Caractérisation de l’efficacité de saut d’Exon dans les échantillons de patients de DMD dans les essais cliniques d’oligonucléotides d’Antisense
7 mai 2020
Ici, nous présentons la caractérisation moléculaire de l’expression de dystrophine 38 utilisant le séquençage de Sanger, RT-PCR, et le blotting occidental dans l’essai clinique.
Ce protocole fournit une méthodologie normalisée pour la préparation et la manipulation des tissus musculaires dans les milieux précliniques et les essais cliniques, ce qui est important pour obtenir des résultats fiables dans le domaine de la DMD. Les techniques sont pertinentes pour les essais de saut d’exon pour DMD. Et le principal avantage est que, ils sont bien établis et reproductibles s’ils sont réalisés collectivement.
Ces techniques sont principalement axées sur le saut d’exon dans DMD, mais avec un changement d’amorce, les mêmes techniques peuvent être appliquées à d’autres maladies traitées avec des thérapies d’épissage. Ces méthodes peuvent être utilisées pour atteindre l’efficacité de saut d’exon à la fois et l’ARN et les protéines. Pour préparer un échantillon aux fins d’analyse, mélangez d’abord des volumes égaux de gomme de tragacanth et d’eau jusqu’à ce que la gomme devienne molle et collante.
Chargez ce mélange en seringues de 25 millilitres et distribuez de 0,5 à un centimètre de gomme sur des disques de liège individuels. Étiquetez les disques de l’autre côté et placez un contenant d’isopentane dans de l’azote liquide jusqu’à ce qu’une partie du liquide gèle. Placez chaque spécimen dans la gomme de tragacanth sur les disques avec un axe longitudinal de chaque muscle perpendiculaire au liège.
Placez la gomme au fond de chaque muscle pour aider à maintenir le muscle en place, et utilisez des pinces à épiler pour congeler les spécimens dans l’isopentane froid. Déplacez les spécimens en continu pendant une minute ou jusqu’à ce qu’ils soient complètement congelés avant de les placer temporairement sur de la glace sèche. Ensuite, placez les spécimens dans des flacons de verre pour un stockage de 80 degrés Celsius.
Pour sectioner le tissu musculaire gelé pour analyse, réglez un cryostat à une température de travail de 25 degrés Celsius, et pour monter le bloc musculaire sur le support. Couper le bloc tissulaire jusqu’à ce que les sections plates soient atteintes. Pour l’analyse inverse de transcriptase PCR et de tache occidentale, obtenez 10 tranches épaisses de micromètre.
Pour l’analyse immunohistochimique, obtenir six à huit tranches micromètres d’épaisseur, et pour l’hématoxyline et la coloration de l’éosine, obtenir 10 à 12 tranches d’épaisseur micromètre. Après leur acquisition, placer les sections tranchées dans deux tubes millilitres. Stockez les échantillons pour le PCR et le ballonnement occidental à 80 degrés Celsius.
Ici, le système d’électrophoresis de micropuce, les images de gel des réactions inverses de PCR de transcriptase, et les résultats de séquençage de la bande sautée de deux patients avant et après traitement avec un oligonucleotide antisens dans un essai de phase d’escalade de dose un sont montrés. Les deux patients hébergent des suppressions. Comme prévu, avant le traitement, les deux patients n’ont montré aucun saut et seulement une bande non sautée pourrait être visualisée.
Après 12 semaines de traitement, une bande inférieure sautée claire a été visualisée pour le deuxième patient, cependant, il était toujours difficile de détecter n’importe quel produit sauté pour le premier patient. Les résultats de séquençage ont montré une concatenation des exons 47 et 54 pour le deuxième patient, et des exons, 44 et 54 pour le premier patient. Pour calculer le pourcentage sauté, la concentration molaire de la bande sautée a été divisée par les bandes sautées et non sirotées.
Comme prévu, aucune bande de dystrophine n’a été détectée par la tache occidentale avant traitement. Après traitement, une bande a été détectée du deuxième patient avec un poids moléculaire inférieur comparé à celui observé dans le contrôle sain. Le premier patient, cependant, n’a montré aucun niveau détectable de dystrophine après traitement.
Il est essentiel de manipuler correctement le tissu musculaire et de placer chaque spécimen sur la gencive tragacanth de manière cohérente. Les sections tissulaires peuvent être analysées de différentes façons, y compris artificielle à PCR, PCR numérique, tache occidentale, immunohistochimie, et avec différents types d’omiques. Ces techniques peuvent être accélérer, le développement, exon supplémentaires sauter des médicaments ciblant différents exons, et peut être appliquée au développement de base virale et à nouveau dans l’édition pour DMD.
Aperçu
Cette étude présente une méthodologie normalisée pour la préparation et la manipulation de tissus musculaires dans les essais cliniques relatifs à la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). L'accent est mis sur les techniques de saut d'exon, essentielles au développement de thérapies efficaces.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie
- Essais cliniques
Contexte
- La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie grave entraînant une dégénérescence musculaire.
- Le saut d'exon est une approche thérapeutique prometteuse pour la DMD.
- Une manipulation fiable des tissus est essentielle pour obtenir des résultats expérimentaux précis.
- Des méthodes normalisées peuvent améliorer la reproductibilité des recherches.
Objectif de l'étude
- Établir un protocole fiable pour la préparation du tissu musculaire.
- Faciliter les essais d'exon skipping pour la DMD.
- Fournir un cadre applicable à d'autres maladies traitées par des thérapies d'épissage.
Méthodes utilisées
- Préparation du tissu musculaire à l'aide de gomme adragante et d'isopentane.
- Congélation et sectionnement des échantillons musculaires pour analyse.
- PCR en transcription inverse et immunoblotting pour la détection de l'expression de la dystrophine.
- Séquençage pour analyser l'efficacité du saut d'exon.
Résultats principaux
- Visualisation réussie de bandes sautées chez les patients traités.
- Détection de la dystrophine chez un patient après le traitement.
- Variabilité de la réponse au traitement entre les patients.
- Importance d'une manipulation homogène des tissus soulignée pour des résultats précis.
Conclusions
- Des méthodes normalisées sont essentielles pour faire progresser les thérapies contre la DMD.
- Le saut d'exon montre un potentiel, mais nécessite une optimisation supplémentaire.
- De futures études pourront s'appuyer sur ces méthodes pour des applications plus larges.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Ce protocole établit un flux de travail normalisé pour évaluer l'efficacité du saut d'exon dans des échantillons de patients atteints de DMD, soutenant ainsi directement la validation ciblée dans le développement d'oligonucléotides antisens. En permettant la mesure quantitative de la restauration moléculaire, il offre une détection mécanistique des risques pour les thérapies par saut de l'exon 53, telles que le viltolarsen. L'approche renforce la fiabilité prédictive de la traduction préclinique à clinique en reliant les lectures biochimiques au mécanisme thérapeutique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'évaluer l'hypothèse thérapeutique fondée sur le saut d'exon induit par des oligonucléotides antisens dans des échantillons dérivés de patients.
- Valeur opérationnelle : Fournit des méthodes reproductibles de séquençage de Sanger, de RT-PCR et de transfert Western pour confirmer l'activité moléculaire ciblée.
Développement de tests et de criblages
- Valeur scientifique : Génère des rapports quantitatifs entre les bandes sautées et le total des bandes pour l'évaluation de la réponse dose-effet dans l'efficacité du saut d'exon.
- Valeur opérationnelle : Standardise les protocoles de préparation et de sectionnement des tissus afin d'assurer la reproductibilité des tests sur des jeux d'échantillons précliniques et cliniques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet l'analyse de systèmes pertinents pour la maladie en caractérisant la restauration de la dystrophine dans des biopsies musculaires provenant réellement de patients.
- Valeur opérationnelle : Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en utilisant des indicateurs moléculaires cohérents à travers différents modèles expérimentaux.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de cible à l'identification de composés initiateurs, en fournissant une confirmation moléculaire du mécanisme avant les tests d'efficacité fonctionnelle.
- Découverte biologique : Confirme la correction du splicage des exons ciblés dans des échantillons de patients, soutenant ainsi la validation de l'hypothèse pour les oligonucléotides antisens.
- Écrantage : Fournit des pourcentages quantitatifs de saut d'exon par imagerie sur gel et séquençage, permettant la comparaison de composés.
- Analytique : Propose une quantification des bandes sautées basée sur la concentration molaire, permettant des analyses comparatives entre doses et patients.
- Recherche translationnelle : Associe le saut d'exon moléculaire à la détection de la protéine dystrophine, reliant ainsi le mécanisme au niveau de l'ARN à l'effet au niveau protéique.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place un cadre réutilisable de traitement et d'analyse des tissus, applicable à plusieurs cibles d'exons et à diverses thérapies de splicage.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Désamorçage mécanistique grâce à la visualisation directe du saut d'exon et de la restauration de la dystrophine dans un tissu humain.
- Valeur opérationnelle : L'encapsulation standardisée à l'aide de gomme de tragacanthe et la cryosectionnement assurent une cohérence des échantillons et réduisent la variabilité.
- Valeur stratégique : Guide les décisions d'orientation (aller ou ne pas aller) en fournissant des preuves moléculaires d'une interaction avec la cible avant d'atteindre les critères fonctionnels.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des oligonucléotides antisens en fonction de l'efficacité du saut d'exon dans les génotypes patients pertinents.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en techniques de biologie moléculaire, notamment la RT-PCR, le Western blot et le séquençage de Sanger.
- Dépend d'un cryostat pour la coupe des tissus et d'azote liquide ou d'isopentane pour la congélation rapide.
- Exige des protocoles standardisés de manipulation des tissus afin de préserver l'intégrité des échantillons entre les sites ou les points temporels.
- Doit tenir compte de la variabilité des mutations spécifiques aux patients lors de la conception des amorces pour la détection du saut d'exon.
- Est limité par la nature semi-quantitative des méthodes basées sur les gels, en l'absence de validation par PCR numérique ou électrophorèse capillaire.
