Name: Souris NOG humanisées pour lexposition intravaginale au VIH et le traitement de linfection par le VIH (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Découvrez comment établir un modèle de souris NOG humanisées pour la recherche préclinique sur le VIH. Ce protocole permet d'évaluer différentes souches virales et interventions thérapeutiques.

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Les auteurs tient à remercier le personnel de l'établissement pour animaux de biomédecine de l'Université d'Aarhus, en particulier Mme Jani Kûr pour les efforts d'entretien des colonies et pour le suivi du poids des souris. Les auteurs tiennent à remercier le professeur Florian Klein d'avoir développé une norme de soins et d'avoir été guidé. Le réactif suivant a été obtenu par l'entremise du Programme des agents de lutte contre le sida des NIH, Division du sida, NIAID, NIH : pRHPA.c/2635 (cat 11744) du Dr John Kappes et de la Dre Christina Ochsenbauer.

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

La souche de souris sévèrement immunocompromise NOD. Cg-PrkdccidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) est extrêmement bien adapté pour la transplantation de cellules et de tissus humains. Les voies immunitaires innées et adaptatives chez ces souris sont compromises. Les souris NOG et NSG abritent une mutation descid de Prkdc qui a comme conséquence la fonction défectueuse de cellules de T et de B. En outre, ces souris n'ont pas un récepteur fonctionnel interleukin-2...

Le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) est une infection chronique avec plus de 37 millions de personnes infectées dans le monde1. La thérapie antivirale combinée (cART) est un traitement salvateur, mais un traitement est toujours justifié. Il est donc nécessaire d'avoir des modèles animaux qui reflètent le système immunitaire humain et ses réponses afin de faciliter la poursuite de la recherche sur le VIH. Plusieurs types de souris humanisées qui sont capables de soutenir l'engraftment cellulaire et tissulaire ont été développés en transplantant des cellules humaines dans des souris sévèrement immunodéficientes2. Ces souris humanisées sont sensibles à l'infection par le VIH et constituent une alternative importante aux modèles non humains de virus de l'immunodéficience simienne des primates, car elles sont moins chères et plus simples à utiliser que les primates non humains. Les souris humanisées ont facilité la recherche sur la transmission virale du VIH, la pathogénie, la prévention et le traitement3,4,5,6,7,8,9,10,11.
Nous présentons un système modèle humanisé flexible pour la recherche sur le VIH mis au point en transplantant des cellules souches humaines dérivées du sang de cordon ombilical chez des souris de la NoD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) fond. En plus d'être d'origine non fœtale, la bioingénierie pratique de ces souris est moins exigeante techniquement par rapport aux procédures microchirurgicales impliquées dans la transplantation de la construction sang-foie-thymus (BLT).
Nous montrons comment établir l'infection par le VIH par transmission intravaginale et comment surveiller la charge virale plasmatique avec une configuration pcR numérique sensible de gouttelette (ddPCR). Par la suite, nous décrivons l'établissement de la cART standard donnée dans le cadre du régime quotidien de souris. L'objectif de ces méthodes combinées est de réduire le stress pour les animaux et de faciliter les expériences à grande échelle où le temps passé à manipuler chaque animal est limité12.
Chez l'homme, un génotype CCR5no 32/wt ou CCR55 et32 cause une réduction de la sensibilité à l'infection par le VIH par les virus émetteurs/fondateurs13, et certaines précautions doivent être prises lorsque la bioingénierie humanise des souris avec des cellules souches aux fins d'études sur le VIH. Cela est particulièrement vrai dans notre région parce que les variantes naturelles du gène CCR5, en particulier les suppressions de 32 euros, sont plus répandues dans les populations indigènes scandinaves et baltes que dans le reste du monde14,15. Ainsi, notre protocole inclut un test facile et à haut débit pour le dépistage des cellules souches hématopoïétiques des donneurs pour les variantes CCR5 avant la transplantation.
Pour l'exposition intravaginale nous avons choisi l'émetteur/fondateur R5 virus RHPA4259, isolé d'une femme dans un stade précoce de l'infection qui a été infecté intravaginally16. Nous avons exposé les souris à une dose virale qui était suffisante pour produire une transmission réussie dans la majorité des souris, mais en dessous d'un taux de transmission de 100%. Le choix d'une telle dose permet une plage dynamique suffisante du taux de transmission, de sorte que les effets antiviraux d'un candidat médicament peuvent entraîner des animaux protégés dans des expériences de prévention du VIH et une diminution de la charge virale pour les études de traitement.

<table><tbody><tr><td>Tampon bleu</td><td>VWR</td><td>56616-031</td><td>Doit être stérilisé avant utilisation</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8022</td><td></td></tr><tr><td>CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7</td><td>BD Bioscience</td><td>557835</td><td></td></tr><tr><td>CD3 (clone OKT3) FITC</td><td>Biolegend</td><td>317306</td><td></td></tr><tr><td>CD3 (clone SK7) BUV395</td><td>BD Bioscience</td><td>564001</td><td></td></tr><tr><td>CD34 (clone AC136) FITC</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-740</td><td></td></tr><tr><td>CD4 (clone SK3) BUV 496</td><td>BD Bioscience</td><td>564652/51</td><td></td></tr><tr><td>CD45 (clone 2D1) APC</td><td>Biolegend</td><td>368511/12</td><td></td></tr><tr><td>CD8 (clone RPA-T8) BV421</td><td>BD Bioscience</td><td>562428</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix pour sondes (pas de dUTP)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863025</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck</td><td>10,02,95,21,000</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>D4263</td><td>Pour tampon de suspension</td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Life Technologies</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Biowest</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Sang de cordon humain CD34 Kit de sélection positive II</td><td>Stemcell</td><td>17896</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>FACS Solution de lyse 10X</td><td>BD</td><td>349202</td><td>Diluer 1:10 dans dH20 immédiatement avant utilisation</td></tr><tr><td>Tubes FACS (Falcon 5 mL round-botton)</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Fc Solution de blocage des récepteurs (Human Trustain FcX)</td><td>Biolegend</td><td>422302</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovin</td><td>sérum Sigma</td><td>F8192-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo v.10</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gaze</td><td>Mesoft</td><td>157300</td><td>Doit être stérilisé avant utilisation</td></tr><tr><td>Lampe</td><td></td><td></td> chauffante <td></td></tr><tr><td>Hémacytomètre sur mesure (B&uuml ; rker-T&uuml ; rk)</td><td>VWR</td><td>DOWC1597418</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane gaz</td><td>Orion Pharma</td><td>9658</td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa X20 cytomètre en flux</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation, PCR-PT approuvé</td><td>Sarstedt</td><td>72692405</td><td></td></tr><tr><td>Souris cART food</td><td>sniff Spezialdi&auml ; ten GmbH</td><td>Produit</td><td></td>sur mesure</tr><tr><td>Frein</td><td></td> de souris Produit <td>sur</td><td></td>mesure</tr><tr><td>Aiguille, Microlance 3, 30G &frac12 ; "</td><td>BD</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>NOG souris NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac</td><td>Taconic</td><td>NOG-F</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>Produits chimiques VWR</td><td>436912C</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin 96 Kit d’isolement de l’ADN et de l’ARN du virus</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740691</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger approuvés par PCR</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.405</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pénicilline-streptomycine 100X</td><td>Biowest</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start II DNA polymérase</td><td>Life Technologies</td><td>F549S Pointes de</td><td></td></tr><tr><td>pipette, stériles, ART 20P Barrier</td><td>ThermoScientific</td><td>2149P</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>NEB</td><td>100005398</td><td></td></tr><tr><td>QuantaSoft software</td><td>Bio-Rad</td> QX100 Droplet Generator Bio-Rad <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>1886-3008</td><td></td></tr><tr><td>QX100 Droplet Reader</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3003</td><td></td></tr><tr><td>Solution de lyse des globules rouges</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>DNAse sans RNase taille F + tampon de réaction</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740963</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT Inhibiteur de la ribonucléase recombinante</td><td>ThermoScientific</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Biowest</td><td>L0501-500</td><td>Dissoudre dans H20</td></tr><tr><td>Softject Seringue de 1 mL</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010-200V0</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Transcriptase inverse</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker</td><td>VWR</td><td>89370-910</td><td></td></tr><tr><td>Trypane blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Virkon S (désinfectant antivirus)</td><td>Dupont</td><td>Référence 7511</td><td></td></tr></tbody></table>

souris nog humanisées pour l'exposition intravaginale au vih et le traitement de l'infection par le vih

Humanized NOG Mice for Intravaginal HIV Exposure and Treatment of HIV Infection

Les souris humanisées fournissent une plate-forme sophistiquée pour étudier la virologie du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) et pour tester les médicaments antiviraux. Ce protocole décrit l'établissement d'un système immunitaire humain chez les souris adultes NOG. Ici, nous expliquons toutes les étapes pratiques de l'isolement des cellules CD34 de Sang de cordon ombilical dérivées de CD34 Et de leur transplantation intraveineuse subséquente chez les souris, à la manipulation du modèle par l'infection par le VIH, thérapie antirétrovirale combinée ( cART), et l'échantillonnage de sang. Environ 75 000 cellules hCD34 sont injectées par voie intraveineuse chez les souris et le niveau de chimérisme humain, également connu sous le nom d'humanisation, dans le sang périphérique est estimé longitudinalement pendant des mois par cytométrie de flux. Au total, 75 000 cellules hCD34MD génèrent des cellules CD45 MD humaines de 20 % à 50 % dans le sang périphérique. Les souris sont sensibles à l'infection intravaginale par le VIH et le sang peut être échantillonné une fois par semaine pour l'analyse, et deux fois par mois pendant de longues périodes. Ce protocole décrit un analyse pour la quantification de la charge virale plasmatique à l'aide de gouttelettes PCR numérique (ddPCR). Nous montrons comment les souris peuvent être traitées efficacement avec un régime standard de soins de cART dans l'alimentation. La livraison de cART sous la forme de chow souris régulière est un raffinement significatif du modèle expérimental. Ce modèle peut être utilisé pour l'analyse préclinique des composés de prophylaxie pré-exposition systémiques et topiques ainsi que pour le dépistage de nouveaux traitements et stratégies de guérison du VIH.

La stratégie de gating pour l'analyse de la pureté des cellules souches est représentée dans la figure 1. La figure 1A-C montre la population purifiée de CD34MD et la figure 1D-F le flux CD34 utilisé pour illustrer que la quantité minimale de la population de CD34 Est perdue dans le processus d'isolement. La pureté des cellules souches isolées CD34MD se trouvait entre 85 % et 95 % avec moins de 1 % ...

Nous avons développé un protocole pour la génération et l'évaluation d'un modèle de souris NOG humanisé et infecté par le virus de l'immunodéficience humaine basé sur la greffe de cellules souches, l'exposition intravaginale au virus de l'immunodéficience humaine et l'ARN PCR numérique de gouttelettes Quantification.

Souris NOG humanisées pour l'exposition intravaginale au VIH et le traitement de l'infection par le VIH

Humanized mice provide a sophisticated platform to study human immunodeficiency virus (HIV) virology and to test antiviral drugs. This protocol describes ...

L’établissement de ce modèle humanisé de souris peut faciliter les études précliniques sur le VIH. Par exemple, les différentes souches virales et les nouvelles interventions contre le VIH peuvent être évaluées. Ces protocoles peuvent être utilisés pour évaluer le statut de variante du donneur de cellules souches CCR5 et pour infecter efficacement les souris humanisées avec le VIH et pour quantifier les charges virales plasmatiques de souris.Le protocole de quantification de l’ARN peut être facilement adapté pour quantifier n’importe quelle séquence virale d’ARN de choix qui est détectable dans les échantillons de plasma. Pour le dépistage génétique des échantillons de sang de cordon ombilical pour les variantes du delta CCR5 32, incuber 1,25 microlitres de flowthrough non granulé avec 11,25 microlitres de mélange PCR contenant 200 micromolaires dNTP mix, 0,01 unité par microlitre de polyméthère d’ADN haute fidélité, et amorces avant et inverse comme détaillé dans le tableau. Réglez le volume avec de l’eau sans nucléase à environ 12,5 microlitres pour chaque réaction PCR et amplifiez les fragments génomiques avec le programme de cycle PCR comme indiqué dans le tableau.À la fin de la réaction, séparez les produits PCR sur un gel agarose de 2 %. Les produits PCR des allèles de type sauvage et des allèles delta 32 produisent respectivement des fragments pcr de 196 paires de base et 164 paires de base, ce qui rend les bandes facilement reconnaissables par électrophorèse gel. Pour l’exposition intravaginale au VIH, placez une lampe chauffante centrée sur le centre de l’espace de travail où la souris sera située et placez des pointes stériles de pipette de 20 microlitres dans une pipette appropriée dans le capot.Placez un contenant contenant un désinfectant liquide dans le capot pour l’inactivation immédiate des matériaux et des liquides qui ont été en contact avec le virus. Placez la souris anesthésiée sur un tampon bleu stérile en position supinée sous la lampe avec la queue de la souris face à l’arrière du capot et confirmez l’absence de réponse au réflexe de pédale dans la souris. Saisir l’animal à la base de la queue.Soulevant doucement la souris par la base de la queue, soutenez l’animal en position verticale à l’envers. Utilisez une pointe stérile de tuyau pour stimuler la région génitale avec caresser doucement vers le haut vers l’anus pour induire la vidus du rectum et pour soulager la pression sur le vagin. Pour exposer l’ouverture vaginale, enveloppez soigneusement la queue de souris sur les doigts, de sorte que la vulve s’ouvre naturellement.À l’aide d’une nouvelle pointe de pipette, placez la pointe au niveau de l’ouverture vaginale et relâchez atraumatically 20 microlitres du virus dans le vagin, permettant à la gravité de tirer la suspension virale dans le vagin. Lorsque tout le virus a été livré, maintenez la souris dans cette position pendant cinq minutes pour éviter les fuites induites par la gravité du virus. Ensuite, retournez soigneusement la souris dans sa cage d’origine en position supine et surveillez jusqu’à ce qu’elle se rétablisse complètement.Pour isoler l’ARN des échantillons de plasma de souris décongelés, utilisez un kit d’isolation de l’ARN du virus selon les instructions du fabricant. Ajoutez l’échantillon qui se lie à la colonne et ajoutez une étape de traitement DNase sur la colonne pour assurer l’élimination de tout l’ADN dans l’échantillon plasmatique. Ensuite, conservez les échantillons d’ARN à 80 degrés Celsius pendant au moins une heure.Pour synthétiser l’ADNC, utilisez la transcriptase inverse selon les protocoles standard, y compris 0,5 microlitres d’un inhibiteur de la RNase dans la réaction de l’ADNC pour éviter la dégradation de l’ARN, puis effectuez la synthèse de l’ADNC telle que détaillée dans le tableau et stockez les échantillons d’ADNC à 80 degrés Celsius pendant au moins une heure. Pour préparer des échantillons de ddPCR, mélangez 11 microlitres de mélange de réaction de sonde ddPCR contenant de la polymése et des dNTP avec 250 nanomolaires de sonde de liaison de rainure mineure et 900 nanomolaires de chacune des amorces avant et arrière, comme indiqué dans le tableau. Ajouter trois microlitres de chaque échantillon d’ADNC et ajuster les volumes totaux de PCR à 22 microlitres avec de l’eau sans nucléase.Utilisez de l’huile de production de gouttelettes pour les sondes sur un générateur de gouttelettes selon le protocole du fabricant pour émulsionner les mélanges PCR. Exécutez ensuite le programme PCR tel qu’il est décrit dans le tableau. Pour le traitement de la multithérapie après une infection confirmée par le VIH, nourrissez les souris avec des granulés préparés par un fournisseur externe contenant un régime standard de la multithérapie, comme indiqué dans le tableau.Utilisez un régime cART de couleur rouge pour le distinguer facilement du chow de souris ordinaire et utiliser un régime chow de contrôle sans cART dans une couleur brune standard. Pour l’initiation du traitement, placez le régime chow contenant du cART dans des cages stériles avant de transférer les souris de l’ancienne cage à la nouvelle cage. Surveillez ensuite le poids des souris et vérifiez quotidiennement la consommation de chow contenant du cART pour vous assurer que les souris s’adaptent au changement.Ici, la stratégie de gating de cytométrie de flux pour l’analyse de la pureté de cellules souches est dépeinte, avec la pureté des cellules souches positives isolées de CD34 s’étendant typiquement entre 85 à 95%avec une contamination de cellules T inférieures à 1%. L’analyse pcr démontre le statut de variante CCR5 des cellules souches donneurs purifiées, rendant les donneurs de CCR5 delta 32 hétérozygotes facilement identifiables. La fréquence du génotype mutant dans un groupe de 19 donneurs était d’environ 15,8 %, en accord avec des études épidémiologiques plus importantes sur les populations scandinaves.Trois à cinq mois après le transfert adoptif de 7,5 fois 10 à la 4ème cellule positive humaine CD45 chez les souris receveurs, 20 à 50% des globules blancs récupérés dans les échantillons de sang périphériques animaux receveurs sont des cellules humaines CD45 positives et les souris auront développé des cellules humaines B et T. 64 % des souris sont infectées par le VIH à la suite d’une exposition vaginale, comme on l’a démontré. Quatre semaines après le passage à un régime alimentaire de 40 jours contenant la multithérapie standard, les charges virales chez les souris séropositives diminuent en dessous de la limite de détection.Après l’arrêt de l’alimentation, le virus rebondit, reflétant des données cliniques. Fait important, les souris sur cART tolèrent bien le changement de régime alimentaire. Il est crucial de se rappeler que ces animaux sont immunodéficients et donc vulnérables à l’environnement.L’adhésion aux techniques aseptiques augmentera le succès global de la santé animale et du protocole. Après l’établissement de la cohorte humanisée de souris pour l’infection par le VIH, le protocole peut être adapté pour la quantification virale de l’ARN dans les tissus ou pour tester de nouvelles interventions dans différentes souches virales. La flexibilité et l’accessibilité des souris humanisées pour les études sur l’infection par le VIH ont permis des progrès critiques dans la virologie, l’immunologie et la recherche sur le traitement du VIH.Avant d’essayer des protocoles concernant le VIH infectieux, assurez-vous d’obtenir l’approbation des responsables locaux de l’environnement de travail et de respecter les procédures de décontamination approuvées.

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Découvrez comment établir un modèle de souris NOG humanisées pour la recherche préclinique sur le VIH. Ce protocole permet d'évaluer différentes souches virales et interventions thérapeutiques.

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