Name: Détection des espèces réactives totales d’oxygène dans les cellules adhérentes par 2,7-Dichlorodihydrofluorescein Diacétate Staining (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Apprenez à détecter les espèces réactives d'oxygène dans les cellules adhérentes par marquage DCFH-DA et microscopie à fluorescence. Cette méthode simple permet la visualisation et la quantification précise du stress oxydatif cellulaire.

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Ce travail a été soutenu en partie par les National Institutes of Health (K01DK114390), une bourse de recherche de l’American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), un projet pilote de recherche Subvention du Programme de signature en santé environnementale de l’Université du Nouveau-Mexique et superfond (P42 ES025589), d’un prix de projet pilote de ressources partagées et d’un prix de soutien au projet pilote de programme de recherche du centre de cancérologie complet de l’UNM (P30CA118100) , et un nouveau prix d’investigateur du Fonds dédié à la recherche en santé à l’École de médecine de l’Université du Nouveau-Mexique.

1. Ensemencement cellulaire
<ol><li>Semences 2 x 105 cellules cancéreuses colorectales HCT116 par puits dans une plaque de 24 puits et maintenir les cellules dans le milieu aigle modifié (DMEM) modifié de Dulbecco pendant la nuit à 37 °C.</li>
	<li>Remplacer le milieu de culture par ou sans sulfate ferreux (FS) ou 10 μM de doxorubicine (DOX) contenant un milieu et un incuber pendant 24 h.</li>
</ol>2. Préparation de la solution DCFH-DA
<ol><li>Dissoudre 4,85 mg de DCFH-DA dans 1 mL de sulfoxyde de diméthyle (DMSO) pour faire une solution de stock de 10 mM.</li>
	<li>Diluer la solution de stock avec DMEM préchauffé en solution de travail de 10 μM juste avant de l’ajouter aux puits.</li>
	<li>Vortex la solution de travail pour 10 s.</li>
</ol>3. DCFH-DA coloration
<ol><li>Retirer le médicament contenant un milieu et laver une fois avec DMEM.</li>
	<li>Ajouter 500 μL de la solution de travail DCFH-DA dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant 30 min.</li>
	<li>Supprimez la solution de travail DCFH-DA. Laver une fois avec DMEM et 2x avec 1x saline tamponnée de phosphate (PBS).</li>
	<li>Ajouter 500 μL de 1x PBS à chaque puits.</li>
</ol>4. Acquisition d’imagerie et mesure de l’intensité
<ol><li>Prenez des images fluorescentes représentatives pour chaque puits à l’aide du canal de protéine fluorescente verte (GFP) sur un microscope à fluorescence.</li>
	<li>Après avoir pris des images, retirez PBS et ajoutez 200 μL de tampon d’essai de radioimmunoprécipitation (RIPA) à chaque puits.</li>
	<li>Incuber sur la glace pendant 5 min, puis recueillir le lysate cellulaire dans des tubes de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugeuse à 21 130 x g pendant 10 min à 4 °C.</li>
	<li>Transférer 100 μL du supernatant sur une plaque de puits noire de 96 et mesurer l’intensité de fluorescence à l’aide d’une fluorescence un lecteur de microplaques à une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et une longueur d’onde d’émission de 530 nm.</li>
	<li>Transférer 1 μL du supernatant sur une plaque claire de 96 puits contenant 100 μL de solution d’analyse protéique 1x pour mesurer la concentration de protéines à l’aide de l’essai de Bradford9.</li>
	<li>Normaliser les intensités de fluorescence avec des concentrations de protéines.</li>
</ol>

<ol><li>Birben, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+antioxidant+defense%5BTitle%5D)+AND+%22World+Allergy+Organization+Journal%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and antioxidant defense.</a> World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).</li>
<li>Kim, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Oxidative+Stress+in+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases.</a> Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).</li>
<li>Sullivan, L. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reactive+oxygen+species+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reactive oxygen species and cancer.</a> Cancer & Metabolism. 2, 17(2014).</li>
<li>Formentini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+Production+Protects+the+Intestine+from+Inflammation+through+Functional+M2+Macrophage+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization.</a> Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).</li>
<li>Rakotoarisoa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin-+and+Fish+Oil-Loaded+Spongosome+and+Cubosome+Nanoparticles+with+Neuroprotective+Potential+against+H2O2-Induced+Oxidative+Stress+in+Differentiated+Human+SH-SY5Y+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells.</a> ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).</li>
<li>Mateen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Reactive+Oxygen+Species+Formation+and+Oxidative+Stress+in+Rheumatoid+Arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis.</a> PLoS One. 11 (4), (2016).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+Hemin+and+Sestrin2+modulates+oxidative+stress+and+colon+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).</li>
<li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sotetsuflavone+inhibits+proliferation+and+induces+apoptosis+of+A549+cells+through+ROS-mediated+mitochondrial-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Complementary+and+Alternative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway.</a> BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235(2018).</li>
<li>Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKruger%2C+NJ+%22The+Protein+Protocols+Handbook%22">The Protein Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-24 (2009).</li>
<li>Tetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+the+dichlorofluorescein+assay+to+avoid+artifacts+in+measurement+of+toxicant-stimulated+cellular+production+of+reactive+oxidant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).</li>
<li>Rong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+detection+with+high+specificity+in+living+cells+and+inflamed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues.</a> Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).</li>
<li>Liu, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+detection+of+hydroxyl+radical+generated+in+quartz+powder%2Fphosphate+buffer+solution+system+by+fluorescence+spectrophotometry%5BTitle%5D)+AND+%22Guang+Pu+Xue+Yu+Guang+Pu+Fen+Xi%22%5BJournal%5D)">Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry.</a> Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole expérimental décrit ici est facilement reproductible pour mesurer le total cellulaire ROS. Les étapes critiques incluent la fabrication de la solution DCFH-DA fraîche et l’évitement de l’exposition à la lumière, la minimisation des perturbations de l’état cellulaire et le lavage complet de PBS juste avant de prendre des images. Pour la préparation de la solution de travail DCFH-DA, la solution de stock doit être ajoutée dans DMEM préchauffé juste avant d’ajouter dans la plaque de puits 24. La raison en est q...

Trois espèces réactives principales d’oxygène (ROS) produites par le métabolisme cellulaire qui sont de signification physiologique sont l’anion de superoxyde, le radical d’hydroxyle, et le peroxyde d’hydrogène1. À de faibles concentrations, ils participent à des processus cellulaires physiologiques, mais à des concentrations élevées, ils ont des effets néfastes sur les voies de signalisation cellulaire1. Notre corps a développé des systèmes antioxydants, qui sont efficaces contre le ROS excessif. Cependant, le stress oxydatif peut se produire lorsque ROS submerger la capacité détoxifiante de notre corps, ce qui contribue à de nombreuses conditions pathologiques, y compris l’inflammation, le cancer, et la maladie neurodégénérative2,3,4. Le but de cette méthode est de déterminer le ROS cellulaire total dans les cellules adhérentes à l’aide de la coloration 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacétate (DCFH-DA). La raison en est que l’oxydation du DCFH-DA à 2'-7'dichlorofluorescein (DCF) a été largement utilisée pour la détection totale de ROS, y compris les radicaux hydroxyles (•OH) et le dioxyde d’azote (•NO2). Mécaniquement, DCFH-DA est repris par les cellules où l’estérase cellulaire se fend des groupes d’acétyl, ce qui entraîne le DCFH. L’oxydation du DCFH par ROS convertit la molécule en DCF, qui émet une fluorescence verte à une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et une longueur d’onde d’émission de 530 nm. Par rapport à la détection de la fluorescence avec la cytométrie de flux et d’autres méthodes alternatives5, les avantages de cette méthode à l’aide d’un microscope à fluorescence et un lecteur de plaque sont qu’il produit des images fluorescentes clairement visibles, et est facile à exécuter, efficace et rentable. Cette méthode a été largement utilisée pour détecter ros cellulaire pour l’étude de diverses conditions6,7,8. Ce protocole est utilisé pour détecter le ROS total dans les cellules adhérentes. L’utilisation de cette méthode pour détecter le ROS dans les cellules de suspension peut avoir besoin de quelques modifications.

<table><tbody><tr><td>Diacétate de 2',7'-dichlorofluorescéine</td><td>Cayman Chemical, Ann Arbor, MI</td><td>20656</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de doxorubicine</td><td>TCI America, Portland, OR</td><td>D4193-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>45000-304</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate ferreux heptahydraté</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>97061-542</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific Waltham, MA</td><td>AMAFD1000</td><td>ou tout autre microscope à fluorescence</td></tr><tr><td>Dosage des protéines Solution Bradford</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td>5000001</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2 Lecteur de microplaques</td><td>Dispositifs moléculaires, Radnor, PA</td><td>89429-532</td><td>ou tout autre lecteur de microplaques à fluorescence</td></tr></tbody></table>

détection des espèces réactives totales d’oxygène dans les cellules adhérentes par 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacétate staining

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Le stress oxydatif est un événement important dans des conditions physiologiques et pathologiques. Dans cette étude, nous démontrons comment quantifier le stress oxydatif en mesurant l’espèce réactive totale d’oxygène (ROS) en utilisant 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacétate (DCFH-DA) coloration dans les lignées cellulaires cancéreuses colorectales à titre d’exemple. Ce protocole décrit des étapes détaillées comprenant la préparation de la solution DCFH-DA, l’incubation des cellules avec la solution DCFH-DA, et la mesure de l’intensité normalisée. La coloration DCFH-DA est un moyen simple et rentable de détecter le ROS dans les cellules. Il peut être utilisé pour mesurer la génération de ROS après un traitement chimique ou des modifications génétiques. Par conséquent, il est utile pour déterminer le stress oxydatif cellulaire sur le stress de l’environnement, fournissant des indices pour les études mécanistes.

Les cellules cancéreuses colorectales HCT116 ont été traitées avec 100 μM FS ou 10 μM DOX pour induire un stress oxydatif7. Comme le montre la figure 1, la fluorescence verte a été considérablement augmentée par FS et DOX comme prévu. Pour quantifier le changement relatif d’intensité, les cellules ont été lysées après prise d’images et normalisées avec des concentrations de protéines. L’intensité quantifiée de fluorescence a été significativement augmentée par FS ou D...

Ici, nous présentons un protocole pour détecter l’espèce totale d’oxygène réactif cellulaire (ROS) à l’aide de 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacétate (DCFH-DA). Cette méthode permet de visualiser la localisation cellulaire de ROS dans les cellules adhérentes avec un microscope à fluorescence et de quantifier l’intensité de ROS avec un lecteur de plaque de fluorescence. Ce protocole est simple, efficace et rentable.

Détection des espèces réactives totales d’oxygène dans les cellules adhérentes par 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacétate Staining

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Cette méthode peut être utilisée pour analyser les espèces réactives cellulaires d’oxygène dans les cellules adhérentes avec seulement un microscope de fluorescence, et quantifier l’intensité réactive d’espèces d’oxygène avec le lecteur de plaque de fluorescence. Ce protocole est simple, efficace et rentable. Commencez par ensemencement deux fois 10 à la cinquième HCT116 cellules cancéreuses colorectales dans DMEM dans chaque puits d’une plaque de 24 puits.Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, remplacez le milieu de culture par 100 sulfate ferreux micromolaire, ou 10 micromolaires contenant de la doxorubicine, et incubez la plaque pendant encore 24 heures. Préparez la solution DCFH-DA en dissolvant 4,85 milligrammes de DCFH-DA en un millilitre de DMSO pour faire une solution de stock de 10 millimolaires.Juste avant de l’ajouter aux puits, diluer le stock avec du DMEM préchauffé pour faire une solution de travail de 10 micromolaires, et le vortex pendant 10 secondes. Pour tacher les cellules, retirez le milieu contenant de la drogue et lavez-les une fois avec du DMEM. Ajouter 500 microlitres de solution de travail DCFH-DA dans chaque puits, et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.Après l’incubation, retirer le DCFH-DA des puits et les laver deux fois avec du DMEM, et une fois avec du PBS. Ajouter ensuite 500 microlitres de PBS à chaque puits. Utilisez le canal de protéines fluorescentes vertes sur le microscope à fluorescence pour prendre des images représentatives des cellules.Retirez ensuite le PBS et ajoutez 200 microlitres de tampon d’analyse de radioimmunoprécipation à chaque puits. Incuber la plaque sur la glace pendant cinq minutes et recueillir les lysates de la cellule en tubes de 1,5 millilitre. Centrifuger les tubes à 21, 130 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Transférer ensuite 100 microlitres du supernatant dans une plaque noire de 96 puits. Utilisez un lecteur de microplaque à une longueur d’onde d’excitation de 485 nanomètres, et une longueur d’onde d’émission de 530 nanomètres, pour mesurer la fluorescence dans chaque puits. Ensuite, mesurez la concentration de protéines avec l’essai de Bradford en transférant un microlitre du supernatant à une plaque claire de 96 puits avec 100 microlitres de solution d’analyse protéique.Utilisez les concentrations de protéines pour normaliser les intensités de fluorescence. HCT116 cellules cancéreuses côlorectales ont été traitées avec 100 sulfate ferreux micromolaire, ou 10 doxorubicine micromolaire, pour induire l’effort oxydant. Comme prévu, la fluorescence verte a été considérablement augmentée par les deux traitements.Pour quantifier les changements relatifs d’intensité, les cellules ont été lysées et normalisées avec des concentrations de protéines. L’intensité relative de fluorescence a été sensiblement augmentée par le sulfate ferreux ou la doxorubicine. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de rendre la solution DCFH-DA fraîche et d’éviter l’exposition à la lumière, ainsi que de minimiser les perturbations de l’état cellulaire, et d’effectuer un lavage PBS étendu juste avant de prendre l’image.En plus de la détection du ROS total par ce protocole, spécifiquement ROS comme le peroxyde peut être effectuée.

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