Protocole de dosage stepwise pour un débit accru dans les essais GPCR sans étiquette

Ce protocole permet l’enregistrement d’une relation complète de réponse fonctionnelle à la concentration de l’agoniste GPCR à partir d’une population cellulaire et fournit une caractérisation agoniste détaillée, même pour les faibles nombres d’échantillons cellulaires. Le principal avantage du dosage en série est l’augmentation du débit puisqu’un seul puits est suffisant pour une analyse complète de la réponse à la concentration. Cette technique est bien adaptée pour étudier la transduction unique dans des modèles biologiques rares et complexes, comme les formats d’orgue sur puce dans des contenants microfluidiques fermés.

Le protocole n’est pas difficile à exécuter, à condition que l’équipement approprié soit disponible. La préparation des différentes solutions de ligand GPCR à la bonne concentration est la clé du succès. Michael Skiba, étudiant diplômé, et Anne Mildner, étudiante de premier cycle, de notre laboratoire démontreront la procédure.

Pour l’ensemencement cellulaire sur les tableaux d’électrodes, ajoutez la concentration appropriée des cellules aux puits de chaque réseau d’électrodes et laissez les cellules s’installer homogènement sur le fond du puits pendant 10 à 15 minutes à température ambiante. Après au moins 36 heures dans un incubateur standard de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, inspectez les couches cellulaires par microscopie à contraste phase afin d’assurer une couverture complète de chaque électrode avec des cellules. Remplacez ensuite le milieu de culture cellulaire dans chaque puits par le volume approprié de milieu préchauffé et sans sérum.

Pour commencer un enregistrement d’impedance, placez le tableau d’électrode dans le support de tableau de raccordement de l’analyseur d’impedance, et confirmez un contact approprié de faible impedance entre les électrodes et l’analyseur d’impedance. Sélectionnez le type d’électrode et/ou le format multi-puits dans l’interface utilisateur du logiciel. Si des modes d’acquisition de données à fréquence unique et multiple sont disponibles et que le nombre de puits à analyser est faible ou si la résolution du temps n’est pas critique, sélectionnez des enregistrements à fréquences multiples.

Pour assurer une résolution de temps maximale, sélectionnez une fréquence de surveillance unique. Ensuite, commencez l’acquisition des données de cours de temps, et sélectionnez le dossier de données pour savoir où enregistrer les données. Les lectures d’impédance seront enregistrées au nombre spécifié de fréquences pour chaque puits Pour initier le protocole d’ajout en série en mode agoniste pour un tableau de huit puits, ajoutez 30 microlitres de la plus faible concentration de l’agoniste d’intérêt pour les cellules.

Ensuite, laissez les cellules répondre et équilibrer pendant la période prédéfinie avant d’ajouter 30 microlitres de la concentration la plus élevée suivante jusqu’à ce que chaque dilution en série de l’agoniste ait été ajoutée. Pour analyser les données, soustrayez l’impedance du dernier point de données avant le premier ajout de solution agoniste, et définissez l’heure de l’ajout zéro pour normaliser les valeurs d’impédance. Tracez le cours du temps de l’impedance normalisée, et tracez les cours de temps individuels pour identifier les maxima dans l’impedance après chaque étape d’addition.

Composez une fiche de données avec ces valeurs et tracez les valeurs de changement maximal d’impédance en fonction de la concentration agoniste. Utilisez ensuite une routine d’ajustement des données pour déterminer les concentrations efficaces demi-maximales et la réponse maximale à l’aide du modèle logistique à quatre paramètres. Dans cette expérience représentative, 10 solutions avec des concentrations croissantes d’histamine ont été séquentiellement ajoutées aux cellules toutes les 15 minutes, et le changement d’impedance a été mesuré à chaque point de temps.

Les changements d’impédance pourraient alors être tracés en fonction de la concentration d’histamine et de la fonction de transfert d’un modèle logistique à quatre paramètres adapté aux points de données expérimentaux de sept puits. Pour tenir compte de la downregulation possible des récepteurs de l’histamine, de la désensibilisation cellulaire ou de la surstimulation, la plage de données pour l’analyse peut être réduite, comme le montre cette expérience unique de dosage en série. L’optimisation à trois paramètres peut ensuite être appliquée aux données, fournissant une concentration effective demi-maximale de 0,75 plus ou moins 0,12 micromolaire pour cette analyse.

L’ajout de la diphenhydramine antagoniste de récepteur d’histamine 20 minutes avant que la première histamine ait comme conséquence une augmentation retardée de l’impedance dans le schéma de dosage périodique, correspondant à la nécessité d’un agoniste plus élevé pour obtenir une réponse cellulaire. Dans la relation de réponse de dose, l’effet de l’antagoniste est exprimé comme un décalage vers la droite des courbes, correspondant à une augmentation de la concentration effective demi-maximale, à condition que l’antagoniste soit un ligand concurrentiel par rapport à l’agoniste. L’application réussie du schéma de dosage en série est techniquement facile, mais nécessite une planification réfléchie, car il est difficile d’effectuer toutes les étapes avec le bon timing.

Le dosage en série a ouvert la voie à l’exécution d’études de réponse à la concentration avec d’autres systèmes de lecture qui sont limités en ce qui concerne le nombre d’échantillons surveillés en parallèle. Les avantages particuliers du dosage en série permettent l’étude de la transduction du signal à médier par les récepteurs avec des readouts complètement nouveaux qui sont sensibles à d’autres changements phénotypiques, comme la cytomécanique. S’il vous plaît porter des gants et des lunettes lors de la préparation des solutions de stock de l’agoniste récepteur, car ils peuvent être dangereux lorsqu’ils sont inhalés ou avalés.