Name: Protozoa Parazit Enfeksiyonunda Primer Astrosit ve Mikroglianın Eşlik Etmesinin İzole Edilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Keşfedin, yeni doğan fare kortekslerinden astrosit ve mikroglia hücrelerinin paralel izolasyonu ve protozoa parazit enfeksiyonlarında karşılaştırmalı çalışmalar için kullanımı.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

São Paulo Federal Üniversitesi'nden (UNIFESP) MAb 2C2 anti-Ssp-4 için Profesör Dr. Renato A. Mortara'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, 2017/25942-0 k.r.b.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, hibe 402100/2016-6 K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/ CNPq) ve Coordenação de Aperfeiçamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Finans Kodu 001). M.P.A. CNPq'tan burs, A.L.O.P. CAPES'ten burs, I.S.F ve L.Z.M.F.B. FAPESP'ten burs alır.

Farelerle ilgili tüm deneysel prosedürler Brezilya Ulusal Kanunu'na (11.794/2008) uygun olarak gerçekleştirilmiştir ve São Paulo Federal Üniversitesi (UNIFESP) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Glial Hücre Çıkarma, Bakım ve Dissociation
NOT: Glial hücre ekstraksiyonu için kullanılan fare sayısı istenilen deneyleri gerçekleştirmek için gereken hücre miktarına bağlıdır. Bu protokolde altı neonatal C57BL/6 fareden toplam 2.7 x 107 astrosit ve 4 x 106 mikroglia elde edildi. Tüm işlemler sınıf II biyogüvenlik kabininde steril koşullar altında gerçekleştirildi.
<ol><li>1. Gün
	<ol>
<li>Saf Hank'in dengeli tuz çözeltisini (HBSS) ve HBSS + ısıya inaktive edilmiş fetal büyükbaş serumun (FBS) %10'u hazırlayın (bkz. Malzemeler Tablosu).</li>
		<li>Tamamlanmış Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) (DMEM)/F12 (%10 FBS + 0,08 mM Penisilin + 0,09 mM Streptomycin + 12,5 mM HEPES + 30 mM sodyum bikarbonat, pH 7,2) ve 0,22 μm filtre ile filtreleyin (Bkz. Malzeme Tablosu). NOT: Tüm kültür ortamları 4 °C'de saklanmalıdır, ancak deneye başlamadan önce 37 °C'de 20 dakika önceden ısıtılmalıdır.</li>
		<li>Tüm cerrahi aletleri (makas, spatula ve cımbız) bir otoklavda sterilize edin ve işlem sırasında %70 etanol kullanın.</li>
		<li>Derin anestezi için 5 dakika boyunca isofluran ile ıslatılmış pamuk içeren kapalı bir odaya yeni doğanlar (en fazla 3 günlük) fareler koyun.</li>
		<li>Sprey fare yavrusu% 70 etanol ile ve makas ile hayvan decapitate.</li>
		<li>Sagittal kesim olun (anterior posterior) kafatası boyunca makas ile açmak ve beyin ortaya çıkarmak için. Kafatasını cımbızla beyinden ayırın. Beyin bütünlüğünü korumak için bir mikro spatula kullanarak beyin çıkarın.</li>
		<li>Kuru bir Petri kabı (6 cm çapında) beyin yerleştirin. Bir mikro spatula kullanarak koku ampul ve beyincik çıkarın. Korteksi HBSS + %10 FBS (2 mL/Petri kabı) içeren başka bir Petri kabına (6 cm çapında) taşıyın.</li>
		<li>Steril makas ile küçük parçalar halinde beyin dokusu kesin ve farklı 15 mL konik tüpler için HBSS + 10% FBS ile her beyin dokusu transferi bir p1000 mikropipet kullanarak. Son hacmin 2 mL/tüp olduğundan emin olun. Değilse, HBSS + 10% FBS ile tamamlayın. NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Bu nedenle, CNS dokusuna sahip konik tüpler 1 saate kadar buz üzerine yerleştirilmelidir.</li>
		<li>Kesilen beyin dokusunu 3 mL HBSS + %10 FBS (tüp başına) ve dekantasyon sonrası yıkayın. Dikkatle supernatant çıkarın. Bu adımı 3 kez tekrarlayın. NOT: Bu adım, enkaz kaldırmak ve çıkarılan doku kurtarmak için amaçlamaktadır.</li>
		<li>Kesilen beyin dokusunu 3 mL saf HBSS (tüp başına) ile yıkayın ve dekantasyondan sonra supernatant'ı dikkatlice çıkarın. Bu adımı 3 kez tekrarlayın. NOT: Bu adım, bir sonraki adımda hücreler deneneceği için kalan serumu önceki yıkarlardan çıkarmayı amaçlar.</li>
		<li>Tüp başına 3 mL tripsin ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 °C'de bir su banyosuna yerleştirin, her 5 dakikada bir tüpleri hafifçe sallayın. NOT: Bu adım toplanan dokusi sindirmeyi amaçlamaktadır.</li>
		<li>Tripsinin inaktive etmek için, HBSS tüp başına 3 mL ile doku yıkayın + 10% FBS ve, doku dekantasyon sonra, dikkatle supernatant çıkarın. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.</li>
		<li>Saf HBSS tüpü başına 3 mL ile doku yıkayın ve dikkatle supernatant çıkarın. Bu adımı 2 kez tekrarlayın.</li>
		<li>Saf HBSS tüpü başına 7 mL ekleyin ve pipetler ardışık geçitler yoluyla doku homojenize: ilk 10 mL serolojik pipet ile, 5 mL ve son olarak p1000 micropipette ile takip.</li>
		<li>Homojenizasyondan sonra 4 °C'de 450 x g'de 5 dk santrifüj tüpleri.</li>
		<li>Supernatant atın ve tüp başına HBSS 4 mL +% 10 FBS ile pelet resuspend.</li>
		<li>Hücreleri en uygun hücre kültürü yapışması için önceden işlenmiş bir T-75 şişesine aktarın (bkz. Malzemeler Tablosu). NOT: Şişe başına her hayvandan doku işleme.</li>
		<li>Şişeyi 37 °C'de kuvöze yerleştirin ve yapışma için 30 dakika boyunca %5 CO2'ye yerleştirin.</li>
		<li>Şişe başına 10 mL ilave DMEM/F12 ekleyin ve 37 °C ve %5 CO2'dekuluçkaya yatırın. NOT: Son hacim şişe başına 14 mL'dir.</li>
	</ol></li>
	<li>3. Gün
	<ol>
<li>T-75 şişesinden 7 mL kültür ortamını çıkarın ve 7 mL taze takviyeli DMEM/F12 ekleyin. NOT: Şişeler hücresel enkaz ve bulutlu bir görünüm bir sürü içerecektir.</li>
	</ol></li>
	<li>5. Gün
	<ol>
<li>T-75 şişesinden tüm ortamı çıkarın ve 14 mL taze takviyeli DMEM/F12 ekleyin. NOT: Orta enkaz ve non-yapışık hücreleri kaldırmak için şişelerden değiştirilir.</li>
		<li>Her 48 saat sonra, supernatant 6 mL çıkarın ve kültür 14 güne kadar taze takviye Lim/F12 orta 7 mL ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>14. Gün
	<ol>
<li>Supernatant 6 mL çıkardıktan ve taze takviye DMEM / F12 orta 7 mL ekledikten sonra, sıkıca T-75 şişeleri kapatın.</li>
		<li>Astrositlerden mekanik olarak mikroglia çıkarmak için 200 rpm ve 37 °C gecede yer orbital shaker yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>15. Gün
	<ol><li>Shaker gelen şişeleri alın ve şiddetle hücre ayrışması optimize etmek ve mikroglia maksimum sayıda hasat için kendi orta ile yıkayın. Daha sonra, supernatant toplamak (microglia içeren) ve 50 mL konik tüp aktarın.</li>
		<li>Daha sonra, astrositleri ayırmak için her şişeye 4 mL tripsin ekleyin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Tripsini inaktive etmek için eklenmiş DMEM/F12 şişesi başına 5 mL ekleyin. Şişeleri kendi ortamları ile yıkayın ve içindekileri 50 mL konik bir tüpe aktarın.</li>
		<li>4 5 dakika 4 °C'de 450 x g'de ayrıştırılmış mikroglia ve astrosit içeren tüm tüpleri santrifüj edin.</li>
		<li>Supernatant atın. 1 mL'deki mikroglia peletini ve 10 mL'lik astrositleri takviye edilmiş DMEM/F12'de yeniden askıya alın.</li>
		<li>Neubauer odasında veya otomatik hücre sayacında hücre saymaya devam edin. Uygun bir düz alt hücre kültür plakası (optimal hücre eki için önceden tedavi edilir; malzemeler tablosunabakınız) istenilen yoğunlukta tamamlayıcı DMEM/F12 ile hücreleri plakalayın. Hücreleri 37 °C'de ve %5 CO2'de 24 saat boyunca inkülerler. NOT: Her hücre popülasyonunun 1,5 x 106'sını akış sitometrisi ile saflıklarını doğrulamak için ayırın.</li>
		<li>Hücre popülasyonlarının saflığını doğrulamak için akış sitometrik analizi yapın. NOT: Biz microglia CD11bdüşünün +/ CD45+/ GFAP- ve astrositler CD11b-/ CD45-/ GFAP+. Iba1 ve TMEM119 boyama mikroglia22'yitam olarak karakterize etmek için düşünülebilir.</li>
		<li>Akış sitometri testinin kontrolü olarak bir FMO (Floresan Eksi Bir)23 ve her hücre popülasyonu için lekesiz bir örnek (astrositler ve mikroglia) ekleyin.</li>
		<li>Her hücre popülasyonu için, her lekeli ve lekesiz numune için 5 x 105 hücre ayırın. FMO için, her biri 2,5 x 105 hücre içeren diğer iki mikroglia tüpünü rezerve edin ve ayrıca 5 x 105 astrositten oluşan başka bir tüp rezerve edin. NOT: Mikroglia sayıları sınırlayıcı bir faktör olabileceğinden, lekesiz ve FMO kontrolleri için daha az hücre kullanmak mümkündür.</li>
		<li>4 °C'de 5 dk için 450 x g'daki tüm mikrotüpleri santrifüj edin. Supernatant atın ve FACS tampon (fosfat tamponlu salin (PBS) + 0.5% sığır serum albumin (BSA) + 2 mM EDTA, pH 7.2) 500 μL/ mikrotüp ile pelet resuspend.</li>
		<li>4 °C'de 450 x g'daki tüm mikrotüpleri 5 dk. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka.</li>
		<li>Tüm mikrotüplere 500 μL/microtube FACS tampon ekleyin ve 4 °C'de 450 x g'de 5 dk. Süpernatant'ı atın. Resuspend astrositler ve mikroglia boyama tüpleri ve ayrıca yüzey belirteçleri 50 μL / mikrotüp ile astrosit FMO tüp karışımı: anti-CD45 (PE, klon 30-F11) ve anti-CD11b (eFluor 450, klon M1/70) (her ikisi de 1: 100 FACS tampon seyreltilmiş).</li>
		<li>Lekelenmemiş hücreler için, aynı FAKS arabelleği hacmiyle yeniden askıya alın. Microglia FMO için, her mikroglia tüpünü anti-CD45 veya anti-CD11b ile kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Mikrotüp başına 500 μL FACS tampon ekleyin. 4 °C'de 450 x g'de 5 dakika. Süpernatant'ı atın ve karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 100 μL/mikrotüp fiksasyon tamponu (Bkz. Malzeme Tablosunabakınız) ile peleti yeniden askıya alın.</li>
		<li>500 μL/mikrotüp permeabilizasyon tamponu 1x ekleyin (Bkz. Malzeme Tablosu)ve 4 °C'de karanlıkta 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>4 °C'de 4 °C'de 450 x g'daki tüm mikrotüpleri 5 dk. Resuspend astrositler ve mikroglia boyama tüpleri ve ayrıca mikroglia FMO tüpleri ile 50 μL/ mikrotüp hücre içi antikor anti-GFAP (APC, klon GA5) bir 1:100 seyreltme 1x permeabilizasyon tampon. Lekesiz hücreler ve astrosit FMO için, FACS arabelleği aynı hacimde hücreleri yeniden askıya. Tüm numuneleri karanlıkta 30 dk boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>500 μL/microtube 1x permeabilizasyon tamponu ekleyerek tüm tüpleri yıkayın. 450 x gtüm mikrotüpler santrifüj , 4 ° C'de 5 dakika için. 200 μL FACS tamponunda her mikrotüpü yeniden askıya alın. Akış sitometresi üzerinde 1 x 105 olay/örnek edinin.</li>
		<li>Analiz için, hücreler cd11b x CD45 ve daha sonra GFAP histogram ilk geçitli olmalıdır. NOT: Lekesiz ve FMO denetimleri kapıları belirlemek için yararlıdır.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Enfeksiyon Ve Enfeksiyon Oranlarının Değerlendirilmesi
<ol><li>T. gondii ile glial hücrelerin enfeksiyonu
	<ol>
<li>Plaka 3 x 104 mikroglia veya astrositler ile takviye DMEM/F12 37 °C ve 5% CO2 için 24 h önceden işlem görmüş 96-iyi düz plaka (Malzeme Tablosubakınız).</li>
		<li>Her hücre popülasyonuna T'den gelen takozitlerle bulaştırın. gondii RH suşu 1:1 (parazit:hücre) enfeksiyon çokluğu (MOI) ifade gondii RH suşu 200 μL / iyi takviye RPMI seyreltilmiş (%3 FBS + 0.16 mM Penisilin + 0.18 mM Streptomisin + 12.5 mM HEPES + 30 m sodyum bikarbonat, pH 7.2) (bkz. Malzemeler Tablosu). 37 °C'de ve %5 CO2'de 48 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Daha sonra, supernatant atın ve 100 μL / iyi% 1 paraformaldehit (PFA) PBS seyreltilmiş 4 ° C 24 saat ekleyerek hücreleri düzeltmek.</li>
		<li>PH 7.2'de PFA'yı 100 μL/well pBS ile değiştirin.</li>
		<li>PBS pH 7.2 (1:1.000) ile seyreltilmiş 50 μL/iyi DAPI (5 mg/mL) borusu ile süpernatant ve leke hücrelerinin çekirdeklerini dikkatlice çıkarın.</li>
		<li>DAPI boyama çözeltisini 100 μL/well pbs (pH 7.2) ile değiştirin ve floresan mikroskobu ile analiz edin.</li>
	</ol></li>
	<li>T. cruzi ile glial hücrelerin enfeksiyonu
	<ol>
<li>Plaka 3 x 104 mikroglia veya astrositler ile takviye DMEM/F12 37 °C ve 5% CO2 için 24 h önceden işlem görmüş 96-iyi düz plaka (Malzeme Tablosubakınız). NOT: Enfeksiyonun her zaman noktası için farklı bir plaka kullanın.</li>
		<li>Glial hücrelere T. cruzi Y suşundan gelen trypomastigotes ile 5:1 (parazit:hücre) 200 μL/iyi seyreltilmiş tamamlanır ve 37 °C'de inkübasyon ve 2 saat için %5 CO2. NOT: Bu adım parazit tarafından hücre istilası için önemlidir.</li>
		<li>Tüm supernatant çıkarın ve tüm ekstrasellüler parazitleri kaldırmak için takviye RPMI 200 μL / kuyu ekleyerek kuyuları yıkayın. Supernatant çıkarın ve taze takviye RPMI 200 μL / kuyu ekleyin. NOT: Bu adım, yapışık hücreleri işgal etmedi tüm parazitleri kaldırmak niyetinde.</li>
		<li>Glial hücrelerde T. cruzi replikasyon değerlendirmek için 2 saat, 48 h ve 96 h için enfekte hücreleri incubate11.</li>
		<li>Her zaman noktasından sonra, supernatant çıkarın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca metanol 100 μL / kuyu ile hücreleri düzeltmek ve sonra 100 μL / iyi PBS (pH 7.2) ile metanol değiştirin.</li>
		<li>Fiksasyondan sonra hücreleri immünoresans tadına aşağıdaki şekilde hazırlayın.<ol>
<li>Otofloresansı önlemek için hücreleri 100 μL/well 50 mM NH4Cl pbs (pH 8.0) ile 15 dk. 100 μL/well pbs ekleyerek hücreleri yıkayın ve hemen çıkarın (bu adımı 3 kez tekrarlayın).</li>
			<li>Daha sonra, 15 dk pbs seyreltilmiş% 0.5 Triton 100 μL / iyi ekleyerek hücreleri permeabilize. 100 μL / iyi PBS ekleyerek hücreleri yıkayın ve hemen kaldırın (bu adımı 3 kez tekrarlayın).</li>
			<li>Daha sonra hücre kültürünü 100 μL/well bloklama çözeltisi (%5 yağsız süt + %2 BSA PBS[pH 7.2]) ile oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. Hücreleri 100 μL/iyi PBS ekleyerek yıkayın ve hemen çıkarın (bu adımı 3 kez tekrarlayın).</li>
			<li>Amastigotları lekelemek için, 30 μL/well ticari olmayan monoklonal antikor (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 proteini (1:200) ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloklama çözeltisi seyreltilir.</li>
			<li>Hücreleri 100 μL/iyi PBS ekleyerek yıkayın ve hemen çıkarın (bu adımı 3 kez tekrarlayın). Plakayı 30 μL/well'de pbs'de oda sıcaklığında 1 saat boyunca seyreltilmiş ikincil anti-fare antikor (1:500) ile inkübe edin. NOT: Ticari olmayan mAb 2C2 anti-Ssp-4 proteini, São Paulo Federal Üniversitesi Mikrobiyoloji, İmmünoloji ve Parazitoloji Bölümü'nden Prof. Dr. Renato A. Mortara'nın bir hediyesidir.</li>
			<li>PBS pH 7.2 (1:1.000) ile karanlıkta oda sıcaklığında 1 dk için seyreltilmiş 50 μL/iyi DAPI (5 mg/mL) ekleyerek süpernatant ve leke çekirdeklerini dikkatlice çıkarın.</li>
			<li>DAPI boyama çözeltisini 100 μL/well pBS pH 7.2 ile değiştirin ve floresan mikroskopi ile analiz edin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Azevedo, F. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equal+numbers+of+neuronal+and+nonneuronal+cells+make+the+human+brain+an+isometrically+scaled-up+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).</li>
<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glia%2Fneuron+ratio%3A+How+it+varies+uniformly+across+brain+structures+and+species+and+what+that+means+for+brain+physiology+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution.</a> Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).</li>
<li>Jäkel, S., Dimou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+Cells+and+Their+Function+in+the+Adult+Brain%3A+A+Journey+through+the+History+of+Their+Ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).</li>
<li>Streit, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+as+neuroprotective%2C+immunocompetent+cells+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS.</a> Glia. 40 (2), 133-139 (2002).</li>
<li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).</li>
<li>Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVirchow%2C+R+%22Verlag+von+August+Hirschfeld%2C+Berlin%22">Verlag von August Hirschfeld, Berlin</a>. , (1858).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Samartino, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+abortus+induces+the+secretion+of+proinflammatory+mediators+from+glial+cells+leading+to+astrocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis.</a> American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).</li>
<li>Jamilloux, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammasome+activation+restricts+Legionella+pneumophila+replication+in+primary+microglial+cells+through+flagellin+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection.</a> Glia. 61 (4), 539-549 (2013).</li>
<li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li>
<li>Pacheco, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impairment+in+the+NLRP3-induced+NO+secretion+renders+astrocytes+highly+permissive+to+T.+cruzi+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication.</a> Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).</li>
<li>Stansley, B., Post, J., Hensley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+review+of+cell+culture+systems+for+the+study+of+microglial+biology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115(2012).</li>
<li>Lian, H., Roy, E., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+Primary+Microglial+Culture+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Protocol for Primary Microglial Culture Preparation.</a> Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).</li>
<li>Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+in+primary+rat+CNS+cells%3A+Differential+contribution+of+neurons%2C+astrocytes%2C+and+microglial+cells+for+the+intracerebral+development+and+stage+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation.</a> Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).</li>
<li>Chagas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nova+tripanozomiaze+humana%3A+estudos+sobre+a+morfolojia+e+o+ciclo+evolutivo+do+Schizotrypanum+cruzi+n.+gen.%2C+n.+sp.%2C+ajente+etiolojico+de+nova+entidade+morbida+do+homem%5BTitle%5D)+AND+%22Memorias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).</li>
<li>Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurologic+manifestations+of+the+neglected+tropical+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases.</a> Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).</li>
<li>Jones, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasmic+encephalitis+in+HIV-infected+persons%3A+risk+factors+and+trends.+The+Adult%2FAdolescent+Spectrum+of+Disease+Group%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group.</a> AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).</li>
<li>Luft, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasmic+Encephalitis+in+Patients+with+the+Acquired+Immunodeficiency+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).</li>
<li>Madalosso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chagasic+meningoencephalitis%3A+Case+report+of+a+recently+included+AIDS-defining+illness+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+do+Instituto+de+Medicina+Tropical+de+Sao+Paulo%22%5BJournal%5D)">Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil.</a> Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).</li>
<li>Rocha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+patients+with+Chagas%E2%80%99+disease+and+acquired+immunodeficiency+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).</li>
<li>Yasukawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Case+report%3A+Trypanosoma+cruzi+meningoencephalitis+in+a+patient+with+acquired+immunodeficiency+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+in+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Compensation in Flow Cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).</li>
<li>Silva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+astrocytes+with+TNF+enhances+their+susceptibility+to+Trypanosoma+cruzi+infection+and+creates+a+self-sustaining+inflammatory+milieu%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu.</a> Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).</li>
<li>Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honeybee+retinal+glial+cells+transform+glucose+and+supply+the+neurons+with+metabolic+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).</li>
<li>Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-site+energy+supply+at+synapses+through+monocarboxylate+transporters+maintains+excitatory+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission.</a> Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).</li>
<li>Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+astrogliosis+in+the+mouse+hypothalamus+in+response+to+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity.</a> Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).</li>
<li>Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+active+role+of+astrocytes+in+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The active role of astrocytes in synaptic transmission.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).</li>
<li>Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pathophysiological+Role+of+Microglia+in+Dynamic+Surveillance%2C+Phagocytosis+and+Structural+Remodeling+of+the+Developing+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191(2017).</li>
<li>Floden, A. M., Combs, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+repetitively+isolated+from+in+vitro+mixed+glial+cultures+retain+their+initial+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype.</a> Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).</li>
<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e50079(2013).</li>
<li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+refined+CD11b+magnetic+isolation+of+primary+microglia+with+enhanced+purity+and+versatility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55364(2017).</li>
<li>Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+microglia+isolation+from+mixed+glial+cell+cultures+of+neonatal+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3814(2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

İzole glial hücre fonksiyonlarını farklı biyolojik bağlamlarda incelemenin önemi son yirmi yılda artmaktadır. Nöronlar ötesinde CNS anlamak hala hücre biyolojisinde büyüyen bir alandır, özellikle enfeksiyonlar veya inflamatuar koşullar altında8,9,,24. Glial hücreler sadece nöronlar fiziksel destek için çok önemlidir (daha önce bilindiği gibi), ama aynı zamanda nöron enerji kaynağı gibi birçok fizyolojik durumlarda, nörometaboliz...

CNS esas olarak nöronlar ve glialhücrelerdenoluşur 1,2,3. Mikroglia ve astrositler CNS en bol glia hücreleridir. Mikroglia, yerleşik makrofaj, immünyonlu ve Fagositik glia hücre CNS3,4, astrosithomeostaz korumak ve destekleyici işlevleri uygulamak için sorumlu iken5.
Glial hücreler klasik destek ve nöronların korunması sorumlu olduğu bilinen olmasına rağmen6,7, Bu hücrelerin ortaya çıkan fonksiyonları son literatürde tarif edilmiştir, enfeksiyonlara yanıtları da dahil olmak üzere8,9,10,11. Böylece, bireysel olarak işlevlerini anlamak için bu glial hücreleri izole etmek için yöntemler geliştirmek için bir itme vardır.
Ölümsüzleştirilmiş hücre soyları ve in vivo modeller gibi birincil kültürler yerine glial hücreleri incelemek için bazı alternatif modeller vardır. Ancak, ölümsüzleştirilmiş hücreler genetik sürüklenme ve morfolojik değişikliklere uğrama olasılığı daha yüksektir, in vivo çalışmalar sınırlı manipülasyon koşulları empoze ederken. Tersine, birincil kültürleri işlemek kolaydır, daha iyi vivo hücrelerde benzer ve aynı zamanda bize deneysel faktörleri kontrol etmek için izin12,13. Burada, aynı protokoldeki murine astrositlerinin ve mikroglia birincil hücrelerinin nasıl ayıklandığı, bakımı ve ayrıştırılaması ile ilgili yönergeleri açıklıyoruz. Ayrıca, bu kültürlerde protozoa enfeksiyonu ile nasıl çalışılabilenlere ilişkin örnekler de salıyoruz.
Yenidoğan farelerden elde edilen CNS hücreleri (3 güne kadar) astrosit ve mikroglia hücrelerinin tercihli büyümesini sağlayan diferansiyel ortamda 14 gün boyunca kültüre alınmıştır. Mikroglia ekli astrositlerin üzerinde olduğundan, hücre popülasyonları mekanik olarak orbital inkübatörde ayrıştırıldı. Sonra, mikroglia içeren tüm supernatant toplandı ve astrositleri ayırmak için tripsin ekledi. İzole glial hücreler akış sitometrisi ile fenotipik olarak değerlendirildi ve istenilen deneye göre kaplandı.
Ayrıca bu izole mikroglia ve astrositlere protozoa parazitleri ile nasıl bulaşabileceğimize ilişkin örnekler verdik. T. gondii toksoplazmoz sorumlu bir son derece nörotropik protozoon14, T. cruzi CNS nörolojik bozuklukların gelişmesine yol açabilir Chagas hastalığından sorumlu iken15,16. Ayrıca, t. gondii17ile enfeksiyon bildirilmiştir,18 veya T. cruzi19,20,21 bağışıklık hastalarında ölüm tahmini nedeni. Bu nedenle, protozoa enfeksiyonlarının kontrolünde CNS glial hücrelerin immünolojik rolünün açıklanması büyük önem taşımaktadır.

<table><tbody><tr><td>% 70 Etanol</td><td>Din ve acirc; mika Qu&iacute; mika Çağdaş ve acirc; nea</td><td>Kedi: 2231</td><td>75</td></tr><tr><td>cm sterilize edin 2 Şişe</td><td>Corning</td><td>Cat: 430720U</td><td>Plastik malzeme</td></tr><tr><td>96 kuyulu hücre kültürü plakası</td><td>Greiner Cellstar Cat</td><td>: 655090</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Amonyum Klorür (NH4Cl)</td> <td>Din & acirc; mika Qu&iacute; mika Çağdaş ve acirc; nea</td><td>Kedi: C10337.01.AH</td><td>Otofloresan</td></tr><tr><td>Anti-GFAP antikorunu</td> çıkarın <td>Abcam</td><td>Cat.: ab49874</td><td>İmmünofloresan antidoby</td></tr><tr><td>Şişe Üstü Filtre 0.22 & mu; mm CA</td><td>Corning Cat</td><td>: 430513</td><td>Kültür ortamı filtresi</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>Kedi: A7906</td><td>FACS Tampon hazırlama</td></tr><tr><td>CD11b (FITC)</td> <td>BD Pharmigen</td><td>Kat.: 553310</td><td>Akış sitometrisi antikoru</td></tr><tr><td>CD45 (PE)</td> <td>İnvitrojen</td><td>Kat.: 12-0451-83</td><td>Akış sitometrisi antikoru</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>Kedi: 5810R</td><td>Santrifüj</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>Santrifüj</td></tr><tr><td>Sınıf II biyogüvenlik kabini</td><td>Pachane</td><td>Cat: 200</td><td>Steril prosedürler için biyogüvenlik kabini</td></tr><tr><td>CO2 İnkübatör</td><td>ThermoScientific</td><td>Model: 3110</td><td>Birincil hücre bakımı</td></tr><tr><td>Konik tüpler 15 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 430766</td><td>Plastik malzeme</td></tr><tr><td>Konik tüpler 50 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 352070</td><td>Plastik malzeme</td></tr><tr><td>Kontes otomatik hücre sayacı</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: C10281</td><td>Hücre sayacı</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: D1306</td><td>İmmünofloresan antidoby</td></tr><tr><td>Dijital Mikroskop Kamera</td><td>Nikon</td><td>Cat: DS-RI1</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile görüntü yakalayın</td><td>Gibco</td><td>Kedisi: 12800-058</td><td>Hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>Kedi: E9884</td><td>FACS Tampon hazırlama</td></tr><tr><td>F12 Besin Karışımı</td><td>Gibco</td><td>Cat: 21700-026</td><td>Hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>Kullanılamayan</td><td>Akış sitometresi</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>LGC Biyoteknoloji</td><td>Kedi: 10-bio500-1</td><td>Hücre kültürü ortamı takviyesi</td></tr><tr><td>Flow Jo (yazılım)</td><td>Flow Jo</td><td>Sürüm: Flow Jo_9.9.4</td><td>Veri analizi</td></tr><tr><td>Floresan yoğun ışık</td><td>Nikon</td><td>Cat: C-HGFI</td><td>Floresan kaynağı</td></tr><tr><td>GFAP (APC)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: 50-9892-82</td><td>Akış sitometrisi antikoru</td></tr><tr><td>Keçi - anti-fare IgG (FITC)</td><td>Kirkeegood& Perry Lab (KPL)</td> <td>Kat.: 172-1806</td><td>İmmünofloresan antidoby</td></tr><tr><td>HBSS - Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>Cat: 14175079</td><td>Hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: H4034</td><td>Hücre kültürü ortamı takviyesi</td></tr><tr><td>IC Fiksasyon Tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: 00-8222-49</td><td>Akış Sitometrisi için hücre fiksasyonu</td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Model: ECLIPSE TS100</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Crist&aacute; lia</td><td>Kedi: 21.2665</td><td>Solunan anestezik</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Synth</td><td>Cat:</td><td>İmmünofloresan için 01A1085.01.BJ Fiksasyon</td></tr><tr><td>Mikro spatula</td><td>ABC paslanmaz</td><td>Kullanılamaz</td><td>Cerrahi malzeme</td></tr><tr><td>Mikrotüp 1.5 mL</td><td>Axygen Kedi</td><td>: MCT-150-C</td><td>Plastik malzeme</td></tr><tr><td>Monoklonal antikor (mAb) 2C2 anti-Ssp-4</td><td>Ticari olmayan</td> Ticari <td>olmayan</td><td>İmmünofloresan antidoby</td></tr><tr><td>Çok Kanallı Pipet (p200)</td><td>Corning</td><td>Cat: 751630124</td><td>Pipet reaktifleri</td></tr><tr><td>NIS Elements Yazılımı</td><td>Nikon</td><td>Sürüm 4.0</td><td>Görüntüleri alın ve analiz edin</td></tr><tr><td>Yağsız süt</td><td>Nestl&eacute;</td><td>Kedi: 9442405</td><td>İmmünofloresan için engelleme çözeltisi</td></tr><tr><td>Orbital Çalkalayıcı İnkübatör</td><td>ThermoScientific</td><td>Model: 481 Kedi: 11</td><td>Mikroglia'yı astrositlerden ayırın</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td><td>Sigma Aldrich Kedi</td><td>: P6148</td><td>İmmünofloresan için Fiksasyon</td></tr><tr><td></td><td>PBS Ticari olmayan Ticari</td><td>olmayan Nötr</td><td>Tampon</td></tr><tr><td>Penisilin G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Kedi: P-7794</td><td>Hücre kültürü ortamı takviyesi</td></tr><tr><td>Geçirgenleştirme Tamponu (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>Kedi: 00-8333-56</td><td>Akış Sitometrisi için hücre geçirgenliği</td></tr><tr><td>Petri kabı 60 mm x 15 mm (Tek kullanımlık, steril)</td><td>Prolab</td><td>Cat: 0303-8</td><td>Plastik malzeme</td></tr><tr><td>pH metre</td><td>Kasvi</td><td>K39-1014B</td><td>pH çözeltisini kalibre edin</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta</td><td>Gibco</td><td>Kedi: 31800-014</td><td>Hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Makas</td><td>ABC paslanmaz</td><td>Kedi: LO9-W4</td><td>Cerrahi malzeme Serolojik</td></tr><tr><td>pipet 10 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 4101</td><td>Plastik malzeme</td></tr><tr><td>Serolojik pipet 5 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 4051</td><td>Plastik malzeme</td></tr><tr><td>Tek Kanallı Pipet (p1000)</td><td>Gilson Pipetman</td><td>Cat: F123602</td><td>Pipet reaktifleri</td></tr><tr><td>Tek Kanal Pipeti (p200)</td><td>Gilson Pipetman</td><td>Kedi: F123601</td><td>Pipet reaktifleri</td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: S6297</td><td>Hücre kültürü ortamı takviyesi</td></tr><tr><td>Streptomisin sülfat tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: S9137</td><td>Hücre kültürü ortamı takviyesi</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: T9284</td><td>İmmünofloresan</td></tr> <tr><td>için geçirgenlikTripsin</td><td>Gibco</td><td>Kedi: 27250-018</td><td>Sindirim enzimi</td></tr><tr><td>Cımbız</td><td>ABC paslanmaz</td><td>Kedi: L28-P4-172</td><td>Cerrahi malzeme</td></tr><tr><td>Su Banyosu</td><td>Novatecnica</td><td>Model:</td><td>09020095 37 ° C'de dokuyu sindirin; Tripsin ile C</td></tr></tbody></table>

protozoa parazit enfeksiyonunda primer astrosit ve mikroglianın eşlik etmesinin İzole edilmesi

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Astrositler ve mikroglia en bol glial hücrelerdir. Merkezi sinir sisteminde (CNS) fizyolojik destek ve homeostaz bakımından sorumludurlar. Bulaşıcı hastalıkların kontrolünde ki rollerinin giderek artan kanıtları, CNS'yi etkileyen enfeksiyonlara verdikleri yanıtları değerlendirmek için birincil astrositleri ve mikrogliaları izole etmek için metodolojilerin geliştirilmesine olan ilgiyi haklı çıkarmaktadır. Trypanosoma cruzi (T. cruzi)ve Toxoplasma gondii (T. gondii)enfeksiyonunun CNS enfeksiyonunun etkisi göz önüne alındığında, burada ürinen astrositleri ve mikroglia hücrelerini protozoa parazitleri ile ayıklamak, korumak, ayrıştırmak ve enfekte etmek için bir yöntem salıyoruz. Yenidoğan kortekslerinden çıkarılan hücreler periyodik diferansiyel ortam replasmanı ile 14 gün boyunca in vitro olarak muhafaza edilir. Astrositler ve mikroglia mekanik ayrışma ile aynı ekstraksiyon protokolü elde edilir. Akış sitometrisi ile fenotiotipleme den sonra hücreler protozoa parazitleri ile enfekte olur. Enfeksiyon oranı farklı zaman noktalarında floresan mikroskopisi ile belirlenir, böylece glial hücrelerin diferansiyel yeteneğinin protozoan invazyonu ve replikasyonunu kontrol etme yeteneğinin değerlendirilmesi sağlar. Bu teknikler, astrositlerin ve mikroglianın enfeksiyonlara verdiği tepkileri incelemek için basit, ucuz ve verimli yöntemleri temsil eder ve daha fazla nöroimmünoloji analizi için alanı açar.

14. günde glial hücre kültürü(Şekil 1A)<p class="jove_content" fo:keep-t...

Bu protokolün genel amacı, merkezi sinir sisteminden murine astrositi ve mikroglia hücrelerinin nasıl çıkarılabildiğini, bakımını ve ayrıştırığunu ve ardından protozoa parazitleri ile enfeksiyonun nasıl sağlanmadığını öğretmektir.

Protozoa Parazit Enfeksiyonunda Primer Astrosit ve Mikroglianın Eşlik Etmesinin İzole Edilmesi

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

Bu protokol, doğum sonrası farelerden en çok bulunan iki glial hücre popülasyonu olan astrosit ve mikroglia'ya paralel olarak ayıklama üzerine odaklanan bir yöntemi açıklamaktadır. Yöntemimiz, astrosit ve mikroglia izolasyonu için daha önce tanımlanmış protokollerden farklıdır, çünkü her iki hücre tipini de aynı koşulda elde edip izole etme, böylece deneysel hayvanların kullanımını optimize etme ve bu hücreler için immünolojik bağlamlarda göreceli rollerin incelenmesini iyileştirmeye odaklanırız. Bu protokol, örneğin protozoa parazitleri veya virüsleri tarafından merkezi sinir sisteminde ki birçok bağlamda ve hastalıklarda mikroglia ve astrosit rollerinin daha iyi araştırılması için yararlı olabilir.Her iki hücre tipinin de aynı ekstraksiyondan elde edilmesi ve izole edilmesi, enfeksiyon veya inflamasyon gibi her hücre alt kümesinin immünolojik bağlamlarının karşılaştırmalı rolünü değerlendirmek için istenir. İnsanlar özellikle beyin kaldırma ve sinir dokusu yıkar sırasında dikkatli olmalıdır, ama bu protokol ve video çekim ile, insanlar mücadele olmaz inanıyorum. Bu protokol, yaklaşık dört saat veya daha fazla harcamaya hazır olmak bu yüzden korteksleri ayıklamak için hayvan sayısına bağlı olarak uzun olabilir.İlk gün, saf HBSS ve HBSS artı% 10 ısı-inaktive FBS hazırlayın. Eklenmiş DMEM F12 hazırlayın ve 0,22 mikron filtre ile filtreleyin. Bir otoklav tüm cerrahi aletleri sterilize ve işlem sırasında% 70 etanol kullanın.Derin anestezi için beş dakika boyunca isofluran ile ıslatılmış pamuk içeren kapalı bir odaya yeni doğan fareler koyun. Sprey fare yavrusu% 70 etanol ile ve makas ile hayvan decapitate. Açmak ve beyin ortaya çıkarmak için kafatası boyunca makas ile bir sagittal kesim olun.Beyin bütünlüğünü korumak için bir mikro spatula kullanarak beyin çıkarın. Kuru altı santimetre çapında Petri çanak beyin yerleştirin. Bir mikro spatula kullanarak, koku ampul ve beyincik kaldırın.Korteksi iki mililitre HBSS artı %10 FBS içeren başka bir Petri kabına taşıyın. Steril makas ile küçük parçalar halinde beyin dokusu kesin ve bir P1000 mikropipet kullanarak, farklı 15 mililitre konik tüpler için HBSS artı% 10 FBS ile her beyin dokusu transfer. Gerekirse, son hacmi iki mililitreye doldurmak için HBSS artı %10 FBS kullanın.Kesilen beyin dokusunu üç mililitre HBSS artı her tüp için %10 FBS ile yıkayın. Dekantasyondan sonra, supernatant'ı dikkatlice çıkarın. HBSS artı %10 FBS ile yıkamayı üç kez daha tekrarlayın.Sonra üç kez saf HBSS üç mililitre ile yıkayın. Dekantasyondan sonra, supernatant'ı dikkatlice çıkarın. Sonra, tripsin üç mililitre ekleyin ve 37 santigrat derece bir su banyosunda tüp yerleştirin 30 dakika yavaşça her beş dakikada tüplersal sallayarak.Bu toplanan dokuyu sindirir. Kabarcıklar kaçının. Tripsin inaktive etmek için, HBSS üç mililitre artı% 10 FBS ile doku yıkayın ve doku decantation sonra, dikkatle supernatant çıkarın.Bu yıkamayı üç kez tekrarlayın. Sonra saf HBSS üç mililitre ile doku yıkayın ve iki kez daha tekrarlayın. Doku decantation sonra, dikkatle supernatant çıkarın.Saf HBSS yedi mililitre ekleyin ve pipetler ardışık pasajlar yoluyla doku homojenize, bir 10 mililitre serolojik pipet ile ilk, beş mililitrelik pipet takip, ve son olarak bir P1000 mikropipet ile. Homojenizasyondan sonra tüpleri 450 kez g'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve her tüp için HBSS artı% 10 FBS dört mililitre ile pelet resuspend.En iyi hücre kültürü yapışması için hücreleri ticari olarak önceden işlenmiş bir T75 şişesine aktarın. Şişeyi 37 derecede bir kuvöze yerleştirin ve yapışma için %5 karbondioksit verin. Daha sonra şişeye 10 mililitre dMEM F12 ekleyin ve iki gece boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve %5 karbondioksit ekleyin.Üçüncü gün, T75 şişesinden yedi mililitre kültür ortamını çıkarın ve yedi mililitre taze takviyeli DMEM F12 ekleyin. Şişeyi kuvöze geri ver. Beşinci gün, enkaz ve yapışmaz hücreleri kaldırmak için, taze takviye DMEM F12 14 mililitre ile T75 şişesi tüm orta değişimi.Sonra her 48 saatte bir, supernatant altı mililitre çıkarın ve kültür gün 14 kadar taze takviye DMEM F12 orta yedi mililitre ekleyin. Gün 14, supernatant altı mililitre kaldırarak ve taze takviye DMEM F12 orta yedi mililitre ekledikten sonra, plastik ambalaj ile sıkıca T75 şişeleri kapatın. Astrositlerden mikrogliayı mekanik olarak ayrıştırmak için bir gecede 200 RPM ve 37 santigrat derecede yer orbital shaker'ına yerleştirin.15. günde, şişeleri çalkalayıcıdan alın ve hücre ayrışmasını optimize etmek ve maksimum mikroglia sayısını hasat etmek için kendi ortamlarıyla şiddetle yıkayın. Sonra supernatant toplamak ve 50 mililitrekonik tüp aktarın. Sonra, her şişeye dört mililitre tripsin ekleyin ve astrositleri ayırmak için 37 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın.Sonra tripsin inaktive etmek için eklenmiş DMEM F12 beş mililitre ekleyin. Şişeleri kendi ortamlarıyla yıkayın ve içindekileri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. 450 kez g dört santigrat derecede beş dakika boyunca ayrıştırılmış mikroglia veya astrosit içeren tüm tüpleri santrifüj.Supernatant atın. Tamamlanmış DMEM F12'nin bir mililitresinde mikroglia peletini ve 10 mililitre lik eklenmiş DMEM F12'deki astrositleri yeniden askıya alın. Neubauer odasında veya otomatik hücre sayacında hücre saymaya devam edin.Önceden işlenmiş düz alt hücre kültür plakasında istenilen yoğunlukta tamamlayıcı DMEM F12 ile hücreleri plakalayın. Hücreleri 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın. 14. günde glial hücre kültürü mekanik dissociasyona uğramıştır.Astrosit popülasyonu %89.5, mikroglia popülasyonu %96.6 saflıkta gözlendi. C57BL6 farelerinden gelen astrositler ve mikroglialar T.cruzi Y.'ye iki saat, 48 saat ve 96 saat sonra metanol ile sabitlenmiş ve hücre çekirdeği belirteci DAPI ve anti-GFAP ile boyanmıştır. Floresan muhabirleri veya spesifik floresan antikorlarla etiketlenmiş parazitleri ifade eden genetiği değiştirilmiş parazitlerin kullanımı, hücre çekirdeğinden daha iyi ayırt edildikleri için immünoresans mikroskobunu iyileştirmiştir.Burada iki örnek sunulmuştur. T.gondii RH suş uvelek, ticari olmayan monoklonal antikor 2C2 anti-SSP4 proteini ile lekelenmiş YFP ve T.cruzi Y suşunu oluşturan bir şekilde ifade edilir. Herhangi bir hücre agregaları kaybetmemek için hücreleri dikkatle yıkamak önemlidir.Glial hücre enfeksiyonundan sonra, supernatant'ta bulunan sitokin üretimi için ELISA, protein ekspresyonu için Western blotting ve RNA transkripsiyon değerlendirmesi için gerçek zamanlı kantitatif PCR gibi diğer parametreler değerlendirilebilir. Glial hücrelerin işlevi ile ilgili birçok soru, örneğin metabolizma, bağışıklık yanıtı, ve hücre biyolojisi kendisi ele alınabilir ve bu teknik ten yararlanabilir. Tüm protozoa parazitleri insan hücrelerinin yanı sıra kültür fare hücreleri enfekte edebiliyoruz bu yüzden bu parazit ele ederken dikkatli olmak önemlidir.

concomitant-isolation-primary-astrocytes-microglia-for-protozoa

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Beynin hücresel heterojenite birincil mikroglia Yalıtımlı fizyolojik ve patolojik hem de kendi rolünü araştırmak için esastır. Bu protokol bir mekanik izolasyon ve yüksek verim ve yüksek saflıkta sağlar karışık hücre kültürü tekniği için geçerli birincil mikroglia hücreleri...

Yenidoğan Rat Beyin Dokusu Karışık Glial Hücre Kültürleri Primer mikroglia İzolasyonu

Bu çalışma, bir roman nöronal akson ve (astro) glia ko-kültür platformu kurma prosedürleri açıklar. Bu ko-kültür sisteminde, bir tek akson (ve tek bir glial hücre) arasındaki doğrudan etkileşim manipülasyon glial sinyalleşme karşılıklı nöronların mekanik analiz izin veren, uygun olur.

Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Astrositler normal beyin gelişimi ve işlevi, ve merkezi sinir sistemi onarımı için gerekli olan temel biyolojik süreçler katılan yönlü hücreler olduğu kabul edilmiştir. Burada santral sinir sistemi hücrelerinin bu büyük sınıf biyoloji eğitimi saf fare astrosit kültürleri elde etmek için hızlı bir prosedürdür.

Fare Kortikal astrositlerde İzolasyon ve Kültür

Beyin kan damarlarının gelen yapışık inflamatuar lökositlerin izolasyonu için bir...

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-enfekte Fare

Mikrogliyal biyoloji başarılı bir soruşturma için bir anahtar CNS dokudan izolasyonu sırasında ex vivo mikroglialardan immunofunction korunmasıdır. Flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve proenflamatuar stimuli lipopolisakarit (LPS) ile Pam 3 CSK 4 (PAM) ile ELISA aşağıda mikroglia aktivasyonu ile değerlendirilen gibi son derece saf ve immunofunctional hücre kültürlerinde döner çalkalama sonuçları ile mikroglia izole edilmesi.

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

Bir iletişim kuralı üzerinden fare beyni birincil microglia yalıtım için sunulmaktadır. Bu teknik nörolojik koşullar geçerli anlayışı sürdürmek yardımcı olur. Yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma son derece saf bir örnek yeterli verim üretmek için birleştirilmiştir. Ayrıca, biz microglia karakterizasyonu için adımlar verilmiştir.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Burada, bir fare CNS'sinden çoklu glial hücre popülasyonlarının in vitro izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, bölgesel mikroglia, oligodendrosit öncü hücreleri ve astrositlerin çeşitli kültür sistemlerinde her birinin fenotiplerini incelemek için ayrılmasına izin verir.

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

Adipoz kaynaklı mezenkimal stromal hücreler (AdMSC'ler), inflamasyonla ilişkili hastalıkların tedavisinde yararlı olan güçlü immünomodülatör özelliklere sahiptir. Murin AdMSC'lerin ve primer karışık gliaların nasıl izole edileceğini ve kültürleneceğini, AdMSC'lerin anti-inflamatuar genleri ve büyüme faktörlerini yukarı regüle etmek için nasıl uyarılacağını, AdMSC'lerin göçünün nasıl değerlendirileceğini ve AdMSC'lerin primer karışık prion ile enfekte glia ile nasıl ko-kültür yapılacağını...

Prion Kaynaklı Enflamasyonu Azaltmak için Primer Karışık Glia ile Ko-Kültürlenmiş Adipoz Kaynaklı Mezenkimal Stromal Hücreler

Bugüne kadar, tüm ana merkezi sinir sisteminde yerleşik hücre tiplerinin aynı fareden eşzamanlı izolasyonu için protokoller karşılanmamış bir taleptir. Protokol, nöroinflamasyon sırasında karmaşık hücresel ağları araştırmak ve aynı anda gerekli fare sayılarını azaltmak için naif ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit farelerinde uygulanabilir bir prosedürü göstermektedir.

Yetişkin Otoimmün Ensefalomiyelit Farelerinden Başlıca Merkezi Sinir Sisteminde Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu

Bu protokol, yetişkin fare omuriliğinden saflaştırılmış astrositlerin ve mikrogliaların izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir ve RNA analizi ve hücre kültürü gibi sonraki uygulamaları kolaylaştırır. İzole edilmiş hücrelerin hem kalitesini hem de verimini artırmak için tasarlanmış ayrıntılı hücre ayrışma yöntemlerini ve prosedürlerini içerir.

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

Keşfedin, yeni doğan fare kortekslerinden astrosit ve mikroglia hücrelerinin paralel izolasyonu ve protozoa parazit enfeksiyonlarında karşılaştırmalı çalışmalar için kullanımı.

Protozoa Parazit Enfeksiyonunda Primer Astrosit ve Mikroglianın Eşlik Etmesinin İzole Edilmesi

Daha fazla video keşfet