Name: Analyse de la consommation doxygène des primates non humains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Découvrez la mesure de la consommation d'oxygène dans les îlots pancréatiques de primates non humains. Cette technique évalue la fonction mitochondriale et améliore la reproductibilité des analyses avec de petits échantillons.

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Les auteurs aimeraient remercier le Vanderbilt High Throughput Screening Core pour l'utilisation de leurs installations, Agilent Biotechnologies, le Dr Paul Kievit (Oregon Health and Science University) pour les isolements non humains des îaux de primates, et Eric Donahue (Université Vanderbilt) pour l'aide à la figure 1. J.M.E. a été soutenu par nigMS des National Institutes of Health sous le numéro de récompense T32GM007347. M.G. a reçu l'appui des NIH/NIDDK (R24DK090964-06) et du ministère des Anciens Combattants (BX003744).

1. Préparation de microplaque et de cartridge de capteur le jour précédant l'exécution de l'essai
Les îlots ont été isolés des macaques japonais de trois ans comme précédemment décrit13. Cette méthode est très similaire à celle utilisée pour isoler les îlots humains des donneurs de cadavres, mais diffère des souris, dans lesquelles les pancréatas sont souvent gonflés avec une solution de collagène alors que l'animal est sous sédation et avant l'ablation des organes. La récupération des îpliers a été effectuée conformément aux lignes directrices du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) du Centre national de recherche sur les primates de l'Oregon (ONPRC) et de l'Université de la santé et des sciences de l'Oregon et a été approuvée par l'ONPRC IACUC. L'ONPRC se conforme à la Loi sur le bien-être des animaux et aux règlements appliqués par le Département de l'agriculture des États-Unis (USDA) et à la Politique du Service de santé publique sur les soins humains et l'utilisation des animaux de laboratoire conformément au Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire publié par les National Institutes of Health.
<ol><li>Préparation de Spheroid Microplate<ol>
<li>Préparer 3 ml d'une solution de 0,1 Mde de bicarbonate de sodium. Filtrer stériliser la solution. Nous avons utilisé un filtre de 0,45 m (Tableau des matériaux).</li>
		<li>Dans une hotte de culture cellulaire, ajouter 200 l d'adhésif cellulaire et tissulaire (Tableau des matériaux) à 2,8 ml de bicarbonate de sodium de 0,1 m. Ensuite, ajoutez 20 L de cette solution au fond de chaque puits de la microplaque sphéroïde de 96 puits(Tableau des Matériaux). Assurez-vous que les bulles d'air sont retirées de la pointe du tuyau et que seul le fond de la plaque est recouvert. Le revêtement de la microplaque empêche les îlots de remonter les côtés des puits lorsque des médicaments sont ajoutés et mélangés dans le puits pendant l'analyse. REMARQUE: Il n'est nécessaire d'enrober que le plus grand nombre de puits que pour les îlots lorsque l'essai est exécuté. Si seulement quelques puits sont utilisés, la solution adhésive cellulaire peut être mise à l'échelle de manière appropriée. L'adhésif cellulaire utilisé dans l'assay est une solution de protéines formulée extraite de la moule marine. Alternativement, les puits microplaques peuvent être enduits de 20 l de 100 g/mL de poly-lysine.</li>
		<li>Incuber la plaque dans un incubateur de 37 oC, non-CO2 pendant une heure.</li>
		<li>Dans un environnement stérile, aspirez la solution adhésive de cellules de la plaque. Laver chaque puits deux fois à l'aide d'une canalisation multicanal de 400 oL de 37 oC d'eau stérile. Laisser sécher à l'air.</li>
		<li>Après 30-40 minutes, couvrir l'assiette et le conserver toute la nuit à 4 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hydratation de la cartouche de capteur<ol>
<li>Dans un environnement stérile, ouvrez le paquet de cartouches de capteur(Tableau des matériaux) et retirez le contenu. Placez la cartouche du capteur à l'envers à côté de la plaque d'utilité.</li>
		<li>Remplissez chaque puits de la plaque d'utilité avec de l'eau stérile de 200 l et abaissez la cartouche du capteur dans la plaque d'utilité. Placez la cartouche de capteur assemblée et la plaque d'utilité dans un incubateur de 37 oC et non CO2 pendant la nuit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de Calibrant<ol>
<li>Aliquot 25 ml de calibrant (Table of Materials) dans un tube conique de 50 ml. Placer le tube dans un incubateur de 37 oC et non CO2 pendant la nuit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Protocole pour la préparation des médias, le chargement des îlots et le chargement de la cartouche de capteur le jour de l'essai
<ol><li>Préparation des médias<ol>
<li>À 48,5 ml de support de base (dMEM minimal, voir Tableau des matériaux),ajoutez 500 l chacun de 1 mM de pyruvate de sodium et 2 mM de glutamine. De plus, ajoutez 496 l de glucose de 200 mg/ml (la concentration finale de glucose dans les médias est de 5,5 mM). REMARQUE: La concentration de glucose de base a été maintenue constante pour ces expériences. Cependant, le glucose peut également être employé pour stimuler la respiration en plus des manipulations pharmacologiques décrites coup10.</li>
		<li>Confirmez que le pH est de 7,4 euros/- 0,1, en ajustant si nécessaire.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de la cartouche de capteur<ol>
<li>Sortez la cartouche du capteur de l'incubateur, retirez le couvercle de la cartouche du capteur et jetez l'eau des puits. Placer 200 ml de calibrant préréchauffé dans chaque puits et remplacer le couvercle de la cartouche du capteur.</li>
		<li>Remettre la cartouche du capteur dans l'incubateur pendant environ 1 heure (jusqu'à ce que nécessaire).</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de médicaments pour l'analyse du stress mitochondrial<ol>
<li>Ouvrez le kitdetest de résistance ( Table of Materials ) et retirez le contenu. Maquillage de stock et de solutions de travail pour Oligomycin, Carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP), et Rotenone/Antimycin A (AA) comme suit.<ol>
<li>Oligomycine : ajouter 630 l de supports assemblés au tube pour faire 100 millions de stock. Ensuite, diluer à 45 M avec des supports pour obtenir la concentration du port (la concentration finale du puits après l'injection sera de 4,5 M)</li>
			<li>FCCP : ajouter 720 l de supports assemblés au tube pour faire 100 millions de stock. Diluer à 10 M avec des supports pour obtenir la concentration du port (la concentration finale du puits sera de 1 M) REMARQUE: BSA et/ou FBS ne doivent pas être ajoutés aux médias, car cela peut affecter l'action des découpleurs mitochondriaux14.</li>
			<li>Rotenone/AA : ajouter 540 l de supports assemblés au tube pour faire 50 m de stock. Diluer à 25 M avec des supports pour obtenir la concentration du port (la concentration finale du puits sera de 2,5 M) REMARQUE: Les concentrations ci-dessus ont produit des résultats cohérents dans nos mains. Le FCCP additionnel n'a mené à aucune autre augmentation de la respiration. Cependant, les concentrations de médicaments peuvent devoir être ajustées en fonction de la taille des îlots, et en particulier des îlots de différentes espèces ou des sphéroïdes non-îlots. À titre de référence, le diamètre moyen d'un îf-îb de primate non humain est d'environ 150 m15.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de la plaque sphéroïde et transfert d'îlots<ol>
<li>Choisissez à la main des îlots pancréatiques dans un plat de culture cellulaire de 60 mm x 15 mm contenant des supports assemblés pour obtenir une pureté de près de 100 %. REMARQUE: Les îlots doivent apparaître arrondis, avec une périphérie clairement définie, et semblent plus denses que les contaminants des tissus exocrines. Évitez les îlots qui semblent endommagés ou effilochés. Dans cette expérience, la taille des îlots n'a pas été mesurée directement, bien que nous ayons tenté de cueillir des îlots de taille approximativement équivalente pour chaque puits et échantillon.</li>
		<li>Chargez chaque puits de microplaque sphéroïde avec 175 l de supports assemblés à l'aide d'une pipette multicanal.</li>
		<li>À l'aide d'une pipette P20 fixée à 15 l, aspirez 15 îlots à partir d'un plat de culture cellulaire. Les îlots doivent être visibles à l'œil nu dans la pipette.</li>
		<li>Pour transférer les îlots à la microplaque sphérique, la pointe de pipette inférieure au fond du puits, à peine soulever, et lentement pipette sur un très petit volume (5 l). Confirmez que tous les îlots ont quitté la pointe de la pipette. Chaque puits devrait recevoir 15 îlots. Vérifier occasionnellement la microplaque sphéroïde sous le microscope pour vérifier que les îlots sont au fond de chaque puits plutôt que collés sur les côtés. REMARQUE: Évitez de charger les puits d'angle avec des îlots. L'oxygène et le pH flux hors du plastique peut se produire pendant l'analyse, et cela est exacerbé dans les quatre puits d'angle.</li>
		<li>Une fois que tous les îlots ont été transférés sur la microplaque sphéroïde, incuber la microplaque dans un incubateur de 37 oC, non-CO2, tout en complétant les étapes ci-dessous.</li>
	</ol></li>
	<li>Chargement de la cartouche du capteur et exécution de l'assay<ol>
<li>Retirez la cartouche du capteur de l'incubateur. Les ports A-C pour chaque puits doivent être chargés de drogue ou de médias. Les puits contenant des îlots et les quatre puits d'angle doivent être chargés de drogue. Les puits sans coin sans îlots doivent être chargés de supports. Port D peut être laissé vide. Chargez le port A (en haut à gauche de chaque capteur) avec 20 l d'oligomycine ou de support. Chargez le port B (en haut à droite) avec 22 L de FCCP ou de médias. Chargez le port C (en bas à gauche) avec 25 oL de Rotenone/AA ou de médias.</li>
		<li>Programmez un analyseur de flux extracellulaire pour une période de respiration de ligne de 30 minutes (5 cycles de mélange de 3 minutes, mesure de 3 minutes), période de mesure de 42 minutes d'oligomycine (7 cycles de mélange de 3 minutes, mesure de 3 minutes), 30 minutes FCCP (5 cycles de mélange de 3 minutes, mesure de 3 minutes), et 30 minutes Rotenone/AA (5 cycles de mélange de 3 minutes, mesure de 3 minutes).</li>
		<li>Exécutez l'essai et suivez les instructions à l'écran pour étalonner le capteur et insérer la microplaque.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Mulder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcribing+%CE%B2-cell+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transcribing β-cell mitochondria in health and disease.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).</li>
<li>Maechler, P., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+signals+in+glucose-stimulated+insulin+secretion+in+the+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell.</a> The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).</li>
<li>Curry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon+Potentiation+of+Insulin+Secretion+by+the+Perfused+Rat+Pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas.</a> Diabetes. 19 (6), 420(1970).</li>
<li>Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D'Argenio, D. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon+Increases+Insulin+Levels+by+Stimulating+Insulin+Secretion+Without+Effect+on+Insulin+Clearance+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice.</a> Peptides. 88, 74-79 (2017).</li>
<li>Vergari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+inhibits+glucagon+release+by+SGLT2-induced+stimulation+of+somatostatin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion.</a> Nature Communications. 10 (1), 139(2019).</li>
<li>Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+glucagon+secretion%3A+the+%CE%B2%2F%CE%B1%2F%CE%B4+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology--Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model.</a> American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).</li>
<li>Sweet, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+measurement+of+oxygen+consumption+by+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Technology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets.</a> Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).</li>
<li>Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide. , Agilent Technologies. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019).</li>
<li>Wikstrom, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-throughput+assay+for+islet+respiration+reveals+uncoupling+of+rodent+and+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets.</a> PLoS One. 7 (5), e33023(2012).</li>
<li>Taddeo, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+islet+respirometry+reveals+functional+diversity+within+the+islet+population+of+mice+and+human+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors.</a> Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).</li>
<li>Conrad, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAFB+transcription+factor+impacts+islet+alpha-cell+function+in+rodents+and+represents+a+unique+signature+of+primate+islet+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology--Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells.</a> American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).</li>
<li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+plasticity%3A+interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li>
<li>Elsakr, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Western-style+diet+affects+offspring+islet+composition+and+function+in+a+non-human+primate+model+of+maternal+over-nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition.</a> Molecular Metabolism. , (2019).</li>
<li>Soutar, M. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FBS%2FBSA+media+concentration+determines+CCCP%27s+ability+to+depolarize+mitochondria+and+activate+PINK1-PRKN+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">FBS/BSA media concentration determines CCCP's ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy.</a> Autophagy. , 1-10 (2019).</li>
<li>Hirshberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+Islet+Transplantation+Using+the+Nonhuman+Primate+%28Rhesus%29+Model+Predicts+That+the+Portal+Vein+Is+Superior+to+the+Celiac+Artery+as+the+Islet+Infusion+Site%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site.</a> Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Papas, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Oxygen+Consumption+Rate+%28OCR%29+Dose+Predicts+Insulin+Independence+in+Clinical+Islet+Autotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation.</a> PLoS One. 10 (8), e0134428(2015).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

L'étude de la consommation d'oxygène des îlots a déjà été entravée par la forme sphérique des îlots, leur manque d'adhérence aux surfaces de culture et le nombre d'îlots requis par puits. Dans ce protocole, nous soulignons l'efficacité de la microplaque sphéroïde de 96 puits pour mesurer la consommation d'oxygène d'îlots sur un petit nombre d'îlots et démontrons une technique pour la manipulation et le chargement des îlots qui est techniquement faisable et produit cohérente Résultats.
Pour que...

Afin de maintenir des niveaux normaux de glucose dans le sang, la cellule pancréatique doit sentir des élévations dans le glucose et sécrédre l'insuline en conséquence. Le couplage de la sécrétion d'insuline avec les niveaux de glucose est directement lié au métabolisme de glucose et à la production de l'ATP par la phosphorylation oxydative mitochondriale. Ainsi, les mitochondries jouent un rôle critique dans le couplage stimulus-sécrétion1. L'évaluation de la fonction mitochondriale à cellules d'A peut révéler des défauts qui mènent à la sécrétion altérée d'insuline. La sécrétion de glucagon par les cellules pancréatiques est également étroitement liée à la fonction mitochondriale2. Bien que les lignées cellulaires immortalisées d'îlots se soient avérées utiles pour certains types d'essais, la physiologie de ces cellules ne récapitule pas avec précision la fonction des îlots entiers, comme l'illustre la potentialisation de la sécrétion d'insuline par le glucagon3,4 et l'inhibition de la sécrétion de glucagon par l'insuline/somatostatine5,6 dans les îlots intacts. Cela démontre la nécessité de mesurer la consommation d'oxygène à l'aide d'îlots entiers intacts.
Les techniques de mesure de la réspirométrie des cellules des îtaux ont évolué au fil du temps, de l'utilisation de colorants fluorescents sensibles à l'oxygène7 à des capteurs à l'état solide qui mesurent directement la consommation d'oxygène8. Initialement conçus pour monolayer, les cellules adhérentes, les systèmes de plaque de culture cellulaire couramment utilisés se sont avérés inefficaces pour les îlots pancréatiques. Comme les îlots n'adhèrent pas naturellement aux puits, ils sont enclins à être poussés à la périphérie de la culture bien résultant en une mesure inexacte de la consommation d'oxygène9. Pour lutter contre ce problème, des plaques spécialisées de 24 puits avec une dépression centrale qui pourrait contenir des îlots ont été développées9. Cependant, le système de plaque de 24 puits a été limité par le grand nombre d'îlots requis (50-80 par puits) et le nombre de conditions qui pourraient être testées simultanément10. Le développement récent de microplates de 96 puits conçues spécifiquement pour l'analyse des flux extracellulaires chez les sphéroïdes a permis de surmonter ces obstacles, permettant de mesurer la réspirométrie des îlots avec 20 îlots ou moins par puits10.
Ici, nous démontrons l'utilisation de ce système pour mesurer la consommation d'oxygène dans les îlots du macaque japonais (Macaca fuscata), un modèle animal avec la biologie des îlots similaires à l'homme11,12. Dans ce protocole, 15 îlots de macaque sont analysés par puits. Dans nos mains, 15 îlots par puits ont produit une consommation d'oxygène de base plus élevée que moins d'îlots, avec une activation robuste et la répression de la respiration en réponse à la manipulation pharmacologique. Nous soulignons les étapes pour préparer l'effort, une méthode efficace pour le chargement constant des îlots au centre de chaque puits, et des défis communs lors de l'exécution de cet effort.

<table><tbody><tr><td>Boîte de culture cellulaire, style Corning 430166 60 mm X 15 mm</td><td></td><td></td> Colle pour cellules et tissus Corning 354240 Tube conique, 50 mL Falcon 352070 Dextrose anhydre Fisher Scientific BP350-1 Pour solution de glucose, 200 mg/ml, filetée stérile Réservoirs jetables (stériles), 25 ML Vistalab <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>3054-1033</td><td>pour le chargement de la pipette multicanaux</td></tr><tr><td>EZFlow Stérile 0,45 &mu ; m Filtre à seringue PES, 13 mm</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>371-3115-OEM</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>200 mM (100x)</td></tr><tr><td>Pointes de pipette multicanaux</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>94410810</td><td></td></tr><tr><td>Pipette multicanaux, 15-1250 &mu ; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4672100BT</td><td>Pipettes</td></tr><tr><td>P20, P200 et P1000 recommandées</td><td></td><td>Sonde</td> de pH 2231000602 <td></td></tr><tr><td></td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2210-01</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette, 20 &mu ; L, 200 &mu ; L, 1000 &mu ; L</td><td>Olympus</td><td>24-404, 24-412, 24-430</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de base Seahorse XF</td><td>Agilent</td><td>103334-100</td><td></td></tr><tr><td>Kit de test de stress Seahorse XF Cell Mito</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td>Comprend l’oligomycine, le FCCP et la roténone/antimycine Un</td></tr><tr><td>analyseur Seahorse XFe96</td><td>Agilent</td><td>S7800B</td><td>Y compris la station de préparation avec 37 &deg ; C incubateur sans CO2</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Sphéroïde Fluxpak Mini</td><td>Agilent</td><td>102905-100</td><td>Comprend une cartouche de capteur, une microplaque sphéroïde et un calibrateur</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>100 mM (100x)</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Seringue Olympus</td><td>SZX9</td><td></td></tr><tr><td>(stérile), 5 mL</td><td>BD</td><td>309603</td><td>Pour filtration stérile</td></tr><tr><td>Eau (stérile)</td><td>Sigma</td><td>W3500-500mL</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse de la consommation d'oxygène des primates non humains

Analysis of Non-Human Primate Pancreatic Islet Oxygen Consumption

La mesure de la consommation d'oxygène dans les amas sphéroïdes des cellules, telles que les îlots pancréatiques ex vivo, a historiquement été difficile. Nous démontrons la mesure de la consommation d'oxygène d'îtte utilisant une microplaque de 96 puits conçue pour la mesure de la consommation d'oxygène dans les sphéroïdes. Dans cet analyse, les microplaques sphéroïdes sont recouvertes d'un adhésif cellulaire et tissulaire la veille de l'analyse. Nous utilisons un petit volume de solution adhésive pour encourager l'adhérence des îcles au fond du puits. Le jour de l'analyse, 15 îlots sont chargés directement dans la base de chaque puits à l'aide d'une technique qui assure un positionnement optimal des îlots et une mesure précise de la consommation d'oxygène. Divers aspects de la respiration mitochondriale sont sondés pharmacologiquement dans les îlots de primates non humains, y compris la respiration dépendante de l'ATP, la respiration maximale et la fuite de protons. Cette méthode permet des résultats cohérents et reproductibles en utilisant seulement un petit nombre d'îlots par puits. Il peut théoriquement être appliqué à tous les sphéroïdes cultivés de taille similaire.

Pour charger les îlots en microplaque, 15 îlots doivent être aspirés dans 15 ll de support, comme le montre la figure 1A. Les îlots se déposent naturellement vers le fond de la pointe de la tuyauterie en quelques secondes. Ensuite, la pointe de pipet est abaissée au fond du puits. La pointe est très légèrement soulevée, et un petit volume (environ 5 l) est pipetted avec les îlots. Cette technique permet de placer de façon cohérente l'înt au f...

Ce protocole démontre la mesure précise et reproductible de la consommation d'oxygène dans les îlots pancréatiques non-humains de primate. Les techniques de chargement des îfles et le revêtement de la microplaque fournissent un cadre pour une mesure efficace de la respiration dans d'autres types de sphéroïdes cultivés.

Analyse de la consommation d'oxygène des primates non humains

The measurement of oxygen consumption in spheroid clusters of cells, such as ex vivo pancreatic islets, has historically been challenging. We demonstrate ...

Cette méthode permet la quantification de la consommation d’oxygène à partir d’un petit nombre d’îlots provenant d’espèces pertinentes, telles que les primates non humains et les humains, permettant l’évaluation de la fonction mitochondriale. Cette technique peut être effectuée avec un petit nombre d’îlots primaires, augmentant les répliques techniques, permettant l’essai de conditions multiples, et améliorant la rigueur et la reproductibilité de l’analyse. Cette technique évalue la santé mitochondriale, une fonction déterminée majeure de la fonction d’îlot et de sécrétion d’insuline qui est souvent altérée dans le diabète et est un prédicteur significatif de la transplantation réussie d’îlot.Il est essentiel de s’assurer que les îlots sont localisés au centre des puits après le transfert. Si vous ne le faites pas, il n’y a pas de mesures incohérentes de la consommation d’oxygène. Valerie Ricciardi, étudiante de premier cycle travaillant dans mon laboratoire, fera la démonstration de cette procédure.La veille de l’analyse, ajouter 200 microlitres d’adhésif cellulaire et tissulaire à 2,8 millilitres de solution bicarbonate de sodium molaire de 0,1 molaire et ajouter 20 microlitres de la solution résultante au fond de chaque puits d’une microplaque sphéroïde bien sphéroïde de 96 puits. Assurez-vous que toutes les bulles d’air sont retirées de la pointe de la pipette. Lorsque tous les puits ont été chargés, placez la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone.Après une heure, aspirer la solution adhésive cellulaire de la plaque dans un environnement stérile et laver chaque puits deux fois avec 400 microlitres d’eau stérile de 37 degrés Celsius. Ensuite, laissez les puits sécher à l’air libre pendant 30 à 40 minutes avant de couvrir la plaque pour un stockage de nuit à quatre degrés Celsius. Pour hydrater la cartouche du capteur, dans un environnement stérile, ouvrez l’emballage de la cartouche du capteur et retirez le contenu.Placez la cartouche du capteur à l’envers à côté de la plaque utilitaire et remplissez chaque puits de la plaque utilitaire de 200 microlitres d’eau stérile. Lorsque tous les puits ont été chargés, abaissez la cartouche du capteur dans la plaque d’utilité et placez la cartouche de capteur et la plaque d’utilité assemblées dans l’incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le jour de l’analyse, retirez le couvercle de la cartouche du capteur et démentez l’eau des puits de la plaque d’utilité.Ajouter 200 millilitres de calibrant préchauré à chaque puits et remplacer le couvercle de la cartouche du capteur. Ensuite, placez la cartouche du capteur dans l’incubateur pendant environ une heure. Pour préparer les îlots pour le transfert, cueillez à la main les îlots dans un plat de culture cellulaire de 60 x 15 millimètres contenant du milieu assemblé à une pureté proche de 100 %.Lorsque tous les îlots ont été collectés, chargez chaque puits de la microplaque sphéroïde préparée avec 175 microlitres de milieu assemblé et utilisez une pipette P20 réglée sur 15 microlitres pour aspirer 15 îlots dans 15 microlitres de milieu provenant du plat de culture cellulaire. Pour ensemencer les îlots sur la microplaque sphéroïde, abaissez la pointe de la pipette au fond du puits, soulevez à peine la pointe et distribuez lentement environ cinq microlitres de milieu. Pour charger les îlots dans les puits, laissez les îlots s’installer dans la pointe de la pipette avant de les relâcher doucement directement au-dessus du fond du centre du puits dans un petit volume de milieu.Confirmez que tous les îlots ont quitté la pointe pipette, vérifiant occasionnellement la microplaque sphéroïde au microscope pour vérifier que les îlots sont ensemencés au fond de la plaque et ne sont pas collés sur les côtés des puits. Lorsque tous les îlots ont été transférés, placez la microplaque dans l’incubateur de 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone. Avant d’entamer la procédure d’analyse, chargez le port A de la cartouche du capteur avec 20 microlitres d’oligomycine de 45 micromolaires fraîchement préparés, le port B avec 22 microlitres de FCCP 10 micromolaires fraîchement préparés, et le port C avec 25 microlitres de rotenone aa de 25 micromolaires fraîchement préparés. Ensuite, programmez un analyseur de flux extracellulaire pour une période de respiration de base de 30 minutes, une période de mesure de l’oligomycine de 42 minutes, une période fccp de 30 minutes et une période de rotenone AA de 30 minutes.Ensuite, exécutez l’analyse en suivant les instructions sur l’écran pour calibrer le capteur et insérer la microplaque. Pour la livraison d’îlots à la plaque d’analyse, 15 îlots doivent être aspirés dans 15 microlitres de milieu comme illustré. Cette technique se traduira par le placement constant des îlots au centre inférieur de chaque puits de microplaque permettant des mesures précises de la consommation d’oxygène.Dans cette expérience représentative montrant la consommation d’oxygène des puits individuels, les puits étaient mal chargés, ce qui a entraîné un niveau de consommation d’oxygène très faible et peu ou pas de réponse au FCCP. Dans cette expérience, la plupart des puits ont démontré une respiration et une réponse de base significatives aux drogues. Cependant, deux puits n’ont montré aucune réponse à la rotenone, suggérant que le médicament n’a pas été correctement libéré dans le puits.Ces puits ont été exclus d’autres analyses. Ici, les résultats d’un essai réussi dans lequel les puits ont été correctement chargés avec des îlots et correctement injectés avec des drogues peuvent être observés. Il est avantageux de préparer les reagents et les plaques la veille de l’analyse afin de permettre aux îlots d’être utilisés peu de temps après leur isolement ou leur reçu.Après l’analyse, les îlots peuvent être récupérés pour l’extraction de protéines ou d’ADN afin de normaliser les données sur la consommation d’oxygène ou de quantifier la teneur en ADN mitochondrial. La capacité de mesurer la fonction mitochondriale en petit nombre d’îlots primaires de primates permet l’essai de plusieurs médicaments et d’autres manipulations en une seule réplique biologique. Les personnes qui travaillent avec des îlots primaires de primates devraient être sûres d’être formées à la manipulation appropriée et sécuritaire avec ces tissus.En particulier, l’utilisation d’équipement de protection individuelle approprié et l’élimination appropriée de ces échantillons.

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JoVE Journal

Developmental Biology

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