Système efficace d’expression plasmide contrôlée par transcription pour l’étude de la stabilité des transcriptions de l’ARNm dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires

Ainsi notre modèle permet l’étude de la modulation post-transcriptionnelle d’une transcription spécifique dans les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire et leurs conditions physiologiques et pathophysiologiques. Ainsi, la transfection transitoire des cellules épithéliales alvéolaires primaires a un effet minimal sur la physiologie cellulaire et le métabolisme, ce qui pose un avantage évident sur les protocoles classiques utilisant des inhibiteurs de transcription. Pour la génération d’un plasmide de réponse exprimant un gène d’intérêt, la séquence du gène et les multiples sites de clonage du vecteur inductible doivent être analysés pour identifier les séquences de reconnaissance dans les multiples sites de clonage qui ne sont pas présents à l’intérieur du gène.

Utilisant la polymése de taq de haute fidélité et les techniques standard de PCR de chevauchement, flanquent le gène d’intérêt avec deux emplacements choisis de reconnaissance d’enzyme de restriction utilisant des amorces de concepteur. Une séquence de codage de l’épitope V5 en amont du gène d’intérêt doit être incluse pour distinguer l’expression du gène transfecté de l’expression endogène. Les mutants peuvent être générés par suppression séquentielle pour étudier les effets de différentes trois régions premières non traduites sur la stabilité de l’ARNm du gène à l’aide d’amorces inversées codant un site de polyadenylation qui supprime progressivement les trois extrémités principales de la région non traduite.

En fin de compte, l’insertion du gène d’intérêt peut être confirmée par l’analyse des restrictions. L’orientation génétique et l’absence de mutations potentiellement introduites pendant le rtPCR peuvent être confirmées par séquençage. Pour la transfection des cellules épithéliales alvéolaires primaires de poumon de rat deux, ensemencer les cellules à une fois 10 aux sixièmes cellules par centimètre carré dans les plats de Petri de 100 millimètres en présence du milieu essentiel minimum complet.

Culture pendant 24 heures à 37 degrés Celsius en 5% de dioxyde de carbone avec humidité. Le lendemain, ajouter 500 microlitres de milieu complet sans antibiotique à chaque puits d’une nouvelle plaque de 12 puits et préchauffer la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Au cours de cette incubation, ajouter un microgramme du plasmide de réponse et un microgramme de vecteur réglementaire à un tube de 1,5 millilitre par puits.

Lavez les cellules épithéliales alvéolaires avec 10 millilitres par puits de 37 degrés Celsius PBS sans calcium ni magnésium et traitez les cellules avec cinq millilitres par puits de 37 degrés Celsius 0,05% trypsine pendant deux à quatre minutes dans l’incubateur de culture cellulaire. Lorsque les cellules se sont détachées, neutraliser la trypsine avec 10 millilitres par puits de milieu complet sans antibiotique et de recueillir les cellules dans un nouveau tube de 50 millilitres. Laver le plat avec quatre millilitres de milieu frais pour recueillir les cellules restantes et sédimenter les cellules par centrifugation.

Resuspendez la pastille dans un millilitre de PBS pour compter et centrifuger les cellules à nouveau. Resuspendez la pastille à une densité de quatre fois 10 à la septième cellule par millilitre de tampon de resuspension et ajoutez quatre fois 10 aux cinquièmes cellules à chaque tube de plasmide et de vecteur avec mélange doux. Placez un tube dans le dispositif d’électroporation et remplissez le tube de 3,5 millilitres de tampon électrolytique.

Appuyez entièrement sur le piston pour insérer une pointe d’électrode plaquée or dans une pipette et mélanger délicatement le contenu du tube. Aspirez soigneusement les cellules avec une pipette et insérez la pipette dans la station d’électroporation jusqu’à ce qu’un bruit de cliquet soit entendu. Sélectionnez le protocole d’électroporation approprié pour les cellules épithéliales alvéolaires et appuyez sur Démarrer sur l’écran tactile.

Immédiatement après la transfection, retirer la pipette et transférer les cellules dans un puits de la plaque préchauffée de 12 puits. Lorsque toutes les cellules ont été électroporées et plaquées, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire, en remplaçant le supernatant dans chaque puits par un milieu complet avec des antibiotiques après deux jours. Le succès de la transfection peut être confirmé par l’expression de l’EGFP observée par microscopie de fluorescence ou cytométrie d’écoulement à l’aide d’un vecteur de contrôle.

Pour inhiber la transcription du gène d’intérêt, 72 heures post-transfection remplacent le supernatant par un millilitre par puits de milieu complet complété par un microgramme par millilitre d’adoxycycline fraîchement préparée. Pour évaluer la demi-vie de l’ARNm du gène d’intérêt, retournez la plaque à l’incubateur de culture cellulaire de 15 minutes à six heures. Laver un puits avec un millilitre de PBS glacé avant de lyser les cellules avec 500 microlitres de tampon de lyse à partir d’un kit d’extraction d’ARN chloroforme phénoforme disponible dans le commerce et secouant doucement à chaque point de temps expérimental.

Ensuite, isolez l’ARN selon les instructions du kit et déterminez le rendement et la pureté de l’ARN par spectrophotométrie à 230, 260 et 280 nanomètres. Pour déterminer la stabilité de l’ARN isolé, traitez d’abord un microgramme de l’ARN total de chaque échantillon avec RNase libre DNase un pour enlever toutes les traces d’ADN plasmide. Utilisez un kit de synthèse cDNA disponible dans le commerce avec un mélange d’amorce oligo dT et d’amorce aléatoire d’hexomer pour améliorer l’efficacité de transcription inverse pour transcrire l’ARN total épuisé d’ADN en CDNA selon les instructions du fabricant.

Ajouter 180 microlitres d’eau de qualité biologie moléculaire aux 20 microlitres du mélange de réaction pour diluer la réaction de l’ADNC à une concentration de cinq nanogrammes par microlitre et diluer immédiatement le mélange d’ADNC avec de l’eau de qualité biologie moléculaire fraîche pour atteindre une concentration de 1,25 nanogramme par microlitre. Combinez cinq microlitres de mélange maître de teinture cyber verte avec 0,1 microlitre d’eau de qualité biologie moléculaire, 0,45 microlitres de 7,5 micromolaires d’amorce avant, 0,45 microlitres de 7,5 micromolaires d’amorce inverse, et quatre microlitres de 1,25 nanogramme par microlitre de cDNA pour obtenir un volume de réaction total de 10 microlitres. Placez les échantillons dans un thermocycleur qPCR et amplifiez le gène d’intérêt de l’étiquette V5 et les amplicons d’avance de transactivateur de tetrocycline utilisant les conditions qPCR comme indiqué et générez une courbe de fusion à haute résolution pour évaluer les températures de fusion spécifiques des amplicons désirés et pour assurer l’absence de pics amplicons sonores.

Cette technique d’électroporation pipette facilite un taux d’efficacité de transfection de 25 à 30 %, tel qu’observé par les ratios de cellules EGFP détectés par microscopie de fluorescence et cytométrie d’écoulement. Le traitement des cellules épithéliales alvéolaires avec un microgramme par millilitre de doxycycline n’a aucun impact significatif sur l’expression de l’ARNm alpha endogène d’ENaC à n’importe quel moment pendant la période de traitement. À l’aide d’un système d’expression plasmide contrôlé transcriptionnellement tel que démontré, le signal V5 alpha ENaC pourrait être normalisé selon le signal avancé du transactivateur tétracycline pour déterminer l’efficacité de la transfection à l’aide de la méthode du cycle de quantification du double delta.

La demi-vie de l’ARNm alpha ENaC est jusqu’à sept fois plus courte en présence de la tétracycline hors système qu’en présence d’actinomycine D, confirmant que l’actinomycine D conduit à une stabilisation de l’ARN mnaC alpha artefactual. En outre, le cyclohexamide et le traitement alpha de facteur de nécrose de tumeur ont sensiblement diminué la stabilité de la transcription tandis que les lipopolysaccharides ne font pas. Des changements significatifs dans la modulation de la stabilité de l’ARNm V5 alpha ENaC peuvent être induits en fonction des régions supprimées et incluses des trois principales régions non traduites.

En outre, la surexction de protéines liant l’ARN spécifique diminue la stabilité de l’ARNm 5-alpha ENaC par rapport à la transfection avec un plasmide vide pcDNA trois. Cet outil sera utile pour interroger de nouvelles idées sur la régulation post-transcriptionnelle des gènes clés impliqués dans la fonction de l’épithélium alvéolaire et leurs conditions physiologiques ou pathologiques.