Méthode CryoAPEX pour l’analyse de la microscopie électronique de la localisation des protéines membranaires dans les cellules ultrastructuralement conservées

Cette méthode combine la capacité de tacher pour une protéine membranaire tout en préservant l’intégrité de la membrane et l’architecture subcellulaire. Il est donc très puissant pour localiser avec précision une protéine associée à la membrane. Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine l’utilisation d’une étiquette génétiquement clonable robuste, APEX2, avec des méthodes de pointe dans la préservation cellulaire de la microscopie électronique, y compris la cryofixation et la substitution par gel.

Ensemble, ceux-ci permettent une localisation précise des protéines au sein d’une cellule bien conservée. Ce protocole peut être utilisé pour disséquer les mécanismes par lesquels les virus se répliquent à l’intérieur de la cellule hôte. Les virus détournent souvent les protéines hôtes pendant leur système d’infection.

Les virus sont les petits génomes, qu’ils utilisent pour se répliquer à l’intérieur de ces cellules hôtes. Récemment, nous avons été en mesure de dans des données non publiées, étiqueter ces protéines en utilisant cette technologie pour comprendre comment les virus se répliquent. Cette technique s’est avérée vraiment critique dans une étude collaborative récente sur une toxine bactérienne qui cause la dégradation du golgi.

En utilisant cryoAPEX, nous avons été en mesure de localisér précisément la toxine avec les morceaux fragmentés golgi, quelque chose qui était vraiment difficile à voir autrement en utilisant des techniques normales d’immunofluorescence. Elaine Mihelc, étudiante aux cycles supérieurs et associée de recherche stephanie Angel, de nos laboratoires, démontrera cette technique. Après l’ensemencement des cellules HEK293 dans le plat, transfecter les cellules avec apex2 marqués plasmides d’expression mammifère à l’aide d’un réaccélément transfection selon les directives du fabricant.

À 12-15 heures après la transfection, laver les cellules une fois avec PBS. Ensuite, lavez les cellules avec PBS du plat dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugeuse à 500 x g pendant cinq minutes.

Retirez soigneusement le supernatant et suspendez la pastille en deux millilitres de glutaraldehyde de 2 % et de tampon cacodylate de sodium molaire à 7,4 pH à température ambiante. Déposer l’échantillon sur la glace pour l’incuber pendant 30 minutes. Ensuite, pelleter l’échantillon à 500 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Lavez la pastille trois fois pendant cinq minutes chacune avec deux millilitres de tampon de cacodylate de sodium molaire de 0,1 molaire en centrifugant à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, retirer le supernatant. Pour effectuer la réaction de peroxyde, lavez la pastille en la suspendant en trois millilitres de solution DAB suivie d’un granulé à 500 x g pendant cinq minutes.

Ensuite, suspendez la pastille en trois millilitres de solution DAB avec peroxyde d’hydrogène de 5,88 millimlaires. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante. La pastille devient visiblement de couleur brune, ce qui indique la présence du produit de réaction insoluble DAB.

Après lavage à nouveau avec tampon cacodylate de sodium dans le DMEM, selon le manuscrit, re-suspendre la pastille cellulaire dans 500 microlitres d’une solution cryoprotectrice de DMEM contenant 10% sérum bovin fœtal et 15% albumine de sérum bovin. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse de 0,5 millilitre. Pellet à nouveau, augmentant légèrement la vitesse de centrifugeuse de 500 x g.

Jetez la majorité du supernatant, en veillant à ce qu’il reste suffisamment de liquide pour que la pastille ne se dessèche pas. Évacuez tout liquide restant de la pastille cellulaire à l’aide du coin d’un lingette de laboratoire ou d’une serviette en papier. Laissez suffisamment de liquide rester pour que la pastille forme une pâte, semblable en consistance au dentifrice.

Aspirez deux à trois microlitres de la pastille cellulaire et déposez-la sur un porte-membrane. Remplissez complètement le puits du porteur de la membrane de sorte que la tension de surface crée un léger dôme sur le dessus. Faites glisser le porte-membrane dans la cartouche et fixez-le.

Placez la cartouche dans la machine HPF qui a été préparé et amorcé et appuyez sur commencer à geler. En gardant les cartouches immergées dans de l’azote liquide, retirez le porte-membrane de sa cartouche. Placer dans une capsule en plastique et placer la capsule en plastique dans un Cryovial plein d’azote liquide.

Dans une hotte chimique, préparer un millilitre par échantillon de la solution de 0,2% de poids par volume d’acide tannique et 5%DI d’eau dans l’acétone dans un Cryovial. Placez-les dans de l’azote liquide pour les congeler. Placez le mélange de substitution de gel d’un flacon et les Cryovials contenant les granules de cellules congelées dans la chambre d’échantillon des unités de substitution de gel.

Transférer la capsule interne contenant le porteur de la membrane du flacon d’azote liquide dans le flacon correspondant contenant le mélange de substitution de gel un. Commencez un protocole de substitution de gel à 90 degrés Celsius. Après 24 heures, mettre en pause la substitution de gel et laver les échantillons trois fois pendant cinq minutes avec de l’acétone refroidie à 90 degrés Celsius.

Ensuite, dans une hotte chimique, préparer un millilitre par échantillon d’une solution de 1% de tétoxyde d’osmium, 0,2% d’acétate d’uranyle, et 5% d’eau DI dans l’acétone dans un Cryovial et les placer dans de l’azote liquide pour geler. Placez les Cryovials avec le mélange de substitution de gel deux dans l’unité de substitution de gel et transférez les capsules du troisième lavage d’acétone dans le mélange de substitution de gel deux flacons. Incubez-les et mélangez-les pendant 72 heures à 90 degrés Celsius, suivis d’un réchauffement graduel à zéro degré Celsius sur 12-18 heures.

Maintenir la température à zéro degré Celsius et ajouter de l’acétone pré-refroidie dans les flacons pour les laver trois fois pendant 10 minutes chacune. Préparer un mélange de résine de choix dans un bécher en plastique selon les instructions du fabricant et ajouter 2%4% et 8% de résine dans les flacons pour immerger les capsules. Incuber pendant deux heures chacun à zéro degré Celsius.

Ensuite, incuber en 15%30%60%90% et 100% résine composants de A, B, et D seulement pendant quatre heures chacun à température ambiante. Après les 20 heures, préparer un mélange de résine composants A, B, C et D et incuber pendant quatre heures. Placez les porteurs de membrane avec le côté de granule de cellules vers le haut dans les moules plats d’intégration et remplissez avec le mélange de résine A, B, C, et D.Placez-les dans un four pour polymériser à 60 degrés Celsius pendant 24-36 heures.

Après la polymérisation, retirez les blocs du moule et placez l’échantillon dans le mandrin vertical de l’ultra microtome où il peut être visualisé avec grossissement. Séparez le porteur de membrane du bloc par une combinaison d’azote liquide de tamponnage sur le porteur de membrane pour séparer le métal du plastique, et utilisant une lame de rasoir pour ébrécher loin la résine autour du porteur de membrane. Une fois séparé, soulevez doucement le porteur de membrane, laissant le dôme de granule de cellule sur la face du bloc.

Placez le bloc avec la pastille de cellules exposées orientée vers le haut dans un moule plat d’intégration qui est légèrement plus profond que le premier moule et remplissez avec des composants de résine A, B, C, et D.Polymériser à 60 degrés Celsius pendant 24-36 heures. Coupez le bloc autour de la pastille cellulaire à l’aide d’une lame de rasoir. Placez ensuite le bloc dans le mandrin de l’échantillon sur le bras sectionnant d’un ultra microtome.

À l’aide d’un couteau en verre ou en diamant, taillez le bloc en forme trapézoïde qui entoure étroitement la pastille cellulaire. Obtenez des sections ultra minces de 90 nanomètres de la pastille cellulaire à l’aide d’un couteau en verre ou en diamant. Ramassez un ruban de sections sur une grille TEM.

Séchez la grille en buvant le bord sur un morceau de papier filtre et rangez-le dans une boîte de stockage de grille TEM. Montez la grille sur le support TEM et placez le support dans le microscope. Utilisez un Tecnai T12 à 80 kilovolts pour le criblage d’échantillons cryoAPEX.

Acquérir des images de cellules et de structures subcellulaires d’intérêt avec l’étiquetage APEX2. Dans cette étude, la préparation de l’échantillon par les méthodes traditionnelles apex a abouti à l’étiquetage clair des structures de réticulum endoplasmiques organisées et lisses. Au grossissement élevé, les membranes empilées sont apparues ébouriffées et des lacunes non uniformes étaient présentes entre les densités concentriques de membrane, indiquant la conservation pauvre de membrane et l’extraction de lipide.

L’échantillon préparé par cryoAPEX a également eu l’étiquetage clairement défini des structures organisées et lisses de réticulum endoplasmique, cependant, les membranes étaient lisses et parallèles et peu ou pas d’extraction de lipide a été vue. L’analyse de TEM des sections minces de 90 nanomètres a indiqué que la protéine E interagissant de levure de Huntington était présente dans tout le réticulum endoplasmique périphérique aussi bien que l’enveloppe nucléaire. En outre, la protéine E interagissant avec la levure Huntington a été résolue dans des foyers régulièrement espacés le long de la membrane luminale du réticulum endoplasmique.

La distribution et les foyers de protéine E interagissant avec la levure de Huntington étaient également visibles dans un échantillon préparé avec la fixation et la déshydratation traditionnelles. Cependant, la perturbation et l’extraction étendues de membrane étaient présentes, rendant l’échantillon sous-optimal. L’étiquetage APEX2 a été effectué à l’aide de trois marqueurs cellulaires, dont mito-V5-APEX2 a fourni la coloration spécifique des mitochondries seulement et CAAX-APEX2 a produit la coloration distincte de la membrane de plasma seulement.

Aucun étiquetage n’a été observé dans les organites intracellulaires. La coloration du lumen golgi a également été évaluée à l’aide d’un marqueur Alpha MAN2-APEX2 tel que décrit dans notre manuscrit original de Sengupta et al. Après cette procédure, des méthodes tridimensionnelles telles que la tomographie électronique ou la microscopie électronique focalisée de balayage de faisceau d’ion peuvent être exécutées afin d’étudier la distribution 3D d’une protéine d’intérêt.

Bon nombre des produits chimiques utilisés dans ce protocole sont toxiques, de sorte qu’avant utilisation, les fiches de données sur la sécurité devraient être consultées pour s’assurer que les produits chimiques sont manipulés à l’aide d’un équipement de protection individuelle approprié et éliminés conformément aux lignes directrices institutionnelles.