Name: Protocole de dosage stepwise pour un débit accru dans les essais GPCR sans étiquette (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Découvrez le dosage séquentiel des agonistes GPCR par mesures d'impédance sans marquage pour accroître le débit analytique. Cette méthode permet d'obtenir des courbes dose-réponse complètes à partir d'un seul puits.

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Nous remercions Barbara Goricnick et Nadja Hinterreiter pour leur aide dans la culture cellulaire et la préparation de solutions expérimentales. Les auteurs remercient le soutien financier du Research Training Group 1910 «Medicinal chemistry of selective GPCR ligands» financé par la Fondation allemande de recherche (DFG) sous le numéro de subvention 222125149. JAS est particulièrement reconnaissant pour une bourse accordée par le Programme bavarois pour l’égalité des sexes.

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<li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophysical Journal. 91, 16(2006).</li>
<li>Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance+analysis+of+GPCR-mediated+changes+in+endothelial+barrier+function%3A+overview+and+fundamental+considerations+for+stable+and+reproducible+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).</li>
<li>Lieb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+versus+conventional+cellular+assays%3A+Functional+investigations+on+the+human+histamine+H1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor.</a> Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).</li>
<li>Stolwijk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+throughput+of+label-free+cell+assays+to+study+the+activation+of+G-protein-coupled+receptors+by+using+a+serial+agonist+exposure+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol.</a> Integrative Biology. 11, 10(2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Ce protocole décrit une méthode pour les mesures d’impédance sans étiquette pour déterminer la relation dose-réponse de l’activation du GPCR induite par agoniste en l’absence ou la présence d’antagonistes spécifiques pour le même récepteur. La preuve de concept de cette méthode a été présentée dans une publication récente12. À notre connaissance, il s’agit de la première étude décrivant l’établissement d’une courbe dose-réponse complète de l’activation du GPCR à médiation agoniste à l’aide d’une s...

Ce rapport présente une description détaillée d’un protocole d’addition en série développé pour la quantification de l’activation du récepteur couplé de protéine G induite par ligand (GPCR) dans les cellules cultivées adhérente par des mesures d’impédance sans étiquette. Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) sont impliqués dans une multitude de fonctions physiologiques et de maladies humaines1. Pour cette raison et leur bonne accessibilité à la surface des cellules, les GPCR sont l’une des cibles les plus importantes en matière de médicaments. Cette évaluation se reflète dans un nombre estimatif de 700 médicaments approuvés ciblant les GPCR, ce qui équivaut à une part de 35 % sur tous les médicaments commercialisés2.
Le développement de nouveaux médicaments comprend deux processus centraux : (i) l’identification et la caractérisation fonctionnelle des molécules cibles biologiques, et (ii) la découverte de nouvelles substances de plomb et leur développement dans les médicaments administrables. Dans les deux processus, des méthodes efficaces sont nécessaires pour évaluer quantitativement les interactions médicament-cible et la réponse biologique en aval subséquente. Différentes étapes du processus de développement préclinique de médicaments font usage de différentes méthodes d’analyse allant des études d’interaction biomoléculaire entre le médicament et la cible, sur les études fonctionnelles sur les cellules en culture, aux expériences sur le matériel d’organe excisé ou des animaux entiers. Les deux, la signification physiologique et la complexité biologique augmentent de la première à la seconde3. Bien que l’objectif global soit de minimiser les expériences sur les animaux, les études pharmacologiques utilisant des organes isolés d’animaux de laboratoire ou même d’animaux entiers sont considérées comme inévitables pour caractériser de façon exhaustive les nouveaux médicaments candidats. En termes de lecture analytique, les études pharmacologiques d’organe fournissent une réponse fonctionnelle « holistique » distale et intégrative de la plus haute pertinence physiologique. Un inconvénient de ces expériences est qu’elles ne sont pas compatibles avec le dépistage à haut débit pour des raisons techniques et éthiques et ont été largement remplacées par des études basées sur la culture cellulaire in vitro4.
Les méthodes pour quantifier l’activation du GPCR dans les cultures cellulaires comprennent différentes analyses chimiques à base d’étiquettes, qui détectent spécifiquement les deuxièmes messagers, l’état de phosphorylation des protéines de signalisation en aval, l’activation transcriptionnelle par l’intermédiaire de certains facteurs de transcription ou le trafic de récepteurs intracellulaires induits par ligand4,5. Un inconvénient de ces essais basés sur l’étiquette est la nécessité d’étiqueter les cellules avec des colorants potentiellement nocifs ou des marqueurs radioactifs. Cela nécessite souvent l’exécution de l’évaluation comme un point de terminaison-détermination pour un temps d’exposition qui doit être spécifié a priori. L’utilisation d’analyses de points de terminaison basées sur l’étiquette souffre de ce moment très limité et biaisé de l’expérience et du risque que les étiquettes chimiques et les sondes interfèrent avec la physiologie cellulaire régulière, potentiellement inaperçue par l’expérimentateur.
Ces dernières années, des essais sans étiquette pour la surveillance de l’activation du GPCR ont vu le jour, comme des techniques basées sur l’impédance ou des méthodes optiques appliquant des grilles de guides d’ondes résonnantes5,6. L’étiquetage des cellules n’est pas expérimentalement requis avec ces approches. Comme ces réadmissions physiques fonctionnent sur des signaux de faible amplitude, ces méthodes sont considérées comme non invasives, elles permettent une surveillance cellulaire continue potentiellement en temps réel et le temps d’observation n’est limité que par la culture cellulaire et non par la lecture. Semblable aux écoutes d’organes entiers, les approches sans étiquette font généralement état des réponses cellulaires holistiques, loin en aval de l’activation des récepteurs lorsque l’intégration sur l’ensemble du réseau de signalisation entraîne des changements dépendants du temps, mais plutôt non spécifiques dans la morphologie cellulaire ou la redistribution de masse. Considérant que les essais basés sur l’impédance mesurent la signature diélectrique des changements dans la forme des cellules7,8, les mesures utilisant des grilles de guide d’onde résonnantes sont sensibles aux changements de l’indice de réfraction à l’interface cellule-substrat résultant de la redistribution dynamique de masse (DMR)9. Le caractère intégrateur rend les méthodes sans étiquette extrêmement sensibles aux événements médiés par les récepteurs, quel que soit le type de protéine G (Gq, Gi/0, Gs, G12/13) ou l’arrêt de la signalisation6 et bien adapté aux niveaux d’expression endogènes du récepteur.
Dans un jeu d’exemple standard sans étiquette, les cellules sont cultivées de façon adhérente dans des plaques multi-puits avec des électrodes de film d’or coplanaires déposées au fond de chaque puits10. Ces réseaux d’électrodes sont reliés à un analyseur d’impédance et les réponses cellulaires à un stimulus expérimental sont enregistrées à partir de puits individuels par des lectures d’impédance résolues dans le temps. Dans un exemple typique de GPCR, un ligand est ajouté en concentrations différentes individuellement à chaque puits individuel. Les changements induits par ligand dans le cours de temps d’impédance sont ensuite analysés en ce qui concerne les caractéristiques de la courbe telles que le changement de signal maximal, la zone sous la courbe, le changement de signal dans un intervalle de temps donné ou la pente de la courbe à un point de temps spécifié, afin de quantifier la puissance et l’efficacité du ligand11.
Le coût des réseaux d’électrodes peut limiter l’application de cette technique dans les campagnes de dépistage à haut débit (HTS). En outre, avec un nombre croissant d’échantillons à suivre en parallèle, le nombre de mesures individuelles augmente et réduit ainsi la résolution de temps disponible pour chaque puits progressivement - même pour l’état de l’art des enregistrements multicanaux. Dans de telles conditions, des réponses cellulaires rapides et transitoires peuvent échapper à la mesure. De plus, l’approche conventionnelle , une approche de concentration, impose un facteur de temps et de coût important aux développements perfusés d’organes sur puce ou de corps sur puce en ce qui concerne leur pertinence dans l’analyse de l’interaction ligand-GPCR.
Pour cette raison, nous avons développé un protocole de dosage progressive qui permet l’enregistrement des courbes pleine dose-réponse de l’activation du GPCR induite par ligand dans les monocouches de cellules cultivées en surveillant continuellement l’impédance d’un seul puits tandis que la concentration agoniste est augmentée pas à pas. Le protocole d’addition agoniste en série augmente de manière significative le débit par puits d’une concentration à 10 ou plus, comme indiqué sur l’exemple actuel des cellules humaines U-373 MG, qui expriment endogènement le récepteur de l’histamine 1 (H1R). Ainsi, la méthode a le potentiel d’améliorer considérablement le débit dans les études de dose-réponse sans étiquette, tandis que la résolution de temps est conservée au maximum instrumental.

<table><tbody><tr><td>B&uuml ; Chambre de comptage de</td><td>Marienfeld (Lauda-K&ouml ; nigshofen, Allemagne)</td><td>640210</td><td></td></tr><tr><td>flacons de culture cellulaire 25 cm2</td><td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Allemagne)</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur cellulaire (Heraeus Function Line BB15)</td><td>Thermo Scientific (Darmstadt, Allemagne)</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse (Heraeus 1S-R)</td><td>Thermo Scientific (Darmstadt, Allemagne)</td><td>\Chlorhydrate</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>de diphénhydramineSigma Aldrich (Taufkirchen, Allemagne)</td><td>D3630</td><td></td></tr><tr><td>Eagle’s Minimum Essential Medium avec 4,5 g/L de D-glucose et 2,2 g/L de NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Allemagne)</td><td>Instrument d’impédance D5671</td><td></td></tr><tr><td>(ECIS Z&theta ;)</td><td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, États-Unis)</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>Réseaux d’électrodes à 8 puits (PET 8W1E)</td><td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, États-Unis)</td><td>\</td><td>Base en PET avec électrode de travail de 0,049 mm2 et contre-électrode de ~50 mm2 (or)</td></tr><tr><td>Réseaux d’électrodes à 96 puits (PET 96W1E+)</td><td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td><td>\</td><td>Base PET avec deux électrodes (or) avec 0,256 mm2 surface totale d’électrode</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FCS)</td><td>Biochrom (Berlin, Allemagne)</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate d’histamine</td><td>Carl Roth (Karlsruhe, Allemagne)</td><td>4017.1</td><td></td></tr><tr><td>Hotte à flux laminaire (Herasafe, KS 12)</td><td>Thermo Scientific (Darmstadt, Allemagne)</td><td>51022515</td><td>enceinte de sécurité classe II</td></tr><tr><td>Leibovitz' L-15 medium</td><td>Thermo Scientific (Darmstadt, Allemagne)</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Allemagne)</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette large (100 - 1000 &micro ; L)</td><td>Brandt (Wertheim, Allemagne)</td><td>704780</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette grande (20 - 200 &micro ; L)</td><td>Brandt (Wertheim, Allemagne)</td><td>704778</td><td></td></tr><tr><td>Microscope (contraste de phase, Nikon Diaphot)</td><td>Nikon (D&uuml ; sseldorf, Allemagne)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Allemagne)</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Allemagne)</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique</td><td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Allemagne)</td><td>607 180</td><td></td></tr><tr><td>Pipette (accu-jet pro)</td><td>Brandt (Wertheim, Allemagne)</td><td>26300</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Allemagne)</td><td>T4174</td><td>dans PBS avec tube EDTA de 1 mM</td></tr><tr>, tube Greiner bio-one de<td>15 mL</td><td>(Frickenhausen, Allemagne)</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>tube, 50 mL</td><td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Allemagne)</td><td>210 261</td><td></td></tr><tr><td>cellules U-373 MG</td><td>ATCC (Rockville, MD, États-Unis)</td><td>Bain-marie ATCC HTB-17</td><td></td></tr><tr><td>(TW21)</td><td>Julabo (Seelbach, Allemagne)</td><td>\</td><td></td></tr></tbody></table>

protocole de dosage stepwise pour un débit accru dans les essais gpcr sans étiquette

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Les essais sans étiquette basés sur l’impédance sont de plus en plus utilisés pour étudier non invasivement l’activation du GPCR induite par ligand dans les expériences de culture cellulaire. L’approche fournit une surveillance cellulaire en temps réel avec une résolution de temps dépendante de l’appareil jusqu’à plusieurs dizaines de millisecondes et il est hautement automatisé. Toutefois, lorsque le nombre d’échantillons est élevé (p. ex., des études de dose-réponse pour divers ligands différents), le coût des tableaux d’électrodes jetables ainsi que la résolution de temps disponible pour les enregistrements séquentiels de puits par puits peuvent devenir limitatifs. Par conséquent, nous présentons ici un protocole d’addition agoniste en série qui a le potentiel d’augmenter considérablement la production d’essais GPCR sans étiquette. À l’aide du protocole d’addition d’agoniste en série, un agoniste du GPCR est ajouté de façon séquentielle en augmentant les concentrations à une seule couche cellulaire tout en surveillant continuellement l’impédance de l’échantillon (mode agoniste). Avec cette approche sérielle, il est maintenant possible d’établir une courbe dose-réponse complète pour un agoniste GPCR à partir d’une seule couche cellulaire. Le protocole d’addition agoniste en série s’applique à différents types de couplage GPCR, Gq Gi/0 ou Gs et il est compatible avec les niveaux d’expression recombinants et endogènes du récepteur à l’étude. Le blocage des récepteurs par les antagonistes du GPCR est également évaluable (mode antagoniste).

Un schéma typique pour la préparation des différentes solutions agonistes est montré pour une expérience utilisant des réseaux d’électrodes à 8 puits avec l’histamine comme agoniste dans les tableaux 1-4. Le tableau 1 et le tableau 2 présentent des volumes et des concentrations pour une expérience utilisant le mode d’ajout 1 (cf., figure 1), tandis que les volumes et les concentrations des points 3 et <stron...

Ce protocole démontre l’enregistrement en temps réel des relations dose-réponse complètes pour l’activation du GPCR induite par agoniste à partir d’une seule couche cellulaire cultivée sur un seul microélectrode à l’aide de mesures d’impédance sans étiquette. Le nouveau schéma de dosage augmente considérablement le débit sans perte de résolution de temps.

Protocole de dosage stepwise pour un débit accru dans les essais GPCR sans étiquette

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

Ce protocole permet l’enregistrement d’une relation complète de réponse fonctionnelle à la concentration de l’agoniste GPCR à partir d’une population cellulaire et fournit une caractérisation agoniste détaillée, même pour les faibles nombres d’échantillons cellulaires. Le principal avantage du dosage en série est l’augmentation du débit puisqu’un seul puits est suffisant pour une analyse complète de la réponse à la concentration. Cette technique est bien adaptée pour étudier la transduction unique dans des modèles biologiques rares et complexes, comme les formats d’orgue sur puce dans des contenants microfluidiques fermés.Le protocole n’est pas difficile à exécuter, à condition que l’équipement approprié soit disponible. La préparation des différentes solutions de ligand GPCR à la bonne concentration est la clé du succès. Michael Skiba, étudiant diplômé, et Anne Mildner, étudiante de premier cycle, de notre laboratoire démontreront la procédure.Pour l’ensemencement cellulaire sur les tableaux d’électrodes, ajoutez la concentration appropriée des cellules aux puits de chaque réseau d’électrodes et laissez les cellules s’installer homogènement sur le fond du puits pendant 10 à 15 min

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