Appliquer l’imagerie cellulaire en direct et la tomographie cryo-électronique pour résoudre les caractéristiques spatiotemporales du système de sécrétion Legionella pneumophila Dot/Icm

Ce protocole est utile pour caractériser les fonctions d’assemblage des complexes de sécrétion bactérienne et peut conduire à une compréhension fondamentale des mécanismes moléculaires qui sont nécessaires pour les interactions pathogènes de l’hôte. Cette technique intègre des approches complémentaires qui préservent la structure indigène de l’échantillon et permettent et voient la visualisation des complexes de protéines dans les cellules bactériennes intactes. Il augmente notre compréhension des relations de fonction structurelle des systèmes de sécrétion bactérienne.

Cette méthode peut être adaptée pour étudier d’autres types de systèmes de sécrétion ou d’autres complexes cellulaires chez une grande variété d’espèces bactériennes. Commencez par faire des tampons agarose pour l’imagerie cellulaire vivante. Préparez environ 30 mL de solution d’agarose à faible fond de 1 % dans l’eau et faites-le cuire au micro-ondes dans un flacon de verre pendant environ 90 secondes en le tourbillonnant de temps en temps jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute.

Placez deux glissières en verre de 22 par 22 par 0,15 mm sur le bord d’une glissière en verre de 25 x 75 par 1,1 mm l’une sur l’autre. Ensuite, empilez deux autres des diapositives plus petites sur l’autre bord. Pipette environ 1 mL de l’agarose fondue dans la glissière centrale entre les deux glissières supérieures en verre et placer une autre grande glissière sur le dessus de l’agarose fondue en s’assurant d’éviter la formation de bulles d’air.

Refroidir les toboggans à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes, puis utiliser un scalpel ou une lame de rasoir pour couper délicatement le tampon en petits carrés. Fixez un cadre adhésif à double face sur une glissière en verre de 25 par 75 par 1,1 mm et placez plusieurs coussinets sur la glissière. Dissoudre une lourde parcelle de Legionella Pneumophila dans 1 mL d’eau double distillée.

Puis vortex et pipette deux à trois microlitres de la dilution sur les plaquettes. Placez délicatement un glissement de couvercle de 58 par 24 par 0,15 mm sur le cadre adhésif. Sélectionnez des cellules pour l’imagerie à l’aide d’un éclairage de champ lumineux.

Puis, dans la fenêtre de capture du logiciel du microscope, Ajustez le ND à 180 et le binning à deux par deux. Utilisez le canal de 488 nanomètres pour exposer l’échantillon pendant 500 à 1000 millisecondes et valider la spécificité de la fluorescence par imagerie non étiquetée Legionella Pneumophila avec les mêmes paramètres. Pour quantifier la polarité, ajustez le contraste d’image de sorte que les bactéries soient clairement visibles.

Puis zoomer sur la région d’intérêt et utiliser l’outil région pour placer un rectangle de 0,25 par 1,3 micromètre à partir du pôle et s’étendant dans le cytoplasme en s’assurant que le rectangle reste à l’intérieur des frontières bactériennes. Marquez au moins 200 bactéries et créez des masques en utilisant la région pour masquer le bouton dans le menu analyse. Cliquez sur les statistiques du masque et choisissez l’objet sous la portée du masque.

Marquez ensuite l’intensité moyenne et la variance sous les caractéristiques et l’intensité. Exportez les données sous forme de fichier texte et utilisez l’application de feuille de calcul pour calculer les scores de polarité de chaque bactérie comme rapport entre la variance et l’intensité moyenne. Pour les applications à haut débit, utilisez la microscopie de contraste de visage pour acquérir des images à double canal.

Assurez-vous de choisir les champs de vision où les bactéries sont complètement séparées. Ensuite, ajustez le contraste du canal du visage de l’image à un niveau où les bactéries sont clairement visibles. Ouvrez l’image du double canal et lancez la fenêtre masque de segment de création.

Ajustez le seuil approprié, puis retirez les petits objets en cliquant sur le bouton définir les objets et en ajustant la taille minimale à 100 pixels. Sous masque d’affinement, sélectionnez enlever les bords des objets et séparer les masques de bactéries qui sont adjacents les uns aux autres. Pour quantifier la dynamique des protéines de fusion, ouvrez la fenêtre de capture d’image et marquez le laps de temps.

Entrez deux dans la boîte de points de temps. Acquérir deux images réussies de Legionella Pneumophila exprimant la protéine fluorescente d’intérêt. Ajustez le contraste d’image jusqu’à ce que les cellules soient clairement visibles.

Ensuite, utilisez l’outil région pour placer un carré de 0,25 micromètre par 0,25 au milieu d’au moins 400 cellules. Ensuite, utilisez la région pour masquer le bouton dans le menu d’analyse pour créer un masque des carrés d’intérêt. Créez un nouveau masque vide et utilisez l’outil pixel pour marquer toute la zone cellulaire d’au moins 25 cellules aléatoires.

Créez un autre masque et utilisez le grand outil de brosse pour marquer les zones entre les cellules. Enfin, sélectionnez les statistiques du masque et assurez-vous que l’objet est sélectionné sous la portée du masque pour le masque un. Sous les caractéristiques et l’intensité, choisissez l’intensité moyenne.

Exportez les données et répétez le processus pour masque 2. Pour le masque 3, sélectionnez l’ensemble du masque et exportez l’intensité moyenne. Pour préparer l’échantillon de cryotomographie électronique, cultivez une tache lourde de Legionella Pneumophila sur les plaques d’agrastreptomisum de CYE pendant 48 heures à 37 degrés Celsius.

Resuspendez les cellules dans l’eau à un OD 600 d’environ 0,7. Ajoutez ensuite cinq microlitres de particules d’or colloïdaux à 20 microlitres de la suspension cellulaire. Glow décharge une grille de carbone trouée et pipette cinq microlitres du mélange cellulaire sur elle.

Laisse-le reposer une minute. Épongez la grille avec du papier filtre et congelez-la dans de l’éthane liquide à l’aide d’un appareil de plongée à gravité. Après avoir inséré le superfolder GFP dans le chromosome legionella pneumophila, la microscopie fluorescente de cellules vivantes a été exécutée pour comparer le signal fluorescent avec celui de la souche négative parentale de GFP de superfolder.

En outre, la microscopie de champ lumineux a été employée pour examiner la proportion des cellules avec un signal fluorescent spécifique. Seule une fraction des cellules qui ont produit dotb superfolder GFP a montré la localisation polaire de la protéine de fusion. Lors de la caractérisation de la distribution du signal fluorescent DotB, il a été constaté que l’intensité du superfolder DotB GFP aux pôles était environ deux fois plus élevée que dans le cytosol.

Pour étudier si dotb superfolder GFP localisation polaire dépendait d’un système de sécrétion de type quatre entièrement assemblé, les scores de polarité du superfolder DotB GFP ont été déterminés pour les cellules individuelles dans un type sauvage, et dans un mutant système de sécrétion de type quatre. En effet, le positionnement polaire du superfolder DotB GFP a disparu lorsque le système Dot/ICM a été supprimé. Les modèles dynamiques ont indiqué que l’ATPase de DotB était présent dans une population cytosolic dynamique et a été recruté au système localisé polarisé de sécrétion de type quatre de point/ICM à une réaction tardive d’assemblage.

Cryo-ET à haut débit a été utilisé pour visualiser l’appareil intact de système de sécrétion de type quatre dans une souche legionella pneumophila exprimant dotb superfolder GFP. La reconstruction de la cellule a révélé plusieurs machines Dot/ICM intégrées dans l’enveloppe cellulaire. Le positionnement global de DotB et superfolder GFP par rapport à la machine intacte de système de sécrétion de type quatre a également été déterminé.

Les rendus de surface tridimensionnels indiquaient que le superfolder GFP est placé sous l’hexamer DotB, qui s’assemble sous forme de disque à la base du complexe cytoplasmique ATPase. Lorsque vous essayez cette technique, assurez-vous d’évaluer la stabilité des protéines de fusion et la fonctionnalité du système de sécrétion d’étiquettes avant de procéder à l’acquisition d’images. La modélisation et l’ajustement peuvent être des moyens efficaces d’analyser les modèles dynamiques et les densités structurelles ainsi que pour l’évaluation des changements conformationnels ou la localisation des sous-unités dans la structure.

Cette approche peut aider à comprendre comment fonctionnent les différents composants du système secret de type quatre, comment ils interagissent au sein du plus grand complexe et quelles fonctions les différents sous-ensembles exécutent.