Name: Production de particules pseudotypées de grippe infectieuse à haut régime avec des glycoprotéines denveloppe provenant de virus H5N1 hautement pathogènes et de virus H7N9 aviaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Découvrez la production de particules pseudotypées infectieuses à haut titre avec des glycoprotéines d'enveloppe de virus H5N1 et H7N9. Cette méthode permet d'étudier l'infectivité virale en toute sécurité en laboratoire BSL-2.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par des subventions du Zhejiang Provincial Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science et Projet clé technologique (Grant Numbers, 2014Z11) et Projet municipal d'application autonome de Hangzhou de développement social et de recherche scientifique (Grant Numbers, 20191203B134).

1. Jour 1 : Culture cellulaire et ensemencement
<ol><li>Cultiver le rein embryonnaire humain (HEK) 293T/17 cellules dans des plats de 60 mm avec le milieu essentiel modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 100 U/mL pénicilline-streptomycine (DMEM Complete Medium, DCM) dans un 37 c, 5% de dioxyde de carbone (CO 2) (CO2) REMARQUE : Les cellules à faible passage HEK 293T/17 sont recommandées.</li>
	<li>Lavez soigneusement les cellules avec 5 ml de phosphate tamponné salin (PBS) 1x. REMARQUE : La manipulation manuelle des cellules HEK 293T/17 doit être très douce, car elles se détachent facilement.</li>
	<li>Retirez pbS et dissoisez les cellules avec 1 ml de 0,25% trypsin-éthylène diamine tétraacetic acid (EDTA) solution. Placer le plat dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 % pendant 5 min jusqu'à ce que les cellules soient dissociées.</li>
	<li>Désactiver la trypsine en ajoutant 5 ml de DCM. Dispersez les cellules dans une suspension à une seule cellule en faisant monter et descendre plusieurs fois.</li>
	<li>Transférer les suspensions cellulaires dans un tube de centrifugeuse préréfrigéré de 15 ml. Recueillir les cellules par centrifugation à 250 x g pendant 5 min à 4 oC.</li>
	<li>Décante autant que possible du supernatant. Resuspendre la pastille cellulaire avec 6 ml de milieu DCM et compter les cellules. Diluer les cellules à 1 x 106 cellules/mL avec le milieu DCM.</li>
	<li>Ensemencer les cellules dans une plaque de 6 puits avec 1 ml de suspension cellulaire par puits. Tapotez doucement la plaque pour répartir uniformément les cellules. Incuber la plaque toute la nuit (14 à 16 h) dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 %.</li>
</ol>2. Jour 2: Cotransfection à quatre plasmides médiatisé par Lipofection
<ol><li>Vérifiez la morphologie et la densité cellulaires sous un microscope à lumière inversée. Idéalement, les cellules devraient être environ 85% confluent à la transfection. Remplacer le milieu par 1 ml de milieu DMEM sans sérum par puits, puis remettre la plaque dans l'incubateur. REMARQUE : La manipulation manuelle des cellules HEK 293T/17 doit être très douce, car elles se détachent facilement.</li>
	<li>Pour que chaque puits de cellules cultivées soit transfecté, diluer 8 'L du réactif de transfection à un volume de 150 'L avec le milieu de sérum réduit (tube 1). Mélanger délicatement et incuber 5 min à température ambiante (RT, environ 20 oC). REMARQUE : Pour chaque échantillon de transfection, préparez deux tubes microcentrifuges de 1,5 ml, numérotés 1 et 2.</li>
	<li>Dans le tube 2, diluer 2,5 g d'ADN plasmide en 150 l de sérum réduit moyen. REMARQUE : Dans le tube 2, diluer chaque ADN plasmide comme le montre le tableau 1. Un plasmide codant le virus de stomatérite de vésicule (VSV) Glycoprotéine de G (plasmide pLP-VSVG) a été employé comme contrôle positif, parce que VSV peut infecter un large éventail de cellules. Des particules de contrôle négatives qui n'ont pas d'enveloppe grippale glycoprotéines ont été générées à l'aide de plasmides pcDNA-Gag-Pol et pcDNA-GFP.</li>
	<li>Après une incubation de 5 min, combiner l'ADN dilué avec le réactif de transfection dilué. Mélanger délicatement et incuber pendant 15 min à RT.</li>
	<li>Ajoutez le complexe ADN-lipide au puits correspondant contenant les cellules et le milieu sans sérum. Mélanger délicatement en berçant la plaque d'avant en arrière.</li>
	<li>Après l'incubation de 4 à 6 h dans un incubateur de CO2 de 37 oC, 5 %, retirez le milieu et remplacez-le par 2 ml de DMEM. Incuber pendant 36 à 48 h dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 %. REMARQUE : Remplacez-le par un DMEM sans sérum et sans anticorps. Dans ce protocole, deux AP et deux NA peuvent être utilisés pour générer huit types de pps (indiqués dans le tableau 1).</li>
</ol>3. Jour 3: Cellules sensibles Ensemencement
<ol><li>Pour l'assay d'infectiosité, ensemencez chaque type de cellules sensibles à 1 x 104 cellules par puits dans une plaque de 96 puits. REMARQUE : Utilisez deux types de cellules cibles pour effectuer l'étude d'infectiosité dans cet article : une lignée cellulaire humaine dérivée de l'alvéolateur (cellules A549) et les cellules du rein canin Madin-Darby (MDCK). Les cellules MDCK sont largement utilisées dans la recherche sur l'influenza et peuvent être un bon contrôle. Cette étape est flexible. Toutes les autres lignées cellulaires cibles peuvent être utilisées en fonction des exigences de recherche.</li>
	<li>Incuber la plaque toute la nuit (14 à 16 h) dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 %.</li>
</ol>4. Jour 4 : Pseudotyped Viral Particle Collection, Quantification, and Infectivity Testsay
<ol><li>Collecte de particules virales pseudotypées<ol>
<li>Vérifiez la couleur du milieu. Idéalement, il devrait être rose clair ou légèrement orange. Examinez les cellules avec un microscope biologique fluorescent inversé sous 440-460 nm.</li>
		<li>À 36 à 48 h après la transtransfection, récoltez les pps en passant à travers un filtre à membrane de polyvinylide de polyvinylide de 0,45 m (PVDF) pour éliminer les débris cellulaires.</li>
		<li>Diviser les pps en petits volumes aliquots.</li>
		<li>Conserver les pps à -80 oC. REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Cependant, cela n'est pas encouragé, parce que l'infectiosité des pps diminuera fortement après le gel et la décongélation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantification des particules virales pseudotypées<ol>
<li>Transférer 20 l de pps purifiés dans un tube microcentrifuge sans ribonuclage (RNase) de 1,5 ml.</li>
		<li>Ajouter 1 oL de 0,24 U/mL de nucléase de benzonase. Incuber à 37 oC pendant 1 h pour éliminer toute contamination par l'ADN et l'ARN. REMARQUE : L'ARN cible, couramment régulé par cytomégalovirus (CMV)-GFP ARN, est emballé dans les pps et peut éviter d'être dégradé par la nucane de benzonase.</li>
		<li>Congeler l'échantillon à -70 oC pour inactiver la nucane de benzonase.</li>
		<li>Ajouter 2 ll de protéinase K. Incubate à 50 oC pendant 30 min pour digérer les protéines de l'enveloppe et libérer l'ARN CMV-GFP. Inactiver la protéinase K à 100 oC pendant 3 min.</li>
		<li>Quantifier les pps par la transcription inversée quantitative en temps réel (qRT)-PCR avec un kit rt-qPCR de sonde universelle, en utilisant l'amorce avant 5'-AACAAAGCTGGAGCTCGTTTAA-3', l'amorce inverse 5'-GGGTCTCCTCAGAGTGATTGACTAC-3', et la sonde 5'-FAM-CCCCCAAATGAAAGACCCCCGAG-TAM-3', sur un thermocycler PCR en temps réel. Normaliser les pps pour le numéro de copie d'ARN avant l'infectiosité.</li>
	</ol>
</li>
	<li>L'infection est à l'autre<ol>
<li>Diluer chaque type de pps en termes de données qRT-PCR à 4 x 105 copies/mL (p normalisation).</li>
		<li>Ajouter la tosyl-Phenylalanine Chloromethyl-Ketone (TPCK)-trypsine à une concentration finale de 40 g/mL en pps qui abritent H7N9 HA. Incuber à 37 oC pendant 1 h pour former ses sous-unités fonctionnelles HA1 et HA2. REMARQUE: Il n'est pas nécessaire de traiter les pps qui abritent H5 avec TPCK-trypsin, parce qu'ils ont plusieurs résidus d'arginine et de lysine sur le site de clivage HA1-HA2. Ce site de clivage multi-basique peut être clivé par des protéases cellulaires omniprésentes.</li>
		<li>Mélanger les pps normalisés avec le milieu DMEM (sans sérum) à un rapport 1:1 (volume/volume).</li>
		<li>Apportez la plaque contenant des cellules sensibles à l'armoire de biosécurité.</li>
		<li>Aspirer le supernatant et laver les cellules une fois avec 0,1 ml de PBS préchauffé.</li>
		<li>Ajouter 0,1 ml de mélange pps-DMEM à un puits. Tripler les tests d'infectiosité de chaque type de pps à une lignée cellulaire sensible (survu à la figure 2).</li>
		<li>Incuber la plaque de puits de 96 personnes pendant 4 à 6 h dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 %.</li>
		<li>Aspirer le supernatant et remplacer par 0,1 ml de DCM.</li>
		<li>Incuber la plaque de puits 96 pendant 24 à 36 h dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 %.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Jour 5 ou 6: Détection d'infectiosité
<ol><li>Apportez la plaque de puits 96 à l'armoire de biosécurité.</li>
	<li>Aspirer le supernatant et laver les cellules 1x avec 0,2 ml de PBS préchauffé.</li>
	<li>Retirez pbS et dissoisez les cellules avec 0,1 ml de la solution trypsin-EDTA de 0,25%.</li>
	<li>Placer le plat dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 % pendant 3 min jusqu'à ce que les cellules soient dissociées. REMARQUE: Évitez d'incuber pendant plus de 5 min, car cela conduira à l'agglutination cellulaire.</li>
	<li>Désactiver la trypsine en ajoutant 0,4 ml de DCM.</li>
	<li>Dispersez les cellules en suspension monocellulaire en faisant monter et descendre plusieurs fois.</li>
	<li>Transférer les suspensions cellulaires dans un tube de microcentrifuge réfrigéré de 1,5 ml.</li>
	<li>Déterminer les cellules positives des reporters GFP avec fluorescence active de tri cellulaire (FACS). REMARQUE : Pour déterminer le rapport entre les cellules cibles positives et les micro-femmes du GFP, fixez les portes cytométriques d'écoulement à l'aide des échantillons témoins (cellules A549 non traitées ou cellules MDCK), puis comptez les cellules reporteuses-positives gFP de 10 000 cellules par échantillon.</li>
</ol>

<ol><li>Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnipe%2C+DM+%22Fields+Virology+%286th%29%22">Fields Virology (6th)</a>. , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).</li>
<li>White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+mechanisms+of+viral+membrane+fusion+proteins%3A+multiple+variations+on+a+common+theme%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).</li>
<li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-clade+protective+immune+responses+to+influenza+viruses+with+H5N1+HA+and+NA+elicited+by+an+influenza+virus-like+particle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle.</a> PLoS One. 3 (1), 1501(2008).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+pseudotyped+influenza+viral+particles+in+neutralizing+antibody+detection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection.</a> PLoS One. 9 (12), 113629(2014).</li>
<li>Wyatt, R., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+envelope+glycoproteins%3A+fusogens%2C+antigens%2C+and+immunogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens.</a> Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).</li>
<li>Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transmembrane+domains+of+Sindbis+virus+envelope+glycoproteins+induce+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death.</a> Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).</li>
<li>Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV-1+Glycoproteins+Are+Delivered+to+Virus+Assembly+Sites+Through+Dynamin-Dependent+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis.</a> Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).</li>
<li>Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotype+formation+between+enveloped+RNA+and+DNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses.</a> Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).</li>
<li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Control+of+Cellular+Susceptibility+to+Pseudotypes+of+Rous+Sarcoma+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus.</a> Virology. 26, 270-276 (1965).</li>
<li>Steffen, I., Simmons, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotyping+Viral+Vectors+With+Emerging+Virus+Envelope+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins.</a> Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).</li>
<li>Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+hepatitis+C+virus+pseudo-particles+containing+functional+E1-E2+envelope+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes.</a> Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).</li>
<li>Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCV+envelope+protein+function+is+dependent+on+the+peptides+preceding+the+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).</li>
<li>Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+potentially+important+elements+of+the+hepatitis+B+virus+large+envelope+protein+are+dispensable+for+the+infectivity+of+hepatitis+delta+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus.</a> Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).</li>
<li>Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSV-G-pseudotyped+retroviral+packaging+through+adenovirus-mediated+inducible+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).</li>
<li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors%3A+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pseudoparticles+paired+with+hemagglutinin+and+neuraminidase+from+highly+pathogenic+H5N1+influenza+and+avian+influenza+A+%28H7N9%29+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses.</a> Virus Research. 253, 20-27 (2018).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+Pseudotyped+Particles+Pairing+Hemagglutinin+of+Highly+Pathogenic+Avian+Influenza+a+H5N1+Virus+with+Neuraminidases+of+The+2009+Pandemic+H1N1+and+a+Seasonal+H3N2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioterrorism+%26+Biodefense%22%5BJournal%5D)">Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2.</a> Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104(2011).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neuraminidases+from+the+highly+pathogenic+avian+H5N1+and+2009+pandemic+H1N1+influenza+A+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses.</a> PLoS One. 5 (12), 15825(2010).</li>
<li>Nefkens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+pseudotyped+lentiviral+particles%3A+characterization+of+a+new+method+for+avian+H5N1+influenza+sero-diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis.</a> Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+and+neuraminidase+matching+patterns+of+two+influenza+A+virus+strains+related+to+the+1918+and+2009+global+pandemics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oseltamivir+boosts+2009+H1N1+virus+infectivity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).</li>
<li>McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+M2+envelope+protein+augments+avian+influenza+hemagglutinin+pseudotyping+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).</li>
<li>Pan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+mediates+avian+influenza+H5N1+pseudotyped+particle-induced+lung+inflammation+through+NF-kappaB+and+p38+MAPK+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).</li>
<li>Szecsi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+neutralising+antibodies+by+virus-like+particles+harbouring+surface+proteins+from+highly+pathogenic+H5N1+and+H7N1+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses.</a> Virology Journal. 3, 70(2006).</li>
<li>Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+evaluation+of+an+influenza+A+%28H5%29+pseudotyped+lentiviral+particle-based+serological+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay.</a> Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).</li>
<li>Garcia, J. M., Lai, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+influenza+pseudotyped+lentiviral+particles+and+their+use+in+influenza+research+and+diagnosis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Anti-infective+Therapy%22%5BJournal%5D)">Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).</li>
<li>Haynes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza-pseudotyped+Gag+virus-like+particle+vaccines+provide+broad+protection+against+highly+pathogenic+avian+influenza+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge.</a> Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).</li>
<li>Schmeisser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+mammalian+virus-like+particles+from+modified+vaccinia+virus+Ankara+vectors+expressing+influenza+H5N1+hemagglutinin+and+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase.</a> Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).</li>
<li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+%28SARS-CoV%29+S+glycoprotein+and+influenza+matrix+1+efficiently+form+virus-like+particles+%28VLPs%29+that+protect+mice+against+challenge+with+SARS-CoV%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV.</a> Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).</li>
<li>Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Lyssavirus-Neutralizing+Antibodies+Using+Vesicular+Stomatitis+Virus+Pseudotype+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles.</a> Viruses. 8 (9), 254(2016).</li>
<li>Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SARS-CoV+Fusion+Peptide+Forms+an+Extended+Bipartite+Fusion+Platform+that+Perturbs+Membrane+Order+in+a+Calcium-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).</li>
<li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus+infection+is+inhibited+by+griffithsin%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin.</a> Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).</li>
<li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Pseudotyped+Particles+to+Study+Highly+Pathogenic+Coronaviruses+in+a+Biosafety+Level+2+Setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59010(2019).</li>
<li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+leukemia+virus+pseudotypes+of+La+Crosse+and+Hantaan+Bunyaviruses%3A+a+system+for+analysis+of+cell+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism.</a> Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).</li>
<li>Wool-Lewis, R. J., Bates, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Ebola+virus+entry+by+using+pseudotyped+viruses%3A+identification+of+receptor-deficient+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines.</a> Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).</li>
<li>Chen, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+design+of+more+effective+avian+replication-incompetent+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors.</a> Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).</li>
<li>Kaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+generation+of+pseudotype-based+serum+neutralization+assay+for+Nipah+virus+antibodies%3A+sensitive+and+high-throughput+analysis+utilizing+secreted+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase.</a> Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).</li>
<li>Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+modeling+of+influenza+A+virus+replication+in+cell+cultures+predicts+infection+dynamics+for+highly+different+infection+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions.</a> PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819(2019).</li>
<li>Petiot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+viruses+production%3A+Evaluation+of+a+novel+avian+cell+line+DuckCelt%28R%29-T17%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17.</a> Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour produire des particules pseudotypées de virus de grippe (pp) dans un arrangement de BSL-2. Le plasmique du plasmique pcDNA-GFP est incorporé dans les pps et peut être utilisé pour quantifier les pps par FACS dans un test d'infectiosité. Nous avons choisi deux types de lignées cellulaires sensibles parce qu'elles sont largement utilisées dans la recherche sur l'influenza. Les cellules MDCK fourniraient un bon contrôle aux cellules humaines immortalisées variables utilisée...

La mission d'une particule virale est de transporter son génome d'une cellule hôte infectée à une cellule hôte non infectée et de le livrer dans le cytoplasme ou le noyau sous une forme de réplication-compétente1. Ce processus est d'abord déclenché par la liaison aux récepteurs cellulaires hôtes, suivie par la fusion de virion et de membranes cellulaires. Pour les virus enveloppés, comme les virus grippaux, les glycoprotéines à pointe sont responsables de la liaison des récepteurs et de la fusion1,2. Les glycoprotéines d'enveloppe virale (par exemple, pyrogènes, antigènes), sont impliquées dans beaucoup de propriétés et d'événements importants, tels que l'initiation de cycle de vie de virus (liaison et fusion), la pathogénie virale, l'immunogénicité, l'apoptose de cellules d'hôte et le tropisme cellulaire, la voie endocytique cellulaire, aussi bien que la transmission et le reassortiment interspécifiques1,3,4,5,6,7. La recherche sur les glycoprotéines d'enveloppe virale nous aidera à comprendre beaucoup d'aspects du processus d'infection virale. Les particules virales pseudotypées (pp), aussi appelées pseudovirions ou pseudoparticules, peuvent être générées par une technique de pseudotypage8,9,10. Cette technologie a été utilisée pour développer des particules pseudotypées de nombreux virus, y compris l'hépatite C11,12, l'hépatite B13, virus de la stomatérite vésiculaire (VSV)14,15, et le virus de la grippe16,17,18,19. Cette technologie est basée sur la protéine Gag-Pol des lentivirus ou d'autres rétrovirus.
Les particules virales pseudotypées peuvent être obtenues à l'aide d'un système à trois plasmides en cotransfectant une enveloppe virale d'expression de glycoprotéine plasmide, un plasmide d'emballage rétroviral manquant le gène env d'enveloppe, et un plasmide de journaliste séparé dans les cellules de producteur pp. Le rétrovirus est assemblé par sa protéine Gag, et il bourgeonne à partir d'une membrane cellulaire infectée qui exprime la protéine enveloppe virale1. Par conséquent, il est possible d'obtenir des pps de grippe de haute titer utilisant la protéine de Gag rétrovirus pour produire des bourgeons sur une membrane cellulaire exprimant l'influenza HA et NA. Dans nos études précédentes, les H/NA dans toutes les combinaisons étaient fonctionnels et capables d'exécuter leurs fonctions correspondantes dans le cycle de vie viral16,17,18,20,21. Ces pps sont employés pour étudier des caractéristiques biologiques de grippe, y compris l'hémagglutination, l'activité de neuraminidase, le tropisme liant de HA-récepteur, et l'infectiosité. Étant donné que l'HA et l'AN sont deux protéines fonctionnelles de surface importantes dans le cycle de vie viral, les H et les NA dépareillés dérivés de différentes souches de la grippe peuvent en partie démontrer le réassortiment entre eux. Ici, nous produisons huit types de pps de grippe en combinant deux HAs et deux NA (dérivé de la souche H5N1 de HPAI et de la tache H7N9), utilisant un système de pseudotypage à trois plasmides. Ces huit types de pps comprennent deux pps indigènes, H5N1pp, H7N9pp; deux pps dépareillés, (H5-N9)pp, (H7-N1)pp; et quatre pps hébergeant seulement une seule glycoprotéine (HA ou NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Les études sur le virus de l'influenza, telles que H5N1 et H7N9, sont limitées par des exigences de biosécurité. Toutes les études sur les souches du virus de l'influenza sauvage doivent être effectuées dans un laboratoire de biosécurité de niveau 3 (BSL-3). La technologie des particules virales pseudotypées peut être utilisée pour emballer une virion artificielle dans un cadre de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Par conséquent, les pps représentent un outil plus sûr et utile pour étudier les processus de virus de l'influenza en fonction de ses deux glycoprotéines principales : l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA).
Ce protocole décrit la génération de ces pps avec une stratégie de cotransfection à trois plasmides (survu la figure 1),comment quantifier les pps, et la détection de l'infectiosité. La production pp implique trois types de plasmides (Figure 1). Le gène gag-pol, qui code la protéine rétrovirus Gag-Pol, a été cloné à partir d'un kit d'emballage rétrovirus et inséré dans le plasmide pcDNA 3.1 et nommé pcDNA-Gag-Pol. Le gène amélioré de protéine fluorescente verte (eGFP), qui code la protéine fluorescente verte, a été cloné du vecteur de pTRE-EGFP, inséré dans le plasmide de PCDNA 3.1, et appelé pcDNA-GFP. Pendant le clonage, une séquence de signal d'emballage a été ajoutée par l'intermédiaire d'une amorce. Les gènes HA et NA ont été clonés dans un plasmide pVRC, nommé pVRC-HA et pVRC-NA, respectivement. Le dernier plasmide code la protéine de fusion et peut être remplacé par n'importe quelle autre protéine de fusion d'intérêt. Notre plate-forme de pseudotypage comprend deux plasmides d'expression de glycoprotéine : pVRC-HA et pVRC-NA. Cela peut simplifier la recherche sur le réassortiment entre les différentes souches virales dans un cadre BSL-2.

<table><tbody><tr><td>Benzonase Nucléase</td><td>Millipore</td><td>70664</td><td>Réduction efficace de la viscosité et élimination des acides nucléiques des solutions protéiques</td></tr><tr><td>Microplaques transparentes à fond plat traitées TC (96 puits)</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>Traitées pour une fixation optimale des cellules Stérilisées par rayonnement gamma et certifiées apyrogènes Codes alphanumériques individuels pour l’identification des puits</td></tr><tr><td>Plaques à puits multiples transparentes traitées TC (6 puits)</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>Codes alphanumériques individuels pour l’identification des puits Traité pour une fixation cellulaire optimale Stérilisé par irradiation gamma</td></tr><tr><td>Milieu essentiel modifié de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>Un milieu basal largement utilisé pour soutenir la croissance de nombreuses cellules de mammifères différentes</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Excell</td><td>FND500</td><td>sérums fœtaux bovins qui peuvent offrir une excellente valeur pour la culture cellulaire fondamentale, la recherche spécialisée et les tests spécifiques</td></tr><tr><td>Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)</td><td>Beckman Coulter</td><td>cytoflex</td><td></td></tr><tr><td>Adénocarcinome alvéolaire humain A549</td><td>cellules ATCC</td><td>CRM-CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Rein embryonnaire humain (HEK) HEK-293T/17 cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>Un réactif de transfection polyvalent qui s’est avéré efficace pour transfecter la plus grande variété de lignées cellulaires adhérentes et en suspension</td></tr><tr><td>Microscope biologique à fluorescence inversée</td><td>Olympus</td><td>BX51-32P01-FLB3</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à lumière inversée</td><td>Olympus</td><td>CKX31-12PHP</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Réactif de transfection</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Détection et quantification rapides, sensibles et précises par sonde des cibles d’ARN cibles.</td></tr><tr><td>Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR</td> Kit <td>NEB</td><td>E3006L</td><td>Résistera à jusqu’à 14 000 RCF RNase-/DNase Non pyrogène</td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) Cellules</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1,5 mL)</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>33 mm, stérilisé aux rayons gamma</td></tr><tr><td>Unité de filtre à seringue Millex-HV, 0,45 & micro ; m, PVDF</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td>un milieu essentiel minimal (MEM) amélioré qui permet une réduction de la supplémentation en sérum fœtal bovin d’au moins 50 % sans modification du taux de croissance cellulaire ou de la morphologie. Le milieu Opti-MEM I est également recommandé pour une utilisation avec des réactifs de transfection de lipides cationiques, tels que le réactif Lipofectamine.</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Sérum Réduit Milieu</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td>Les antibiotiques pénicilline et streptomycine sont utilisés pour prévenir la contamination bactérienne des cultures cellulaires en raison de leur action combinée efficace contre les bactéries à Gram positif et à Gram négatif.</td></tr><tr><td>pénicilline-streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>La FCR maximale est de 12 500 xg Plage de température de -80 &deg ; C à 120 &deg ; C Tubes à centrifuger stériles en PP sans RNase/ </td></tr><tr><td>(15 mL)</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>une protéase à sérine stable et hautement réactive</td></tr><tr><td>Protéase K</td><td>Beyotime</td><td>ST532</td><td>Traitée pour une fixation cellulaire optimale Stérilisée par rayonnement gamma et certifiée apyrogène</td></tr><tr><td>Boîte de culture traitée TC (60mm)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td>Trypsine du pancréas bovin TPCK Traitée, essentiellement sans sel, poudre lyophilisée, &ge ; 10 000 unités BAEE/mg de protéine</td></tr><tr><td>TPCK-trypsine</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td>Cette formulation liquide de trypsine contient de l’EDTA et du rouge de phénol. Gibco Trypsin-EDTA est fabriqué à partir de poudre de trypsine, un mélange irradié de protéases dérivées du pancréas porcin. En raison de sa force digestive, la trypsine est largement utilisée pour la dissociation cellulaire, le passage régulier de la culture cellulaire et la dissociation des tissus primaires. La concentration de trypsine nécessaire à la dissociation varie selon le type de cellule et les exigences expérimentales.</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

production de particules pseudotypées de grippe infectieuse à haut régime avec des glycoprotéines d'enveloppe provenant de virus h5n1 hautement pathogènes et de virus h7n9 aviaires

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

La transmission directe occasionnelle du virus hautement pathogène de la grippe aviaire A H5N1 (HPAI H5N1) et du H7N9 aux humains et leur létalité sont de graves problèmes de santé publique et suggèrent la possibilité d'une épidémie. Cependant, notre compréhension moléculaire du virus est rudimentaire, et il est nécessaire d'étudier les propriétés biologiques de ses protéines enveloppe comme cibles thérapeutiques et de développer des stratégies pour contrôler l'infection. Nous avons développé une plate-forme solide de particules pseudotypées virales (pp) pour étudier le virus de la grippe aviaire, y compris l'analyse fonctionnelle de son enveloppe d'hémagglutinine (HA) et de neuraminidase (NA) glycoprotéines, les caractéristiques de réassortiment des HA et des NA, récepteurs, les tropismes, neutralisant les anticorps, le diagnostic, l'infectiosité, aux fins du développement de médicaments et de la conception de vaccins. Ici, nous décrivons une procédure expérimentale pour établir des pps avec les glycoprotéines d'enveloppe (HA, NA) de deux souches de grippe A (HAPI H5N1 et 2013 H7N9 aviaire). Leur génération est basée sur la capacité de certains virus, tels que le virus de la leucémie murine (MLV), d'incorporer des glycoprotéines enveloppe dans un pp. En outre, nous détaillons également comment ces pps sont quantifiés avec RT-qPCR, et la détection d'infectiosité des pps indigènes et inadaptés de virus selon l'origine des HAs et des NAs. Ce système est très flexible et adaptable et peut être utilisé pour établir des pps viraux avec des glycoprotéines enveloppe qui peuvent être incorporés dans n'importe quel autre type de virus enveloppé. Ainsi, cette plate-forme de particules virales peut être utilisée pour étudier les virus sauvages dans de nombreuses recherches.

Selon la procédure générale décrite ci-dessus, nous avons généré 10 types de pps combinant deux h/NA de groupe ou glycoprotéine vsV-G ou glycoprotéines sans enveloppe (indiquées dans le tableau 1). Sept d'entre eux sont infectieux. Les pps qui abritent de la glycoprotéine sans enveloppe ou qui n'abritent que NA n'ont montré aucune infectiosité ici. La procédure de production de la grippe pp est examinée à la figure 1. Les micrographies électroniques de transmission des pps (...

Ce protocole décrit un processus expérimental pour produire des particules virales pseudotyped infectieuses à haut titre (pp) avec des glycoprotéines d'enveloppe de deux souches de grippe A et comment déterminer leur infectiosité. Ce protocole est très adaptable pour développer des pps de n'importe quel autre type de virus enveloppés avec différentes glycoprotéines d'enveloppe.

Production de particules pseudotypées de grippe infectieuse à haut régime avec des glycoprotéines d'enveloppe provenant de virus H5N1 hautement pathogènes et de virus H7N9 aviaires

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Cette technique de production de PP viral grippal et de détermination de son infectiosité peut simplifier la recherche sur le virus de la grippe dans une ville BSL-2. Nous avons normalisé le PPS pour les infections basé sur des données qRT-PCR de PPS. Deux plasmides d’expression glycoprotéine sont codés, ce qui peut simplifier la recherche sur le réassortment du virus.Un jour après l’ensemencement cellulaire, vérifiez la morphologie et la densité cellulaires au microscope à lumière inversée. Idéalement, la cellule devrait être environ 85% confluent à la transfection. Remplacer le milieu par un millilitre de DMEM sans sérum par puits, et remettre la plaque dans l’incubateur.Pour que chaque puits de cellules soit transfecté, diluer huit microlitres du réaccélésseur de transfection à un volume de 150 microlitres avec milieu de sérum réduit. Mélanger délicatement la solution et la laisser reposer à température ambiante pendant cinq minutes. Pendant ce temps, diluer 2,5 microgrammes d’ADN plasmide en 158 microlitres de sérum moyen réduit.Après l’incubation de cinq minutes, mélanger l’ADN dilué avec le réaccente de transfection diluée, mélanger délicatement la solution et la laisser à température ambiante pendant 15 minutes. Ajouter le complexe lipidique de l’ADN aux puits correspondants avec les cellules dans un milieu sans sérum. Mélanger ensuite délicatement l’assiette en faisant des allers-retours.Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant quatre à six heures. Après l’incubation, retirer le milieu et le remplacer par deux millilitres de DMEM par puits. Puis l’incuber pendant encore 36 à 48 heures.Ensemencer chaque type de cellule sensible à 10 000 cellules par puits et une plaque de puits de 96. Ensuite, laissez la plaque pendant la nuit dans un incubateur de 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone. Le troisième jour après la transfection, vérifiez la couleur du milieu qui devrait rose clair ou légèrement orange et examinez les cellules avec un microscope biologique florescent inversé sous la longueur d’onde de 440 à 460 nanomètres.À 38 à 48 heures après la post-transfection, récoltez les particules pseuotypées ou PPS en les passant à travers un filtre à membrane fluorure polyvinylidene de 0,45 micromètre pour éliminer les débris cellulaires, puis divisez-les en petits volumes aliquots et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. Pour quantifier le PPS, transférez 30 microlitres des particules virales purifiées à un tube sans RNase de 1,5 microlitre et ajoutez un microlitre de Benzonase Nuclease. Incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant une heure pour éliminer toute contamination par l’ADN et l’ARN.Après l’incubation, congeler l’échantillon à moins 70 degrés Celsius pour activer la nucléase et ajouter deux microlitres de Proteinase K.Incuber le mélange pendant 30 minutes pour digérer les protéines de l’enveloppe et libérer l’ARN CMV-GFP. Puis inactif le Proteinase K à 100 degrés Celsius pendant trois minutes. Quantifier le PPS avec la transcription quantitative inverse RTPCR à l’aide de la sonde universelle One-Step RT-qPCR Kit dans les amorces et les sondes spécifiées dans le manuscrit du texte.Normalisez le SPP à quatre fois 10 à 5 copies d’ARN par millilitre. Ajoutez ensuite la trypsine TPCK à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre dans le PPS qui abrite l’hémagglutinine H7N9. Incuber le PPS à 37 degrés Celsius pendant une heure pour former les sous-units fonctionnels HA1 et HA2.Mélangez le PPS normalisé avec le milieu DMEM à un rapport un pour un, puis apportez la plaque contenant des cellules sensibles à l’armoire de biosécurité. Aspirer le supernatant et laver les cellules une fois avec 100 microlitres de PBS préchauffé. Ajouter 100 microlitres de mélange PPS-DMEM dans chaque puits, en triplicant les tests d’infectiosité de chaque type de SPP à une lignée cellulaire sensible.Incuber la plaque pendant quatre à six heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, aspirez le supernatant et remplacez-le par 100 microlitres de DCM Incuber la plaque pendant encore 24 à 36 heures avant la détection d’infectiosité. Nos résultats sont PPS sont considérés maintenant infectieux pour les gens.Il est donc recommandé de prendre les procédures de protection sécuritaires nécessaires, comme le port d’un masque et l’exécution des analyses d’infectiosité dans une armoire de biosécurité. Ce protocole a été généré pour générer 10 types de particules pseudotypées ou PPS avec deux hémaglutinines groupées et neuraminidase virus de stomatite vésiculaire G glycoprotéine ou pas d’enveloppe glycoprotéines. Le PPS ont été imaged avec la microscopie électronique de transmission et leur infectiosité ont été évaluées dans deux lignes cellulaires, A549 et MDCK.Dans le groupe PPS abritant H5, l’infectiosité de H5N1, H5 plus N9 et H5 était d’environ 90%18% et 10% pour la lignée cellulaire A549 et 40%5% et 5% pour MDCK, respectivement. Dans le groupe PPS hébergeant H7, l’infectiosité de H7N9, H7 plus N1 et H7 était d’environ 10%7%et 1% pour la lignée cellulaire A549 et 8%4% et 1% pour MDCK, respectivement. L’infectiosité du virus vésiculaire de stomatite G glycoprotein PP était environ 21% pour A549 et 16% pour des cellules de MDCK.Tandis que l’enveloppe delta glycoprotéines PP n’a montré aucune infectiosité. Il est essentiel de se rappeler que les cellules HEK-293T/17 productrices de PP constituent le fondement de cette procédure. Ainsi, la croissance optimale nous enseigner HEK-293T/17 cellules est le plus important.Suite à cette procédure ou à un autre test tel que le réceptif L2, l’analyse de dingation peut être effectuée. Cet essai peut presque donner débarrassé des particularités biologiques de la préférence de récepteur et le modèle révélera le tropisme du PPS. Depuis qu’ils ont pris les glycoprotéines du virus de la grippe sont clonés en deux plus max.Ha et les protéines NA peuvent être étudiés séparément de sorte que nous réassortment entre eux. Les mutants et les effets matures peuvent être explorés.

production-high-titer-infectious-influenza-pseudotyped-particles-with

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo montre la génération de particules pseudo-virales de la grippe (VLP) dans un système de mammifères. Lors de l’expression de trois vecteurs d’expression eucaryotes – codant pour différentes protéines structurelles virales – dans des cellules hôtes de mammifères appropriées, les protéines virales exprimées s’auto-assemblent en VLP sur la membrane plasmique de l’hôte et se libèrent par bourgeonnement à partir de la surface cellulaire.

Technique de génération de particules semblables à un virus de la grippe par l’intermédiaire d’un système de mammifère

La vidéo présente une méthode pour créer des virus grippaux recombinants adaptés au froid. Il s’agit de transfecter des cellules humaines avec des plasmides bidirectionnels, suivi d’une incubation à basse température pour produire des virus adaptés à la production de vaccins, caractérisés par une réplication réduite dans des conditions plus chaudes.

Génération de virus grippaux vivants atténués recombinants pour les vaccins

Nous décrivons ici un moyen pour exprimer des antigènes de surface du virus de l'influenza correctement repliés et fonctionnels dérivés du nouveau virus H7N9 chinois dans des cellules d'insectes. La technique peut être adaptée pour exprimer ectodomaines de toutes les protéines virales ou cellulaires superficiels.

L&#39;expression de l&#39;hémagglutinine recombinante fonctionnelle et la neuraminidase du virus de la nouvelle grippe H7N9 à l&#39;aide du système d&#39;expression baculovirus

Il y a un manque général de connaissances sur le fonctionnement des vaccins. Ici, nous proposons l’utilisation combinée de la génétique inverse et de souris chimériques de la moelle osseuse pour mieux comprendre les réponses immunitaires précoces de l’hôte aux vaccins, en mettant l’accent sur les cellules dendritiques et l’immunité des lymphocytes T.

Administration intranasale de vaccins contre la grippe recombinant chimérique dans les modèles de souris pour étudier l&#39;immunité muqueuse

Ici, nous présentons un protocole pour la synthèse de particules de type viral en utilisant soit baculovirus ou systèmes d'expression de mammifères, et la purification de l'ultracentrifugation. Cette approche hautement personnalisable est utilisée pour identifier des antigènes viraux comme cibles de vaccins d'une manière sûre et flexible.

Expression et purification de particules de virus-like pour la vaccination

Les auteurs décrivent une méthode par laquelle nous identifions des résidus importants requis pour la liaison des anticorps monoclonaux humains ou murins qui ciblent l’hémagglutinine virale du virus de l’influenza. Le protocole peut être adapté à d’autres glycoprotéines de surface de virus et de leurs anticorps neutralisants correspondants.

Génération des variantes d’évasion de neutraliser les anticorps monoclonaux Influenza Virus

Nous présentons ici un protocole visant à générer des particules pseudo dans un cadre de BSL-2 intégrant la protéine spike du syndrome respiratoire de virus hautement pathogènes Moyen-Orient et coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère. Ces particules pseudo contiennent un gène de rapporteur luciférase permettant la quantification de l’entrée du virus dans les cellules de l’hôte cible.

Production de pseudo particules pour étudier les coronavirus hautement pathogènes dans un cadre de niveau 2 de Biosafety

Nous décrivons ici un protocole pour l’emballage des pseudovirus et la mesure de l’activité neutralisante des anticorps.

Préparation de virus pseudo-typés H5 de la grippe aviaire avec procédé de transfection de phosphate de calcium et mesure de l’activité neutralisante des anticorps

Le protocole décrit une approche à haut débit pour déterminer les structures des protéines membranaires par cryo-tomographie électronique et traitement d'images 3D. Il couvre les détails de la préparation des échantillons, collecte, traitement et interprétation des données, et se termine par la production d'une cible représentant de l'approche, le VIH-1 glycoprotéine d'enveloppe. Ces procédures de calcul sont conçues d'une façon qui permet aux chercheurs et aux étudiants de travailler à...

Détermination des structures moléculaires des glycoprotéines d&#39;enveloppe du VIH en utilisant microscopie cryo-électronique et automatisée Sous-tomogramme moyenne

Une méthode pour préserver, de détecter et de séquence d'ARN à partir des virus grippaux aviaires a été validé et étendu en utilisant des échantillons de fèces naturelle des oiseaux. Cette technique élimine la nécessité de maintenir une chaîne du froid et la manipulation des virus infectieux et peuvent être appliquées dans un de 96 puits à haut débit de configuration.

Surveillance de l&#39;influenza aviaire aux ALE Cartes: méthodes de terrain, la biosécurité et les questions de transport Résolu

Découvrez la production de particules pseudotypées infectieuses à haut titre avec des glycoprotéines d'enveloppe de virus H5N1 et H7N9. Cette méthode permet d'étudier l'infectivité virale en toute sécurité en laboratoire BSL-2.

Production de particules pseudotypées de grippe infectieuse à haut régime avec des glycoprotéines denveloppe provenant de virus H5N1 hautement pathogènes et de virus H7N9 aviaires (Vidéo) | JoVE Journal

Production de particules pseudotypées de grippe infectieuse à haut régime avec des glycoprotéines d'enveloppe provenant de virus H5N1 hautement pathogènes et de virus H7N9 aviaires

Explorer plus de vidéos