Name: Méthode CryoAPEX pour l’analyse de la microscopie électronique de la localisation des protéines membranaires dans les cellules ultrastructuralement conservées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Découvrez la méthode cryoAPEX pour localiser les protéines membranaires marquées par APEX2 en microscopie électronique à transmission, préservant l'ultrastructure cellulaire dans les cellules HEK293.

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Le protocole décrit ici découle d’une publication de Sengupta et coll., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Ce travail est soutenu par des subventions R01GM10092 (à S.M.) et AI081077 (R.V.S.) des National Institutes of Health, CTSI-106564 (à S.M.) de l’Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, et PI4D-209263 (à S.M.) du National Institute for Inflammation, Immunology et Infectious Disease.

1. Culture cellulaire et transfection
<ol><li>Seed HEK-293T cellules sur un 60 mm de diamètre ou plus grand plat de culture tissulaire et de croître à 60%-90% confluence dans un incubateur de culture cellulaire à 37 oC et 5% CO2.</li>
	<li>Cellules transfect avec plasmides d’expression de mammifères APEX2-marqués utilisant le réactif de transfection (voir tableau des matériaux) selon les directives du fabricant.</li>
	<li>À 12 à 15 heures après la transfection, laver les cellules une fois avec du phosphate tamponné saline (PBS). Retirer les cellules du plat par lavage doux avec PBS. Un réactif de dissociation tel que la trypsine peut être utilisé si nécessaire pour un type de cellule donné. Centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min pour former uneboulette.
</li>
</ol>2. Fixation chimique et réaction de peroxidase
<ol><li>Retirez soigneusement le supernatant et suspendez la pastille dans 2 ml de glutaraldéhyde de 2 % (v/v) dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 M, pH 7,4, à température ambiante. Placer l’échantillon sur la glace et incuber pendant 30 min. Pelleter l’échantillon à 500 x g pendant 5 min à 4 oC. À partir de ce moment jusqu’à l’étape 2.3.3, gardez l’échantillon et les solutions sur la glace, et effectuez la centrifugation à 4 oC. CAUTION : Le glutaraldéhyde et le tampon de cacodylate de sodium (contenant de l’arsenic) sont toxiques. Des procédures de sécurité appropriées et un équipement de protection individuelle doivent être utilisés pendant la manipulation. Les solutions contenant du glutaraldéhyde et/ou de la mémoire tampon de cacodylate de sodium doivent être éliminées en tant que déchets chimiques dangereux.</li>
	<li>Laver la pastille 3x pendant 5 min avec 2 ml de tampon cacodylate de 0,1 M de sodium. Pour ceux-ci ainsi que les lavages suivants, resuspendre doucement la pastille cellulaire dans la solution requise, puis centrifugeuse pendant 5 min à 500 x g et retirer soigneusement et jeter le supernatant. Il faut faire attention aux étapes répétées de granulation et de suspension, afin de minimiser la perte d’échantillon.</li>
	<li>Effectuer la réaction peroxidase<ol>
<li>Préparer une solution fraîche contenant 1 mg/mL de tétrahydrochlorure de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 M. Dissoudre le DAB par un tourbillon vigoureux pendant 5 à 10 min. CAUTION: DAB est toxique et un cancérogène potentiel et doit être manipulé avec des procédures de sécurité appropriées et de l’équipement de protection individuelle. Les solutions contenant du DAB doivent être traitées comme des déchets chimiques dangereux.</li>
		<li>Laver les granulés en les rependants dans 3 ml de solution DAB suivie d’un granule à 500 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Resuspendre le granule dans une solution DAB de 3 ml à laquelle le peroxyde d’hydrogène a été ajouté pour atteindre une concentration finale de 5,88 mM. Incuber pendant 30 min à l’température ambiante. La pastille devient visiblement de couleur brune indiquant la présence du produit de réaction DAB insoluble. REMARQUE : Le temps d’incubation du DAB peut devoir être optimisé pour chaque échantillon. Le changement de couleur peut être surveillé sur le microscope léger. D’après notre expérience, une incubation de 15 à 45 min est suffisante pour la plupart des protéines. Le peroxyde d’hydrogène doit être obtenu à partir d’une bouteille fraîchement ouverte ou d’une bouteille qui a été bien scellée après l’ouverture.</li>
		<li>Pelleter les cellules, puis laver 2x pendant 5 min avec 0,1 M tampon de cacodylate de sodium, suivi d’un lavage dans le milieu modifié de du Dulbecco Eagle (DMEM) ou le milieu cellulaire de choix.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspendre la pastille cellulaire en 500 l d’une solution cryo-protectrice de DMEM (ou autre support cellulaire de choix) contenant 10% de sérum bovin fœtal et 15% d’albumine de sérum bovin bovin. Pellet à nouveau, en augmentant légèrement la vitesse de centrifugeuse de 500 x g si nécessaire pour obtenir une pastille dans la solution cryo-protectrice épaisse. Jeter la majorité du supernatant, en veillant à ce qu’il reste suffisamment de liquide pour que le granule ne se dessèche pas. Transportez la pastille cellulaire jusqu’à l’instrument de congélation à haute pression.</li>
</ol>3. Congélation à haute pression
<ol><li>Remplissez le réservoir de congélation à haute pression avec de l’azote liquide (LN2) et démarrez la pompe pour remplir la chambre d’échantillon avec LN2. CAUTION : Utilisez les procédures de sécurité appropriées et l’équipement de protection individuelle lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide. REMARQUE : Ces étapes sont spécifiques au congélateur haute pression Leica EMPACT2.</li>
	<li>Éliminez tout liquide restant de la pastille cellulaire à l’aide du coin d’une lingette de laboratoire ou d’une serviette en papier. Il faut avoir suffisamment de liquide pour que la pastille forme une pâte semblable en consistance au dentifrice. Il doit être assez mince pour être aspiré dans une pointe de tuyauterie de 20 l.</li>
	<li>Aspirez 2 à 3 l de la pastille cellulaire et déposez-la sur un porte-membrane. Remplissez complètement le puits du porte-membrane, de sorte que la tension de surface crée un léger dôme sur le dessus, mais le liquide ne se déverse pas du puits. Aucune bulle d’air ne devrait être présente.</li>
	<li>Faites glisser le porte-membrane dans la cartouche et fixez-le. Placez la cartouche dans la machine HPF qui a été préparée et apprêtée, et appuyez sur Commencer à geler.</li>
	<li>Inspecter la température par rapport aux graphiques temporels et temporels pour vérifier que la pression a atteint 2100 barres et que la température a atteint -196 oC dans un rayon de 200 ms, et que les deux paramètres sont demeurés stables pendant les 600 m de mesure.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.3 à 3.5 jusqu’à ce que le granule de cellule ait été utilisé ou que le nombre désiré d’échantillons ait été congelé.</li>
	<li>Garder les cartouches immergées dans LN2, retirer chaque porteur de membrane de sa cartouche, placer dans une capsule en plastique, et placer la capsule en plastique dans un cryo-vial plein de LN2. REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Les cryo-vials avec des échantillons peuvent être stockés dans un dewar LN2 dans des cryo-cannes ou des cryo-boîtes.</li>
</ol>4. Substitution de gel
CAUTION : Utilisez les procédures de sécurité appropriées et l’équipement de protection individuelle lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide. En outre, beaucoup de produits chimiques utilisés à l’étape 4 sont toxiques, y compris l’acide tannique, le tétroxide d’osmium et l’acétate uranyl. Ces produits chimiques doivent être manipulés selon les procédures de sécurité appropriées et éliminés comme déchets chimiques dangereux.
<ol><li>Remplissez l’unité de substitution automatisée de gel avec LN2. Porter la température à -90 oC.</li>
	<li>Préparer FS Mix 1 et commencer FS.<ol>
<li>Dans une hotte chimique, préparer une solution de 0,2 % d’acide tannique (w/v) et 5 % d’eau DI dans l’acétone et l’aliquot 1 ml par échantillon en cryo-vials. Placer dans LN2 pour congeler.</li>
		<li>Placez les flacons FS Mix 1 et les cryo-vials contenant les granulés de cellules congelées dans la chambre d’échantillon de l’unité FS. Transférer la capsule interne contenant le porteur de membrane du flacon LN2 dans le flacon correspondant contenant FS Mix 1.</li>
		<li>Démarrer un protocole FS avec sa première étape étant de 24 h à -90 oC. Après les 24 h, mettre en pause le FS, et laver les échantillons 3x pendant 5 min avec de l’acétone qui a été refroidi à -90 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer FS Mix 2 et compléter FS CAUTION : Le tétroxide d’osmium est un produit chimique hautement toxique et oxydant qui ne devrait être manipulé que par des personnes formées selon les protocoles de sécurité établis. Les protocoles de stockage et d’élimination des solutions contenant de l’osmium doivent être suivis, ainsi que l’étiquetage des zones de laboratoire où le tétroxide d’osmium est utilisé. Le tétroxide d’osmium doit être manipulé dans une hotte chimique avec équipement de protection individuelle comprenant la protection d’oeil, une robe de laboratoire fournissant la protection complète de bras, les gants doubles de Nitrile, et un respirateur facultatif.<ol>
<li>Dans une hotte chimique, préparer une solution de 1% de tétroxide d’osmium, 0,2% d’acétate uranyl, et 5% d’eau DI dans l’acétone. Aliquot 1 ml par échantillon en cryo-vials et placer dans LN2 pour congeler. REMARQUE : Les solutions stock d’acide tannique (10 % w/v en acétone), de tétroxyde d’osmium (10 % w/v en acétone) et d’acétate uranyl (8 % w/v au méthanol) peuvent être préparées et stockées dans des cryo-vials dans un dewar LN2 pour faciliter la préparation des mélanges FS.</li>
		<li>Placez les cryo-vials avec FS Mix 2 dans l’unité FS et transférez les capsules du troisième lavage d’acétone dans les flacons FS Mix 2. Incuber dans FS Mix 2 pendant 72 h à -90 oC, suivi d’un réchauffement progressif à 0 oC sur 12-18 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Maintenez la température à 0 oC et lavez 3x pendant 30 min avec de l’acétone pré-réfrigéré à partir d’une bouteille fraîchement ouverte.</li>
</ol>5. Infiltration de résine et intégration
CAUTION: La résine utilisée ici (voir Tableau des matériaux) est toxique avant la polymérisation, et doit être manipulée avec des procédures de sécurité appropriées et de l’équipement de protection individuelle. Toute résine non polymérisée doit être éliminée comme déchets chimiques dangereux.
<ol><li>Infiltrer les échantillons avec des concentrations croissantes de résine dissoute dans l’acétone à partir d’une bouteille nouvellement ouverte. Préparer un mélange de composants de résine A, B et D dans un bécher en plastique selon les directives du fabricant, et couver des échantillons dans les concentrations de résine suivantes : 2 %, 4 % et 8 % pour 2 h chacun à 0 oC. Incuber en 15%, 30%, 60%, 90%, et 100% résine pendant 4 h chacun à température ambiante. Incuber pendant 4 h dans un mélange de composants A, B, C et D.</li>
	<li>Placez les porteurs de membrane avec le côté de granule de cellules vers le haut dans les moules plats d’embedding et remplissez avec la résine (A, B, C, et D). Des étiquettes en papier pour les échantillons peuvent être ajoutées aux puits à ce moment-là.</li>
	<li>Polymériser dans un four à 60 oC pendant 24 à 36 h. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause après la polymérisation.</li>
	<li>Retirer les blocs du moule et laisser refroidir. Pour enlever le porteur de membrane, placez d’abord l’échantillon dans le mandrin vertical de l’ultramicrotome où il peut être visualisé avec grossissement. Séparez le porteur de membrane du bloc par une combinaison d’azote liquide tamponnant sur le support de membrane pour séparer le métal du plastique, et en utilisant une lame de rasoir pour écailler la résine autour du porteur de membrane. Une fois séparé, soulever délicatement le porte-membrane en laissant le dôme de granules de cellules sur la face du bloc.</li>
	<li>Placez le bloc avec le granule de cellules exposé vers le haut dans un moule plat d’embedding qui est légèrement plus profond que le premier moule, et remplissez avec la résine. Polymériser à 60 oC pour 24 à 36 h. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause après la polymérisation.</li>
</ol>6. Sectionnement
<ol><li>Couper le bloc autour de la pastille cellulaire à l’aide d’une lame de rasoir. Placez ensuite le bloc dans le mandrin d’échantillon sur le bras de section d’un ultramicrotome. À l’aide d’un couteau en verre ou en diamant, tailler le bloc en une forme trapézoïdale entourant étroitement la pastille cellulaire.</li>
	<li>Obtenir 90 sections ultraminces de la pastille cellulaire à l’aide d’un couteau en verre ou en diamant.</li>
	<li>Ramassez un ruban de sections sur une grille TEM. Les grilles de fente en cuivre enduites de Formvar (1 x 2 mm2 fentes) sont utiles pour l’imagerie des sections sérielles. Séchez la grille en buvant le bord sur un morceau de papier filtre, et entreposez-la dans une boîte de rangement de grille TEM. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause après la section.</li>
</ol>7. Imagerie TEM
<ol><li>Monter la grille sur le support TEM et placer dans le microscope. Nous utilisons régulièrement un Tecnai T12 à 80 kV pour le dépistage des échantillons cryoAPEX. Acquérir des images de cellules et de structures subcellulaires d’intérêt avec l’étiquetage APEX2.</li>
	<li>Si désiré, obtenir un contraste de membrane supplémentaire par l’utilisation de plomb post-coloration. Voir La figure 2 pour la comparaison des échantillons non tachés(figure 2I-K) et des échantillons de plomb post-tachés ( Figure2A-H).<ol>
<li>Flotter les grilles sèches côté section vers le bas sur une goutte de solution diluée de chlorure de sodium (1,5 mM), 2x pour 1 min chacun, puis 1x pour 10 min.</li>
		<li>Flottez les grilles sur une goutte de la solution de plomb de Sato pendant 1 min. Laver en flottant sur la solution de chlorure de sodium 3x pendant 1 min, puis sur l’eau DI 3x pendant 1 min. Blot excès liquide des grilles et stocker dans une boîte de grille. CAUTION: Le plomb est un produit chimique toxique et doit être manipulé avec des procédures de sécurité appropriées et de l’équipement de protection individuelle. Les solutions contenant du plomb doivent être éliminées en tant que déchets chimiques dangereux.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Image post-tachée des échantillons sur le TEM. REMARQUE : Dans la préparation traditionnelle de l’échantillon pour tem, l’étape contrastante de plomb est effectuée avant la formation image de TEM. Cependant, il est recommandé que pour les échantillons cryoAPEX, l’imagerie est effectuée d’abord sur des échantillons non contrastés. Cela garantit que le signal de l’étiquette peut être facilement localisé par son fort contraste avec les structures cellulaires plus légèrement tachées. Pour de nombreux échantillons, aucune autre coloration ne sera requise; toutefois, si un contraste membranaire supplémentaire est souhaité, le plomb post-coloration peut être effectué (étape 7.2) et l’échantillon ré-imagené.</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Le protocole cryoAPEX présenté ici fournit une méthode robuste pour caractériser la localisation des protéines membranaires dans l’environnement cellulaire. Non seulement l’utilisation d’une étiquette APEX2 codée génétiquement permet-elle une localisation précise d’une protéine d’intérêt, mais l’utilisation de la cryofixation et de la déshydratation à basse température offre une excellente conservation et la coloration de l’ultrastructure cellulaire environnante. Combinées, ces approches sont un outil puissant pour local...

Les études biologiques incluent souvent des questions de résolution de la localisation subcellulaire des protéines dans les cellules et les organites. La microscopie d’immunofluorescence fournit une vue utile à basse résolution de la localisation des protéines, et les progrès récents dans l’imagerie de super-résolution repoussent les limites de la résolution pour les protéines fluorescentes étiquetées1,2,3. Cependant, la microscopie électronique (EM) demeure l’étalon-or de l’imagerie de l’ultrastructure cellulaire à haute résolution, bien que l’étiquetage des protéines soit un défi.
Historiquement, plusieurs méthodes EM ont été utilisées pour aborder les questions de localisation des protéines ultrastructurales. L’une des méthodes les plus couramment utilisées est la microscopie immunoélectronique (IEM), où des anticorps primaires spécifiques à l’antigène sont utilisés pour détecter la protéine d’intérêt. Le signal EM est généré par l’application d’anticorps secondaires conjugués à des particules denses en électrons, le plus souvent l’or colloïdal4,5. Alternativement, les anticorps conjugués avec des enzymes telles que le radis de cheval peroxidase (HRP) peuvent être utilisés pour produire un précipité dense en électrons6,7,8. Deux approches principales existent pour l’IEM, appelée étiquetage pré-embedding et post-encastrage. Dans la pré-intégration IEM, les anticorps sont introduits directement dans les cellules, ce qui nécessite la fixation de la lumière et la perméabilisation des cellules9,10,11. Les deux étapes peuvent endommager l’ultrastructure12,13. Le développement d’anticorps significativement plus petits constitués d’un fragment d’anticorps Fab conjugué à 1,4 nm de nanogold permet d’utiliser des conditions de perméabilisation très douces; cependant, le nanogold est trop petit pour la visualisation directe sous TEM et nécessite des étapes supplémentaires d’amélioration pour devenir visible14,15,16. Dans l’IEM post-incorporation, les anticorps sont appliqués sur les sections minces des cellules qui ont été entièrement traitées par fixation, déshydratation, et l’intégration dans la résine17. Bien que cette approche évite l’étape de perméabilisation, la préservation de l’épitope d’intérêt tout au long de la préparation de l’échantillon est difficile18,19,20. La méthode Tokuyasu de fixation de la lumière suivie de la congélation, cryo-sectionnement, et la détection d’anticorps fournit la conservation améliorée d’épitope21,22. Cependant, les exigences techniques de la cryo-ultramicrotomie, ainsi que le contraste sous-optimal atteint dans la cellule, sont des inconvénients23.
L’utilisation d’étiquettes génétiquement codées élimine bon nombre des difficultés de l’IEM liées à la détection de la protéine d’intérêt. Une variété d’étiquettes sont disponibles, y compris HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG, et metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Chacun e de ces avantages présente des avantages par rapport aux méthodes précédentes, mais chacune présente également des inconvénients empêchant une utilisation généralisée. Ces inconvénients vont de l’inactivité de HRP dans le cytosol à la grande taille de l’étiquette de ferritine, sensibilité à la lumière de ReAsH, et petite taille et le manque de compatibilité avec la coloration cellulaire de la métallothionein. Récemment, une protéine dérivée de l’ascorbate peroxidase a été conçue comme une étiquette EM, nommée APEX233,34. En peroxidase, APEX2 peut catalyser l’oxydation de 3,3' diaminobenzidine (DAB), produisant un précipité qui réagit avec du tétroxide d’osmium pour fournir un contraste local EM avec une diffusion minimale de la protéine d’intérêt (moins de 25 nm)33,35. Contrairement aux méthodes traditionnelles basées sur HRP, APEX2 est extrêmement stable et reste actif dans tous les compartiments cellulaires33. Les échantillons peuvent être traités pour TEM à l’aide de la coloration traditionnelle de l’échantillon EM et des méthodes qui permettent une bonne visualisation des structures environnantes33,34,36. En raison de sa petite taille, sa stabilité et sa polyvalence, APEX2 est devenu une étiquette EM à fort potentiel.
Bon nombre des approches mentionnées ci-dessus ne peuvent pas ou n’ont pas encore été combinées à l’état actuel de l’art en matière de préservation ultrastructurale, de cryofixation et de substitution par le gel à basse température. Ainsi, ils souffrent d’un manque de conservation de la membrane et / ou de coloration cellulaire pour déterminer la localisation précise des protéines. Cela limite nécessairement la résolution et l’interprétation des données qui peuvent être obtenues. La cryofixation par congélation à haute pression (HPF) implique une congélation rapide d’échantillons dans l’azote liquide à haute pression (2 100 barres), ce qui provoque la vitrification plutôt que la cristallisation des échantillons aqueux, préservant ainsi les cellules dans un état quasi-indigène37,38,39. Le HPF est suivi d’une substitution par gel (FS), d’une déshydratation à basse température (-90 oC) en acétone combinée à l’incubation avec des taches EM typiques telles que le tétroxide d’osmium et l’acétate uranyl. HPF et FS fournissent ensemble un avantage distinct sur la fixation chimique traditionnelle (un processus plus long qui peut conduire à des artefacts) et la déshydratation de l’alcool à température ambiante ou sur la glace (qui peut conduire à l’extraction des lipides et des sucres), et sont donc souhaitables de combiner avec les meilleures étiquettes EM pour la détection des protéines.
Une des raisons pour lesquelles HPF/FS n’a pas été combiné avec l’étiquetage APEX2 est que la fixation chimique légère est une condition préalable à la réaction de peroxidase, limitant la diffusion du produit de réaction de DAB. Dans les études APEX2 jusqu’à présent, la fixation et la réaction peroxidase sont suivies par les méthodes traditionnelles EM pour la coloration et la déshydratation de l’alcool33,36. Cependant, il a été démontré que la suite de fixation chimique avec HPF / FS fournit un avantage distinct dans la préservation par rapport à la fixation chimique traditionnelle et la déshydratation de l’alcool seul40. La perte d’intégrité ultrastructurale observée dans les échantillons traditionnels de TEM semble moins liée à la fixation qu’à la déshydratation, qui se fait généralement en utilisant de l’alcool à température ambiante ou sur la glace, et peut conduire à l’extraction des lipides et des sucres40,41. Pour développer la méthode cryoAPEX, nous avons émis l’hypothèse que la fixation chimique et la réaction de peroxidase, suivies par HPF et FS, produiraient un résultat optimal en termes de préservation ultrastructurale.
Ici, nous présentons le protocole cryoAPEX, qui combine apEX2 marquage avec des méthodes de cryofixation et de substitution de gel (Figure 1). Ce protocole simple se compose de la transfection d’une protéine APEX2-étiquetée d’intérêt, de fixation chimique des cellules, et de la réaction de peroxidase. HPF et FS sont ensuite effectués suivis de l’encastrage typique de résine et de la section mince. L’imagerie TEM révèle une excellente préservation de l’ultrastructure à l’aide de cette méthode. En outre, la localisation subcellulaire à haute résolution et la distribution spatiale d’une protéine lumenal de réticulum endoplasmique (ER) ont été observées. Cette méthode est largement utile pour la détection de la localisation des protéines membranaires dans les cellules pour l’analyse de la microscopie électronique. Dans nos mains, la méthode a fonctionné avec succès pour une variété de lignées cellulaires cultivées dans la culture tissulaire, y compris HEK-293T (rein embryonnaire humain), HeLa (cancer du col de l’utérus humain), Cos7 (fibroblaste de rein de singe vert africain), et BHK (rein de hamster bébé). Des instructions détaillées sont décrites ci-dessous à l’aide de cellules HEK-293T.

<table><tbody><tr><td>3,3'-diaminobenzidine tétrachlorhydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Acétone (verre distillé)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>10016</td><td></td></tr><tr><td>Béchers ; Plastique, jetable 120 cc</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>60952</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Flacons de stockage cryogénique, 2 mL</td><td>VWR</td><td>82050-168</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, monocomposant A, M résine époxy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44611-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, monocomposant B, durcisseur 964</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44612-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, monocomposant C, accélérateur 960 (DY 060)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44613-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, monocomposant D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44614-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Moule d’enrobage, plat standard, 14 mm x 5 mm x 6 mm</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>70901</td><td></td></tr><tr><td>Moule d’encastrement, plat standard, 14 mm x 5 mm x 4 mm</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>70900</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal de bovin ; Nu-Serum IV Supplément de milieu de croissance</td><td>Corning</td><td>355104</td><td></td></tr><tr><td>Couteaux en verre Boats, 6,4 mm</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>71008</td><td></td></tr><tr><td>Couteau en verre</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM KMR3</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde 10 % Solution aqueuse</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293 Cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Congélateur haute pression avec système de transfert rapide</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM PACT2</td><td>Produit archivé Remplacé par Leica EM ICE</td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène 30 % solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-266-27</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Réactif de transfection</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Support de membrane pour EM PACT2, 1,5 mm x 0,1 mm</td><td>Mager Scientific</td><td>16707898</td><td></td></tr><tr><td>Tétroxyde d’osmium, cristallin</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS) 20X, Ultra Pure Grade</td><td>VWR</td><td>97062-950</td><td></td></tr><tr><td>Capsules en plastique pour AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm</td><td>Mager Scientific</td><td>16702738</td><td></td></tr><tr><td>Grilles à fentes, 2 x 1 mm en cuivre avec film de support Formvar</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>FF2010-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Tampon cacodylate de sodium, 0,2 m, pH 7,4</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>102090-962</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium, granulés 500 g (ACS)</td><td>Avantor Macron Fine Chemicals</td><td>7708-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie électronique à</td><td>acide tannique</td><td>Sciences 21710</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture tissulaire, polystyrène, stérile, Corning, 100 mm</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>Bandes de</td> <td>couteau en verreMicroscopie électronique Sciences</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’uranyle dihydraté</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

méthode cryoapex pour l’analyse de la microscopie électronique de la localisation des protéines membranaires dans les cellules ultrastructuralement conservées

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Les événements cellulaires clés comme la transduction du signal et le trafic de membranes dépendent d’un emplacement approprié des protéines dans les compartiments cellulaires. Comprendre la localisation sous-cellulaire précise des protéines est donc important pour répondre à de nombreuses questions biologiques. La recherche d’un label robuste pour identifier la localisation des protéines combinée à une conservation cellulaire adéquate et la coloration a été historiquement difficile. Les progrès récents de la microscopie électronique (EM) ont mené au développement de nombreuses méthodes et stratégies visant à accroître la préservation cellulaire et les protéines cibles d’étiquettes. ApEX2, une étiquette génétique relativement nouvelle à base de peroxidase, est un chef de file prometteur dans le domaine des étiquettes actives em.- cloables. La préparation de l’échantillon pour la microscopie électronique de transmission (TEM) a également progressé ces dernières années avec l’avènement de la cryofixation par congélation à haute pression (HPF) et la déshydratation à basse température et la coloration par substitution par congélation (FS). HPF et FS fournissent une excellente conservation de l’ultrastructure cellulaire pour l’imagerie TEM, en second lieu seulement à la cryo-imagerie directe des échantillons vitreux. Ici, nous présentons un protocole pour la méthode cryoAPEX, qui combine l’utilisation de l’étiquette APEX2 avec HPF et FS. Dans ce protocole, une protéine d’intérêt est étiquetée avec APEX2, suivie de la fixation chimique et de la réaction de peroxidase. Au lieu de la coloration traditionnelle et de la déshydratation de l’alcool à température ambiante, l’échantillon est cryofixe et subit une déshydratation et une coloration à basse température via FS. À l’aide de cryoAPEX, non seulement une protéine d’intérêt peut être identifiée dans les compartiments subcellulaires, mais aussi des informations supplémentaires peuvent être résolues en ce qui concerne sa topologie au sein d’une membrane structurellement préservée. Nous montrons que cette méthode peut fournir une résolution assez élevée pour déchiffrer les modèles de distribution de protéines dans un lumen organelle, et pour distinguer la compartimentation d’une protéine dans un organite à proximité d’autres organelles non étiquetées. En outre, cryoAPEX est procéduralement simple et favorable aux cellules cultivées dans la culture de tissu. Il n’est pas plus difficile techniquement que les méthodes typiques de cryofixation et de substitution de gel. CryoAPEX est largement applicable pour l’analyse TEM de toute protéine membranaire qui peut être génétiquement étiquetée.

Afin de comparer la conservation ultrastructurale utilisant la méthode cryoAPEX avec la fixation et la déshydratation traditionnelles, nous avons préparé des échantillons dans lesquels une membrane de réticulum endoplasmique (ERM ; ER membrane) peptide a été marqué avec APEX2 et transfecté dans les cellules HEK-293T. ERM-APEX2 localise à la face cytoplasmique de l’ER et transforme la structure ER en structures morphologiquement distinctes connues sous le nom d’ER lisse organisée (OSER)34,</su...

Ce protocole décrit la méthode cryoAPEX, dans laquelle une protéine de membrane APEX2-étiquetée peut être localisée par microscopie électronique de transmission dans l’ultrastructure optimale-préservée de cellules.

Méthode CryoAPEX pour l’analyse de la microscopie électronique de la localisation des protéines membranaires dans les cellules ultrastructuralement conservées

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Cette méthode combine la capacité de tacher pour une protéine membranaire tout en préservant l’intégrité de la membrane et l’architecture subcellulaire. Il est donc très puissant pour localiser avec précision une protéine associée à la membrane. Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine l’utilisation d’une étiquette génétiquement clonable robuste, APEX2, avec des méthodes de pointe dans la préservation cellulaire de la microscopie électronique, y compris la cryofixation et la substitution par gel.Ensemble, ceux-ci permettent une localisation précise des protéines au sein d’une cellule bien conservée. Ce protocole peut être utilisé pour disséquer les mécanismes par lesquels les virus se répliquent à l’intérieur de la cellule hôte. Les virus détournent souvent les protéines hôtes pendant leur système d’infection.Les virus sont les petits génomes, qu’ils utilisent pour se répliquer à l’intérieur de ces cellules hôtes. Récemment, nous avons été en mesure de dans des données non publiées, étiqueter ces protéines en utilisant cette technologie pour comprendre comment les virus se répliquent. Cette technique s’est avérée vraiment critique dans une étude collaborative récente sur une toxine bactérienne qui cause la dégradation du golgi.En utilisant cryoAPEX, nous avons été en mesure de localisér précisément la toxine avec les morceaux fragmentés golgi, quelque chose qui était vraiment difficile à voir autrement en utilisant des techniques normales d’immunofluorescence. Elaine Mihelc, étudiante aux cycles supérieurs et associée de recherche stephanie Angel, de nos laboratoires, démontrera cette technique. Après l’ensemencement des cellules HEK293 dans le plat, transfecter les cellules avec apex2 marqués plasmides d’expression mammifère à l’aide d’un réaccélément transfection selon les directives du fabricant.À 12-15 heures après la transfection, laver les cellules une fois avec PBS. Ensuite, lavez les cellules avec PBS du plat dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugeuse à 500 x g pendant cinq minutes.Retirez soigneusement le supernatant et suspendez la pastille en deux millilitres de glutaraldehyde de 2 % et de tampon cacodylate de sodium molaire à 7,4 pH à température ambiante. Déposer l’échantillon sur la glace pour l’incuber pendant 30 minutes. Ensuite, pelleter l’échantillon à 500 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Lavez la pastille trois fois pendant cinq minutes chacune avec deux millilitres de tampon de cacodylate de sodium molaire de 0,1 molaire en centrifugant à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, retirer le supernatant. Pour effectuer la réaction de peroxyde, lavez la pastille en la suspendant en trois millilitres de solution DAB suivie d’un granulé à 500 x g pendant cinq minutes.Ensuite, suspendez la pastille en trois millilitres de solution DAB avec peroxyde d’hydrogène de 5,88 millimlaires. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante. La pastille devient visiblement de couleur brune, ce qui indique la présence du produit de réaction insoluble DAB.Après lavage à nouveau avec tampon cacodylate de sodium dans le DMEM, selon le manuscrit, re-suspendre la pastille cellulaire dans 500 microlitres d’une solution cryoprotectrice de DMEM contenant 10% sérum bovin fœtal et 15% albumine de sérum bovin. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse de 0,5 millilitre. Pellet à nouveau, augmentant légèrement la vitesse de centrifugeuse de 500 x g.Jetez la majorité du supernatant, en veillant à ce qu’il reste suffisamment de liquide pour que la pastille ne se dessèche pas. Évacuez tout liquide restant de la pastille cellulaire à l’aide du coin d’un lingette de laboratoire ou d’une serviette en papier. Laissez suffisamment de liquide rester pour que la pastille forme une pâte, semblable en consistance au dentifrice.Aspirez deux à trois microlitres de la pastille cellulaire et déposez-la sur un porte-membrane. Remplissez complètement le puits du porteur de la membrane de sorte que la tension de surface crée un léger dôme sur le dessus. Faites glisser le porte-membrane dans la cartouche et fixez-le.Placez la cartouche dans la machine HPF qui a été préparé et amorcé et appuyez sur commencer à geler. En gardant les cartouches immergées dans de l’azote liquide, retirez le porte-membrane de sa cartouche. Placer dans une capsule en plastique et placer la capsule en plastique dans un Cryovial plein d’azote liquide.Dans une hotte chimique, préparer un millilitre par échantillon de la solution de 0,2% de poids par volume d’acide tannique et 5%DI d’eau dans l’acétone dans un Cryovial. Placez-les dans de l’azote liquide pour les congeler. Placez le mélange de substitution de gel d’un flacon et les Cryovials contenant les granules de cellules congelées dans la chambre d’échantillon des unités de substitution de gel.Transférer la capsule interne contenant le porteur de la membrane du flacon d’azote liquide dans le flacon correspondant contenant le mélange de substitution de gel un. Commencez un protocole de substitution de gel à 90 degrés Celsius. Après 24 heures, mettre en pause la substitution de gel et laver les échantillons trois fois pendant cinq minutes avec de l’acétone refroidie à 90 degrés Celsius.Ensuite, dans une hotte chimique, préparer un millilitre par échantillon d’une solution de 1% de tétoxyde d’osmium, 0,2% d’acétate d’uranyle, et 5% d’eau DI dans l’acétone dans un Cryovial et les placer dans de l’azote liquide pour geler. Placez les Cryovials avec le mélange de substitution de gel deux dans l’unité de substitution de gel et transférez les capsules du troisième lavage d’acétone dans le mélange de substitution de gel deux flacons. Incubez-les et mélangez-les pendant 72 heures à 90 degrés Celsius, suivis d’un réchauffement graduel à zéro degré Celsius sur 12-18 heures.Maintenir la température à zéro degré Celsius et ajouter de l’acétone pré-refroidie dans les flacons pour les laver trois fois pendant 10 minutes chacune. Préparer un mélange de résine de choix dans un bécher en plastique selon les instructions du fabricant et ajouter 2%4% et 8% de résine dans les flacons pour immerger les capsules. Incuber pendant deux heures chacun à zéro degré Celsius.Ensuite, incuber en 15%30%60%90% et 100% résine composants de A, B, et D seulement pendant quatre heures chacun à température ambiante. Après les 20 heures, préparer un mélange de résine composants A, B, C et D et incuber pendant quatre heures. Placez les porteurs de membrane avec le côté de granule de cellules vers le haut dans les moules plats d’intégration et remplissez avec le mélange de résine A, B, C, et D.Placez-les dans un four pour polymériser à 60 degrés Celsius pendant 24-36 heures.Après la polymérisation, retirez les blocs du moule et placez l’échantillon dans le mandrin vertical de l’ultra microtome où il peut être visualisé avec grossissement. Séparez le porteur de membrane du bloc par une combinaison d’azote liquide de tamponnage sur le porteur de membrane pour séparer le métal du plastique, et utilisant une lame de rasoir pour ébrécher loin la résine autour du porteur de membrane. Une fois séparé, soulevez doucement le porteur de membrane, laissant le dôme de granule de cellule sur la face du bloc.Placez le bloc avec la pastille de cellules exposées orientée vers le haut dans un moule plat d’intégration qui est légèrement plus profond que le premier moule et remplissez avec des composants de résine A, B, C, et D.Polymériser à 60 degrés Celsius pendant 24-36 heures. Coupez le bloc autour de la pastille cellulaire à l’aide d’une lame de rasoir. Placez ensuite le bloc dans le mandrin de l’échantillon sur le bras sectionnant d’un ultra microtome.À l’aide d’un couteau en verre ou en diamant, taillez le bloc en forme trapézoïde qui entoure étroitement la pastille cellulaire. Obtenez des sections ultra minces de 90 nanomètres de la pastille cellulaire à l’aide d’un couteau en verre ou en diamant. Ramassez un ruban de sections sur une grille TEM.Séchez la grille en buvant le bord sur un morceau de papier filtre et rangez-le dans une boîte de stockage de grille TEM. Montez la grille sur le support TEM et placez le support dans le microscope. Utilisez un Tecnai T12 à 80 kilovolts pour le criblage d’échantillons cryoAPEX.Acquérir des images de cellules et de structures subcellulaires d’intérêt avec l’étiquetage APEX2. Dans cette étude, la préparation de l’échantillon par les méthodes traditionnelles apex a abouti à l’étiquetage clair des structures de réticulum endoplasmiques organisées et lisses. Au grossissement élevé, les membranes empilées sont apparues ébouriffées et des lacunes non uniformes étaient présentes entre les densités concentriques de membrane, indiquant la conservation pauvre de membrane et l’extraction de lipide.L’échantillon préparé par cryoAPEX a également eu l’étiquetage clairement défini des structures organisées et lisses de réticulum endoplasmique, cependant, les membranes étaient lisses et parallèles et peu ou pas d’extraction de lipide a été vue. L’analyse de TEM des sections minces de 90 nanomètres a indiqué que la protéine E interagissant de levure de Huntington était présente dans tout le réticulum endoplasmique périphérique aussi bien que l’enveloppe nucléaire. En outre, la protéine E interagissant avec la levure Huntington a été résolue dans des foyers régulièrement espacés le long de la membrane luminale du réticulum endoplasmique.La distribution et les foyers de protéine E interagissant avec la levure de Huntington étaient également visibles dans un échantillon préparé avec la fixation et la déshydratation traditionnelles. Cependant, la perturbation et l’extraction étendues de membrane étaient présentes, rendant l’échantillon sous-optimal. L’étiquetage APEX2 a été effectué à l’aide de trois marqueurs cellulaires, dont mito-V5-APEX2 a fourni la coloration spécifique des mitochondries seulement et CAAX-APEX2 a produit la coloration distincte de la membrane de plasma seulement.Aucun étiquetage n’a été observé dans les organites intracellulaires. La coloration du lumen golgi a également été évaluée à l’aide d’un marqueur Alpha MAN2-APEX2 tel que décrit dans notre manuscrit original de Sengupta et al. Après cette procédure, des méthodes tridimensionnelles telles que la tomographie électronique ou la microscopie électronique focalisée de balayage de faisceau d’ion peuvent être exécutées afin d’étudier la distribution 3D d’une protéine d’intérêt.Bon nombre des produits chimiques utilisés dans ce protocole sont toxiques, de sorte qu’avant utilisation, les fiches de données sur la sécurité devraient être consultées pour s’assurer que les produits chimiques sont manipulés à l’aide d’un équipement de protection individuelle approprié et éliminés conformément aux lignes directrices institutionnelles.

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Source : Schönherr, S., et. al. Immunomarquage combiné de l’optogénétique et de la réplique de congélation-fracture pour examiner l’arrangement spécifique à l’entrée des récepteurs du glutamate dans l’amygdale de la souris. J. vis. exp. (2016)Cette vidéo démontre l’immunomarquage de répliques de tissu cérébral de souris fracturées par congélation pour la microscopie électronique. Les répliques fracturées et enrobées sont digérées pour exposer les récepteurs. Des anticorps primaires et...

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Découvrez la méthode cryoAPEX pour localiser les protéines membranaires marquées par APEX2 en microscopie électronique à transmission, préservant l'ultrastructure cellulaire dans les cellules HEK293.

Méthode CryoAPEX pour l’analyse de la microscopie électronique de la localisation des protéines membranaires dans les cellules ultrastructuralement conservées (Vidéo) | JoVE Journal

Méthode CryoAPEX pour l’analyse de la microscopie électronique de la localisation des protéines membranaires dans les cellules ultrastructuralement conservées

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