un millilitre par puits de milieu complet complété par un microgramme par millilitre d’adoxycycline fraîchement préparée. Pour évaluer la demi-vie de l’ARNm du gène d’intérêt, retournez la plaque à l’incubateur de culture cellulaire de 15 minutes à six heures. Laver un puits avec un millilitre de PBS glacé avant de lyser les cellules avec 500 microlitres de tampon de lyse à partir d’un kit d’extraction d’ARN chloroforme phénoforme disponible dans le commerce et secouant doucement à chaque point de temps expérimental.Ensuite, isolez l’ARN selon les instructions du kit et déterminez le rendement et la pureté de l’ARN par spectrophotométrie à 230, 260 et 280 nanomètres. Pour déterminer la stabilité de l’ARN isolé, traitez d’abord un microgramme de l’ARN total de chaque échantillon avec RNase libre DNase un pour enlever toutes les traces d’ADN plasmide. Utilisez un kit de synthèse cDNA disponible dans le commerce avec un mélange d’amorce oligo dT et d’amorce aléatoire d’hexomer pour améliorer l’efficacité de transcription inverse pour transcrire l’ARN total épuisé d’ADN en CDNA selon les instructions du fabricant.Ajouter 180 microlitres d’eau de qualité biologie moléculaire aux 20 microlitres du mélange de réaction pour diluer la réaction de l’ADNC à une concentration de cinq nanogrammes par microlitre et diluer immédiatement le mélange d’ADNC avec de l’eau de qualité biologie moléculaire fraîche pour atteindre une concentration de 1,25 nanogramme par microlitre. Combinez cinq microlitres de mélange maître de teinture cyber verte avec 0,1 microlitre d’eau de qualité biologie moléculaire, 0,45 microlitres de 7,5 micromolaires d’amorce avant, 0,45 microlitres de 7,5 micromolaires d’amorce inverse, et quatre microlitres de 1,25 nanogramme par microlitre de cDNA pour obtenir un volume de réaction total de 10 microlitres. Placez les échantillons dans un thermocycleur qPCR et amplifiez le gène d’intérêt de l’étiquette V5 et les amplicons d’avance de transactivateur de tetrocycline utilisant les conditions qPCR comme indiqué et générez une courbe de fusion à haute résolution pour évaluer les températures de fusion spécifiques des amplicons désirés et pour assurer l’absence de pics amplicons sonores.Cette technique d’électroporation pipette facilite un taux d’efficacité de transfection de 25 à 30 %, tel qu’observé par les ratios de cellules EGFP détectés par microscopie de fluorescence et cytométrie d’écoulement. Le traitement des cellules épithéliales alvéolaires avec un microgramme par millilitre de doxycycline n’a aucun impact significatif sur l’expression de l’ARNm alpha endogène d’ENaC à n’importe quel moment pendant la période de traitement. À l’aide d’un système d’expression plasmide contrôlé transcriptionnellement tel que démontré, le signal V5 alpha ENaC pourrait être normalisé selon le signal avancé du transactivateur tétracycline pour déterminer l’efficacité de la transfection à l’aide de la méthode du cycle de quantification du double delta.La demi-vie de l’ARNm alpha ENaC est jusqu’à sept fois plus courte en présence de la tétracycline hors système qu’en présence d’actinomycine D, confirmant que l’actinomycine D conduit à une stabilisation de l’ARN mnaC alpha artefactual. En outre, le cyclohexamide et le traitement alpha de facteur de nécrose de tumeur ont sensiblement diminué la stabilité de la transcription tandis que les lipopolysaccharides ne font pas. Des changements significatifs dans la modulation de la stabilité de l’ARNm V5 alpha ENaC peuvent être induits en fonction des régions supprimées et incluses des trois principales régions non traduites.En outre, la surexction de protéines liant l’ARN spécifique diminue la stabilité de l’ARNm 5-alpha ENaC par rapport à la transfection avec un plasmide vide pcDNA trois. Cet outil sera utile pour interroger de nouvelles idées sur la régulation post-transcriptionnelle des gènes clés impliqués dans la fonction de l’épithélium alvéolaire et leurs conditions physiologiques ou pathologiques.

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L'ARN polymérase II cinétiques transcriptionnelles sont mesurés sur des gènes spécifiques dans les cellules vivantes. ARNm transcrit à partir du gène d'intérêt sont marqués par fluorescence et de l'utilisation de récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) la cinétique in vivo de l'élongation de la transcription sont obtenues.

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Des souris transgéniques ou des vecteurs viraux ont été utilisés pour augmenter l'expression des protéines dans le poumon. Cependant, ces techniques sont fastidieux, difficile techniquement et avoir des effets hors-cible qui peut fausser les résultats. Notre protocole de transfection de la protéine utilise un réactif de transfection à base de lipides et une microsprayer ultrafine pour fournir uniformément protéine active à des cellules de poumon.

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Étudier les canaux ioniques à travers un système exprimant de manière hétérologue est devenue une technique de base dans la recherche biomédicale. Dans ce manuscrit, nous présentons une méthode efficace de temps pour obtenir l'expression du canal ionique étroitement contrôlé en effectuant une transfection transitoire sous le contrôle d'un promoteur inductible.

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Système efficace d’expression plasmide contrôlée par transcription pour l’étude de la stabilité des transcriptions de l’ARNm dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires (Vidéo) | JoVE Journal

Système efficace d’expression plasmide contrôlée par transcription pour l’étude de la stabilité des transcriptions de l’ARNm dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires

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