Name: Quantification de la résistance aux antibiotiques médiées par Plasmid dans une approche expérimentale dévolution (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Apprenez à quantifier la résistance aux antibiotiques médiée par plasmide chez E. coli via une approche d'évolution expérimentale. Cette méthode permet de suivre la dynamique des plasmides et leur stabilité.

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Nous remercions Gor Margaryan pour son soutien créatif et son assistance technique. Ce travail a été appuyé par la Subvention pour les jeunes scientifiques de la ZMB 2017/2018 (attribuée à TW) et le programme d'orientation DFG 1819 (Grant No. DA1202/2-1 attribué à La TD).

1. Construction d'un plasmide modèle porteur d'un gène de résistance aux antibiotiques
REMARQUE : La souche Escherichia coli K-12 MG1655 a été utilisée comme organisme modèle dans toutes les expériences (DSM No. 18039, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, DSMZ). La souche E. coli DH5MD17 a été utilisée pendant la construction du plasmide.
<ol><li>PCR amplifie l'épine dorsale plasmique de votre choix et amplifie le gène de résistance, y compris la région promoteur par PCR (Figure 1).<ol>
<li>PCR amplifie l'épine dorsale plasmique à l'aide d'une polymérase haute fidélité et des oligonucléotides pBBR1_for (5'-GCGGCCACCCTGGCT-3') et pBBR1_rev (5'-TACCGGCGCGGCAGCGTCGTCCC-3') sur le modèle plasmien pLC (GenBank acc. no. MH238456)18.</li>
		<li>PCR amplifie le gène de résistance nptII, y compris le promoteur natif Tn5 19 en utilisant une polymérase haute fidélité et des oligonucleotides nptII_gib_for (5'-GCGCCGGTAGATCTGCTCATCATCATTTGAAGCTTCACGCCGC-3') et nptII_gib_rev (5'-CGGTGGCCAAAAAGAGAGCGTCA Le gène nptII code pour une néomycine phosphotransferase et confère une résistance à la kanamycine. REMARQUE: Concevoir les amorces pour le gène de résistance avec environ 20 bp de séquence complémentaire à l'épine dorsale plasmide qu'il sera fusionné à.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nettoyez les deux fragments de PCR à l'aide d'un kit de votre choix.</li>
	<li>Joignez-vous au produit pcR purifié du gène de résistance aux antibiotiques (y compris sa région de promoteur) à l'épine dorsale plasmique purifiée et fusionnez les régions homologues à l'aide de l'assemblage isotherme20, à 50 oC pendant 60 min.</li>
	<li>Électroporatez le produit fusionné dans la souche E. coli DH5MD.<ol>
<li>Introduire 2 ll du produit de l'étape 1,3 à 40 'L de cellules électrocompétentes dans des cuvettes de 2 mm à 4 oC et 2,5 kV. Resuspendre les cellules dans 1 ml de bouillon de lysogénie (LB) moyen.</li>
		<li>Transférer le volume total dans un tube de microfuge et couver 1 h à 37 oC en secouant à 250 tr/min dans un shaker orbital pour permettre l'expression du marqueur de résistance sur le plasmide.</li>
		<li>Plaque 100 l des cellules sur les plaques d'agar LB contenant l'antibiotique approprié (kanamycine 25 g/mL) pour sélectionner pour le gène de résistance aux antibiotiques et donc sélectionner pour les cellules porteuses de plasmide. Faites tourner le reste, retirez le supernatant, suspendez les cellules en LB de 100 l et plaquez sur une plaque d'agar sélective. Incuber les plaques à 37 oC pendant 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Afin de vérifier les clones, extraire les plasmides construits via la lyse alcaline à l'aide d'un kit commercial de mini-préparation.<ol>
<li>Récoltez 5 ml de la culture stationnaire de nuit en centrifugeant à 12 000 x g à température ambiante. Resuspendre les cellules dans la solution de résuspension, puis lyser et neutraliser la solution cellulaire. Centrifugeuse de 5 min à 12 000 x g.</li>
		<li>Transférer le supernatant dans la colonne de liaison d'ADN fournie dans le kit et laver la colonne deux fois avec une solution de lavage de 500 ll en centrifuge antincifuge 2x avant d'effacer la membrane de la colonne avec un tampon d'élution.</li>
		<li>Effectuer le séquençage du plasmide pour confirmer que la séquence est correcte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Une fois que la validité du plasmide est vérifiée, électroporatez le plasmide (maintenant pCON) dans la souche E. coli MG1655 comme décrit ci-dessus. Cela donne la souche E. coli MG1655 pCON.</li>
</ol>2. Surveillance des bactéries porteuses de plasmides dans diverses conditions au fil du temps
REMARQUE : L'expérience d'évolution est menée avec des souches porteuses de plasmides dans des conditions non sélectives (médias LB) à deux températures (37 oC et 20 oC) et trois tailles de goulots d'étranglement de la population. La conception expérimentale est utilisée pour étudier la persistance du plasmide dans diverses conditions.
<ol><li>Conception d'une expérience d'évolution pour suivre la fréquence plasmide au fil du temps (Figure 2)<ol>
<li>Déposer la souche de plasmide construite(E. coli MG1655 pCON) sur des plaques d'agar LB complétées par des antibiotiques (kanamycine 25 g/mL) et couver pendant la nuit à 37 oC.</li>
		<li>Préparer 96 plaques de puits profonds avec 1 ml de milieu LB dans chaque puits. En tant qu'ancêtres bactériens, choisissez huit colonies isolées aléatoires de la plaque d'agar dans des puits indépendants. Incuber les assiettes à 37 oC et 450 tr/min sur un shaker pendant 24 h. Préparer un stock de glycérol congelé des clones ancestraux.</li>
		<li>Le lendemain, transférer les huit populations de réplique dans de nouvelles plaques de puits profonds selon la conception expérimentale (Figure 2). Les cultures sont diluées 1:100 (grand goulot d'étranglement, L), 1:1,000 (goulot d'étranglement moyen, M), ou 1:10,000 (petit goulot d'étranglement, S) dans un volume total de 1 mL LB en utilisant PBS pour la dilution. Les cultures diluées sont à la fois incubées à 37 oC et 20 oC. REMARQUE : Il est très important de contrôler la contamination croisée dans la plaque de puits de 96 profondeurs. Ainsi, utilisez une conception de plaque de damier en intercalant les puits inoculés avec le milieu LB sans bactéries. Utilisez ce modèle tout au long de l'expérience d'évolution.</li>
		<li>Les cultures incubées à 37 oC sont transférées toutes les 12 h tandis que les cultures à 20 oC sont transférées toutes les 24 h. REMARQUE : Lors de chaque événement de transfert, le traitement de la taille du goulot d'étranglement est appliqué et le transfert en série est répété sur un total de 98 transferts. Le nombre de transferts dépendra de la conception expérimentale des lecteurs.</li>
		<li>Préparer un stock de glycérol congelé de toutes les populations régulièrement, 2x par semaine.</li>
	</ol></li>
	<li>Surveillance de la fréquence plasmique par le placage de réplique (Figure 3) REMARQUE : Au cours de l'expérience d'évolution, la fréquence des cellules porteuses de plasmides dans la population est estimée à partir de la proportion d'hôtes. Le protocole de placage de réplique est indiqué dans la figure 3.<ol>
<li>Pour déterminer la fréquence plasmide dans la population au cours de l'expérience d'évolution, les cultures stationnaires sont diluées en série et plaquées sur des plaques d'agar LB non sélectives. Ajuster la dilution en fonction d'un rendement de 250-500 colonies par assiette. REMARQUE : Préparer d'épaisses plaques d'agar LB avant le placage (agar de 30 ml).</li>
		<li>Les populations plaquées sont incubées pour la croissance du jour au lendemain en fonction de leur température de croissance dans l'expérience. REMARQUE : Les colonies doivent être petites, donc incuber lt;24 h à 37 oC.</li>
		<li>Après la croissance du jour au lendemain, compter toutes les colonies à l'aide d'une station de comptage manuelou automatisée des colonies et calculer la taille totale de la population bactérienne dans les cultures. REMARQUE : Les colonies au bord de la plaque d'agar ne doivent pas être incluses dans le nombre total de cellules bactériennes.</li>
		<li>Stériliser les pièces carrées (20 x 20 cm) de velours de coton en autoclave. REMARQUE : Le tissu de velours doit être 100% coton pour être autoclavable. Il est important de sécher le tissu après la stérilisation.</li>
		<li>Après la stérilisation du tissu de velours, placez le tissu sur un bloc rond et fixez-le avec un anneau en métal. Il est crucial d'éviter les rides. Placez soigneusement l'assiette avec les colonies cultivées (agar face vers le bas) sur la surface fixe de tissu de velours. Assurez-vous que toutes les colonies touchent la surface de velours en tapant soigneusement sur le plat Petri d'une manière circulaire.</li>
		<li>Retirez soigneusement la plaque d'agar LB et placez une plaque sélective complétée d'antibiotiques (kanamycine 25 g/mL) sur le tissu de velours. Assurez-vous que l'assiette touche tout le velours en tapant soigneusement sur le plat Petri tel que décrit précédemment. Ensuite, retirez la plaque. Laisser les assiettes à température ambiante pour la croissance de la nuit.</li>
		<li>Le lendemain, évaluez à la fois la plaque d'agar LB et la plaque sélective. Les colonies qui poussent sur les milieux sélectifs sont comptées comme hôtes plasmides (c.-à-d. résistantes aux antibiotiques), tandis que les endroits exempts de colonies sont des colonies qui étaient exemptes de plasmides et qui ne sont donc pas résistantes à l'antibiotique (c.-à-d. perdues le plasmide). Cela se fait en plaçant les plaques les unes sur les autres et en comparant la croissance (c.-à-d. marquer les colonies manquantes) et en comptant le nombre de colonies sur les deux plaques. Cela donne le nombre de cellules qui ont perdu le plasmide au cours de l'expérience d'évolution.</li>
		<li>Répétez cette procédure le long de l'expérience d'évolution de manière régulière (par exemple, tous les 14 transferts).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Visualisation des multimères plasmides à l'aide de l'électrophoresis de gel
REMARQUE : L'extraction de plasmide des plasmides à faible copie mène souvent à la contamination avec l'ADN chromosomique d'hôte qui doit être enzymatiquement digéré avant la visualisation.
<ol><li>Extraire l'ADN plasmide d'une culture fixe de cellules stationnaires de 5 ml utilisant la lyse alcaline comme décrit dans l'étape 1.5.</li>
	<li>Ensuite, traiter l'ADN plasmide extrait avec un DNase dépendant de l'ATP qui ne coupe que l'ADN chromosomique pour éliminer la contamination par l'ADN chromosomique (voir Tableau des matériaux). Incuber à 37 oC pendant 30 min. Ensuite, nettoyez l'ADN à l'aide d'un kit de votre choix.</li>
	<li>Pour créer des molécules à cercle ouvert de toutes les conformations de plasmides (monomères ou multimères), incubez les échantillons d'ADN plasmide avec une enzyme de nicking (Nb.BsrDI) et incubez pendant 30 min à 65 oC.</li>
	<li>En parallèle, pour créer des molécules linéaires de plasmide (c.-à-d., pour la comparaison de taille de plasmique), utilisez une enzyme de restriction de votre choix (par exemple, HindIII) qui fend le plasmide une fois. REMARQUE : Ceci a comme conséquence les monomères linéaires de plasmide d'ADN. Les molécules à cercle ouvert ne migrent pas de manière linéaire.</li>
	<li>Pour visualiser la taille et la conformation du plasmide, électrophorisez les échantillons d'ADN plasmique sifcé et linéaire pendant 120 min à 4,3 V/cm dans un gel agarose de 1 % (w/v) et un tampon TAE de 1 po. Les échantillons sont tachés de vert Midori et le gel est visualisé sur un système d'imagerie gel (voir Tableau des matériaux). Utilisez une échelle de 1 kbp.</li>
</ol>

<ol><li>San Millan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+plasmid-mediated+antibiotic+resistance+in+the+clinical+context%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evolution of plasmid-mediated antibiotic resistance in the clinical context.</a> Trends in Microbiology. 26 (12), 978-985 (2018).</li>
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<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li>
<li>Ilhan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregational+drift+and+the+interplay+between+plasmid+copy+number+and+evolvability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Segregational drift and the interplay between plasmid copy number and evolvability.</a> Molecular Biology and Evolution. 36 (3), 472-486 (2019).</li>
<li>Beck, E., Ludwig, G., Auerswald, E. A., Reiss, B., Schaller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+and+exact+localization+of+the+neomycin+phosphotransferase+gene+from+transposon+Tn5%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence and exact localization of the neomycin phosphotransferase gene from transposon Tn5.</a> Gene. 19 (3), 327-336 (1982).</li>
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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Dans ce protocole, nous présentons une approche qui combine des techniques en biologie moléculaire, l'évolution expérimentale, et la visualisation d'ADN pour étudier le rôle de l'évolution plasmide pour la persistance de la résistance aux antibiotiques dans les bactéries. Bien que l'approche présentée combine des méthodes provenant de différents domaines de recherche, toutes les techniques appliquées sont simples et peuvent être exécutées dans un laboratoire de microbiologie standard.
Les étapes les plus critiques du protocole comprennent la construction de la souche du système modèle qui comprend la validation génétique du génotype porteur du plasmide. Notamment, de nombreux plasmides codent naturellement les gènes de résistance aux antibiotiques. Ainsi, le lecteur peut omettre l'étape 1 du protocole et procéder directement à l'étape 2. Ensuite, les expériences d'évolution devraient inclure une conception aléatoire des populations de reproduisent afin que les résultats ne soient pas biaisés par la position des populations de reproduisent dans la plaque en profondeur. En outre, il est particulièrement important de mener soigneusement les étapes de transfert en série et de dilution dans l'expérience d'évolution car la contamination falsifierait les résultats. Enfin, le placage de réplique doit être effectué avec beaucoup de soin. La grande taille des colonies peut être un problème, mais elle peut être évitée en couvant les plaques pendant moins de 24 h. De même, le nombre de colonies sur une plaque peut biaiser les résultats de placage de réplique. Par conséquent, les populations doivent être diluées avant le placage et la réplication.
L'un des plus grands avantages de notre approche est que peut être facilement reproduit sans avoir besoin d'équipement lourd. En outre, un autre avantage du placage de réplique pour suivre des gènes de marqueur est que seulement les cellules vivantes sont évaluées, contrairement à la cytométrie de flux ou qPCR dans lequel les cellules mortes peuvent être évaluées comme vivantes. Ainsi, le placage de réplique introduit moins de biais au comptage des cellules porteuses de plasmide. Néanmoins, une limitation du placage de réplique peut être la taille de la population (c.-à-d., numéro de cellule) qui est possible d'évaluer dans une course expérimentale.
En utilisant notre approche, nous avons récemment montré que l'évolution de la stabilité plasmide potentialise la persistance des gènes de résistance aux antibiotiques dans les bactéries. Ainsi, nous avons développé une approche comme un outil pour suivre la persistance de résistance plasmide-négociée qui est d'une grande importance de suivre la résistance au fil du temps en particulier dans des conditions sans la présence d'antibiotiques.

Les plasmides sont des éléments génétiques circulaires qui se reproduisent eux-mêmes et qui sont omniprésents dans les procaryotes. Ils sont des agents de transfert latéral de gènes, car ils peuvent transférer des traits entre les populations microbiennes, et sont donc considérés comme jouer un rôle majeur dans l'évolution microbienne. Les plasmides sont des moteurs d'une adaptation rapide aux conditions de limitation de la croissance sur une courte période (p. ex., en présence d'antibiotiques ou de pesticides1) et sont responsables de la transition à long terme vers d'autres modes de vie (p. ex., émergence de la pathogénicité2). Les exemples les plus frappants de l'impact des plasmides sur le transfert de gènes sont documentés dans les écosystèmes exposés à des niveaux fluctuants d'antibiotiques, tels que les cliniques médicales ou dans les fermes industrielles3. En raison d'une forte sélection positive, de nombreux plasmides codent pour les gènes de résistance aux antimicrobiens et se trouvent souvent conférer une multirésistance à leur hôte bactérien. Les plasmides permettent la migration entre les populations ou les espèces bactériennes, ce qui entraîne une propagation rapide de la résistance aux antimicrobiens multiples. Dans des conditions non sélectives, les plasmides ne sont pas essentiels à la cellule et sont souvent même appelés éléments parasites. Néanmoins, les plasmides sont omniprésents dans la nature et leur évolution est très étroitement liée à celle des chromosomes bactériens. La persistance du plasmide dans les milieux naturels (fluctuants et non sélectifs) reste mal comprise, mais elle est d'une grande importance pour notre compréhension de la persistance des gènes de résistance aux antibiotiques dans la nature.
L'évolution expérimentale est un outil puissant pour l'étude des populations microbiennes4. L'évolution expérimentale a démontré que l'imposition d'une forte sélection pour l'entretien plasmide conduit à une évolution compensatoire (c.-à-d. adaptative) du plasmide ou du chromosome hôte qui réduit le coût de remise en forme plasmide et, à son tour, facilite l'abondance plasmide (c.-à-d., persistance plasmique)5,6,7. Ainsi, suivre l'interaction plasmi-hôte au fil du temps peut révéler d'importants mécanismes d'adaptation des deux éléments. En outre, l'évolution expérimentale permet de quantifier l'abondance des cellules porteuses de plasmides au fil du temps dans diverses conditions8,9,10.
La persistance du plasmide dans les expériences d'évolution peut être surveillée par plusieurs stratégies, y compris la cytométrie du débit par le tri des cellules activées fluorescentes (FACS)11, PCR quantitatif (qPCR)11, ou dans des méthodes basées sur la culture. La cytométrie de flux nécessite une machine FACS et l'introduction d'un gène marqueur détectable (fluorescent), comme la protéine fluorescente verte (GFP), sur le plasmide. Cependant, l'expression de GFP peut modifier plusieurs propriétés cellulaires et en outre influencer l'emplacement plasmide dans la cellule12,qui à son tour peut influencer l'héritage plasmide pendant la division cellulaire. Une approche qPCR pour mesurer l'abondance de plasmides peut être fortement biaisée par le nombre de copie de plasmide, qui peut varier considérablement le long de la phase de croissance bactérienne et au fil du temps13. Enfin, une approche fondée sur la culture et le placage nécessite l'introduction d'un gène marqueur sélectionnable. Il peut s'agit d'un gène de résistance aux antibiotiques, qui est souvent encodé sur des plasmides naturels; ainsi, aucune manipulation génétique n'est nécessaire. La résistance aux antibiotiques peut être suivie d'une approche traditionnelle de placage de réplique. Ainsi, pour étudier la dynamique naturelle du plasmide, le placage de réplique est bien adapté pour surveiller la résisitance antibiotique plasmide-encodé14.
Pour visualiser les molécules de plasmide (p. ex., pour évaluer la taille du plasmide), plusieurs méthodes peuvent être appliquées. Les plasmides entiers peuvent être amplifiés à l'aide d'une approche basée sur le PCR. Cependant, cela nécessite la conception d'amorces spécifiques, ce qui peut être difficile au cours d'une expérience d'évolution, parce que la séquence de plasmide peut changer au fil du temps. En outre, il est difficile d'amplifier les multimères plasmides dans une approche basée sur pcR en raison de plusieurs sites de liaison pour les amorces PCR. Les molécules de plasmide multimérique peuvent apparaître après la terminaison de la réplication du plasmide ou par la recombinaison de molécules plasmides et sont principalement orientées tête à queue15. Une autre approche de la visualisation plasmide combine la digestion enzymatique des molécules plasmides par des endonuclases d'ADN qui cleave ou entailler un brin d'ADN plasmide avec l'analyse d'électrophoresis de gel d'agarose. Le même plasmide de différentes tailles (p. ex., monomères vs multimères) donne lieu à différentes mobilités de gel qui peuvent être observées lors de la visualisation des molécules de plasmide. Cette approche permet la visualisation et la quantification de différentes conformations plasmides (c.-à-d. des états de multimerisation). La conformation de plasmique peut être utilisée comme indicateur de stabilité plasmide, car les multimères plasmides sont fréquemment perdus pendant la division cellulaire16.
Dans un travail récent, nous avons suivi la persistance plasmide dans des conditions qui n'étaient pas sélectives pour l'abondance de plasmide (c.-à-d., sans sélection d'antibiotiques). Nous avons comparé la persistance du plasmide à deux températures différentes (20 et 37 oC) et à trois tailles de population (c.-à-d. taux de dilution). L'application de divers taux de dilution, ou goulots d'étranglement de la population, permet d'enquêter sur l'influence de la taille de la population sur l'évolution bactérienne et plasmide. Sur la base de nos résultats, nous proposons que les plasmides peuvent être neutres pour leur hôte bactérien et peuvent évoluer la stabilité sans aucune pression de sélection8. La stabilité plasmide évoluée est conférée par la réduction de la formation de multimères plasmides8.
Ici, nous présentons un protocole pour la quantification de la persistance plasmide et l'étude de l'évolution plasmide en ce qui concerne le maintien des gènes de résistance aux antibiotiques. La méthode comporte plusieurs étapes, y compris l'insertion d'un gène de résistance aux antibiotiques à un plasmide modèle (qui peut être omis lors de l'utilisation d'un plasmide de résistance naturelle), suivie de l'utilisation de l'évolution expérimentale pour évaluer le potentiel du plasmide à persister dans des conditions non sélectives tout en déterminant la dynamique de fréquence plasmide au fil du temps à l'aide du placissement de la réplique, et l'analyse du génome plasmide par visualisation. Le protocole décrit ici a été conçu pour étudier l'évolution et la persistance des plasmides, mais il peut également être appliqué pour suivre l'évolution des gènes de résistance chromosomique (ou d'autres gènes marqueurs) au fil du temps.

<table><tbody><tr><td>96 plaques à puits profonds</td><td>Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 plaques à puits profonds</td><td>Roth</td><td>EN07.1</td><td>2 ml, carré</td></tr><tr><td>96 plaques à puits profonds (cryo)</td><td>Starlab</td><td>E1702-8400</td><td>Système de tubes de micro-dilution</td></tr><tr><td>Compteur de colonies</td><td>Stuart</td><td>SC6+</td><td></td></tr><tr><td>Magasin</td><td></td> de <td>draperie en velours de coton</td><td>100 % coton requis</td></tr><tr><td>Chambre d’électrophorèse</td><td>BioRad</td><td></td><td>Électrophorèse sur gel d’agarose</td></tr><tr><td>Alimentation par électrophorèse</td><td>BioRad</td><td>1645070</td><td>Électrophorèse sur gel d’agarose</td></tr><tr><td>Cuvettes d’électrophorèse</td><td>BioRad</td><td>1652089</td><td>0,1 cm</td></tr><tr><td>Électroporateur</td><td>BioRad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet Kit d’extraction de gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K0832</td><td>PCR nettoyage de fragments</td></tr><tr><td>GeneJet Plasmid Miniprep kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K0503</td><td>Kit d’extraction de plasmide</td></tr><tr><td>Gibson Assembly</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50125852</td><td></td></tr><tr><td>(agitateur à plaques)</td><td>Incubateur Heidolph</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>(agitateur)</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 44</td><td></td></tr><tr><td>Boucles d’inoculation</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes multicanaux</td><td>Eppendorf</td><td>3125000052, 3125000028</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes multicanaux</td><td>Capp</td><td>ME8-1250R</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND2000</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucléotides</td><td>Eurofines</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion Polymérase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F533S</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063,PlasmidSafe</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>enzyme Epicentre</td><td>10059400</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de réaction</td><td>Eppendorf</td><td>30125150</td><td></td></tr><tr><td>Replica bloc & anneau métallique</td><td>VWR</td><td>601-3401</td><td>Cylindre en PVC 69 mm ; anneau 102cm</td></tr><tr><td>Enzymes de resctriction</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>BioRad</td><td>T100</td><td></td></tr></tbody></table>

quantification de la résistance aux antibiotiques médiées par plasmid dans une approche expérimentale d'évolution

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Les plasmides jouent un rôle majeur dans l'écologie microbienne et l'évolution en tant que vecteurs de transfert latéral de gènes et réservoirs de fonctions génétiques accessoires dans les populations microbiennes. C'est particulièrement le cas dans des environnements en évolution rapide tels que l'exposition aux antibiotiques fluctuants. Nous avons récemment montré que les plasmides maintiennent des gènes de résistance aux antibiotiques dans Escherichia coli sans sélection positive pour la présence de plasmide. Ici nous décrivons un système expérimental qui permet de suivre le génotype plasmide et le phénotype dans les expériences à long terme d'évolution. Nous utilisons des techniques moléculaires pour concevoir un modèle de plasmide qui est ensuite introduit dans une approche expérimentale du système de lots d'évolution dans un hôte E. coli. Nous suivons la fréquence plasmique au fil du temps en appliquant le placage de réplique des populations d'E. coli tout en quantifiant la persistance de résistance aux antibiotiques. En outre, nous surveillons la conformation des plasmides dans les cellules hôtes en analysant l'étendue de la formation de multimères plasmides par le pseudoage plasmide et l'électrophorèse de gel d'agarose. Une telle approche nous permet de visualiser non seulement la taille du génome des plasmides en évolution, mais aussi leur conformation topologique - un facteur très important pour l'héritage plasmide. Notre système combine des stratégies moléculaires avec des approches de microbiologie traditionnelles et fournit une configuration pour suivre les plasmides dans les populations bactériennes sur une longue période. L'approche présentée peut être appliquée pour étudier un large éventail d'éléments génétiques mobiles à l'avenir.

Ici, nous présentons une approche pour étudier l'évolution plasmide en quantifiant la persistance plasmide dans une population. Tout d'abord, nous montrons comment construire le plasmide porteur de la souche E. coli MG1655 pCON qui est ensuite introduit dans une expérience d'évolution. Deuxièmement, nous présentons une méthode simple pour suivre l'abondance plasmide dans les populations bactériennes en évolution. Enfin, nous montrons comment visualiser la taille et la conformation des molécules de plasmide.
Dans nos travaux précédents8 utilisant l'approche présentée, nous avons mené une expérience d'évolution suite à la persistance de plasmides de résistance aux antibiotiques chez E. coli en l'absence d'antibiotiques (figure 4). Nos résultats représentatifs montrent l'évolution des populations à 37 oC et un taux de dilution de 10à 4. Après l'abondance des cellules porteuses de plasmide, nous avons observé une diminution de la fréquence des cellules hôtes porteuses de plasmides au fil du temps (figure 4). Notre approche nous a permis de découvrir que la perte de plasmide était le résultat de l'architecture du génome du plasmide condensé, qui a conduit à l'instabilité plasmide causée par les conflits introduits par la transcription du gène de résistance et la réplication du plasmide lui-même. La visualisation des molécules plasmides nous a permis de découvrir que ces conflits ont conduit à une conformation de plasmides instable (c.-à-d. formation de multimères plasmides, figure 5). Néanmoins, nous avons observé une évolution de la stabilité plasmide sans l'exposition aux antibiotiques (Figure 4). La stabilité évoluée a été conférée par une duplication intrinsèque plasmide qui a aboli les conflits de transcription-réplication et a mené à la formation des plasmides hérités de stably. Nos résultats démontrent ainsi l'importance de la recombinaison et de l'amplification du génome dans l'évolution adaptative des éléments génétiques.
<img alt="Schéma de construction du plasmide ; Amplification PCR, fusion isotherme, procédé de transformation d’E. coli." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : Conception Plasmid de pCON. Représentation schématique de la stratégie de clonage utilisée pour construire le plasmide plasmien pCON. L'épine dorsale plasmide (pBBR1) et le gène de résistance aux antibiotiques (nptII) sont amplifiés pcR et fusionnés par fusion isothermique20. Cela donne le plasmide pCON et la souche MG1655 pCON. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="test de persistance d’E. coli ; Schéma du transfert en série, du placage de réplique et de la variation de température." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 : Conception de l'expérience d'évolution à long terme. Représentation schématique de l'expérience de transfert en série. Les populations porteuses de plasmides (pCON) sont plaquées sur des milieuaux sélectifs. Les colonies ancestrales sont choisies au hasard dans la plaque et introduites dans un système de transfert en série. Les transferts sont effectués avec trois approches de dilution différentes pour simuler des goulots d'étranglement de population de différentes tailles. Les dilutions sont répétées en série. L'expérience est menée dans deux régimes de température. La fréquence plasmi-hôte est mesurée le long de l'expérience par le placage de réplique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Schéma de réplication de la colonie ; Transfert sur plaque LB-agar, test de sensibilité au Km25, méthode de microbiologie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 : Placage de réplique. Représentation schématique des étapes utilisées dans le placage de réplique des populations bactériennes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Graphique de l’évolution bactérienne ; proportion d’hôte par rapport au transfert ; effet antibiotique sur les plasmides pCON." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4 : Fréquence représentative de la pCON au fil du temps. La persistance de pCON est montrée comme proportion d'hôtes (populations de repli représentatives) pendant l'expérience d'évolution. Pour 98 transferts, les populations plasmides pCON ont évolué dans des conditions non sélectives avec un facteur de dilution de 10à 4. Toutes les répliques portant le plasmide pCON ont diminué dans la population. Par la suite, les populations ont été exposées à des antibiotiques pour l'incubation pendant la nuit et ont été cultivées à nouveau dans des conditions non sélectives pour tester l'évolution de la stabilité plasmide. Ce chiffre a été modifié à partir de Wein et coll.8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Électrophorèse sur gel d’ADN, analyse de restriction, linéarisation, résultats de digestion de DNase, bandes multimères." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figure 5 : Analyse représentative de la conformation du plasmide. Visualisation du modèle plasmid pCON. Visualisé est l'ADN plasmide non traité directement après l'extraction, l'ADN plasmide linéaire, et traité avec DNase qui coupe seulement l'ADN chromosomique ainsi que l'ADN enzymatiquement entaillé (c.-à-d., l'ADN plasmide de cercle ouvert). La linearisation du plasmide montre que tous les plasmides sont de la même taille. L'élimination de l'ADN chromosomique et le pseudo pCON révèle la présence de dimères et d'autres multimères. Ce chiffre a été modifié à partir de Wein et coll.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Notre approche expérimentale fournit une stratégie pour suivre l'abondance plasmide et la résistance aux antibiotiques au fil du temps dans les populations bactériennes.

Quantification de la résistance aux antibiotiques médiées par Plasmid dans une approche expérimentale d'évolution

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...

Les plasmides sont des éléments extrachromosomiques qui sont omniprésents dans la plupart des espèces bactériennes et des habitats où ils sont des agents très importants du transfert latéral de gènes car ils peuvent migrer entre les cellules et entre les populations. L’un des exemples les plus frappants et les plus marquants d’un tel transfert est la diffusion de gènes de résistance aux antibiotiques qui sont codés sur les plasmides. Pour construire un modèle de plasmide qui code un gène de résistance aux antibiotiques, choisissez une colonne vertébrale plasmide et PCR amplifier l’épine dorsale en utilisant une polymése haute fidélité et des amorces qui se lient sur le modèle plasmide. Dans notre cas, nous avons utilisé une colonne vertébrale plasmide pBBR1. Ensuite, amplifiez le gène de résistance nptII, y compris le promoteur natif Tn5 à l’aide d’une polymése haute fidélité. Concevoir les amorces pour le gène de résistance avec environ 20 paires de base de complémentarité de séquence à l’épine dorsale plasmide. Après les PCR, fusionner la région homologique du gène de résistance purifié PCR produit à l’épine dorsale plasmide purifiée en utilisant l’assemblage isothermal à 50 degrés pendant 60 minutes. Transformez le produit fondu en E.Coli DH5-Alpha à l’aide de l’électroporation. Plaque 100 microlitre du mélange sur les supports sélectifs et incuber à 37 degrés pendant environ 24 heures. Le plasmide peut ensuite être extrait, validé et transformé en souche de type sauvage MG1655. Ceci donne la souche MG1655 pCON.During exposition aux antibiotiques, les bactéries ont besoin du plasmide pour survivre. Ainsi, le plasmide fait l’objet d’une sélection positive. Dans des conditions non sélectives, donc sans antibiotiques, le plasmide est jetable à la cellule. Le but de notre étude était de suivre les plasmides dans de telles conditions non sélectives au fil du temps. À cette fin, nous avons équipé les petits plasmides d’un gène de résistance aux antibiotiques et l’avons introduit à Escherichia coli. Nous avons mené une expérience évolutive et surveillé la fréquence des plasmides par le placage de réplique. Le plasmide porteur de la souche mg1655 pCON est maintenant introduit dans une expérience d’évolution. Tout d’abord, plaque mg1655 pCON sur les plaques d’agar LB complétées par des antibiotiques et incuber toute la nuit à 37 degrés. De cette plaque choisir au hasard les 8 colonies d’ancêtre et d’incuber toute la nuit à 37 degrés avec des secousses constantes. Le lendemain, les populations sont transférées à l’expérience menée dans 96 plaques de puits profonds. Il est très important de distribuer aléatoirement les répliques sur toute la plaque. Par exemple, dans une approche damier. Dans notre expérience, les cultures sont diluées et transférées avec des taux de dilution différents et en deux températures. Lors de chaque événement de transfert, le traitement de dilution est appliqué et le transfert en série est répété sur un total de 98 transferts. Le long de l’expérience d’évolution, la fréquence des plasmides dans la population est estimée à partir de la proportion de cellules transporteuses de plasmides. Le placage réplique a été popularisé par Esther et Joshua Lederberg dans les années 1950 où ils l’ont utilisé afin d’étudier la résistance aux médicaments chez les bactéries. La méthode leur permettra de mettre à l’échelle leur balayage pour les phénotypes et à la fin de l’étude a révélé que la résistance à la pénicilline peut survenir chez les bactéries en raison de mutations spontanées dans le génome. Pour déterminer la fréquence des plasmides dans la population au cours de l’expérience, les cultures stationnaires sont diluées en série et plaquées sur des plaques d’agar LB non sélectives. Ajuster la dilution en fonction d’un rendement de 250 à 500 colonies par plaque. Les populations plaquées sont incubées pour une croissance nocturne à 37 degrés pendant moins de 24 heures. Les colonies sont mieux répliquées lorsqu’elles sont encore petites. Après la nuit, comptez toutes les colonies à l’aide d’un compteur de colonie automatisé du choix du lecteur. Cela donne la taille totale de la population de bactéries dans les cultures. Notez que les colonies au bord de la plaque doivent être laissées de côté. Pour reproduire les plaques, vous avez besoin de plaques d’agar sélectives complétées par des antibiotiques, un bloc rond, un anneau métallique qui s’adapte au bloc, et tissu de velours stérile. Le tissu doit être 100% coton car cela peut être stérilisé par autoclavation. Placez le tissu sur le bloc et fixez-le avec l’anneau en métal.Placez soigneusement la plaque avec les colonies comptées sur la surface fixe en tissu de velours. Appuyez sur la plaque dans les mouvements circulaires de sorte que toute la surface de la plaque touche le tissu. Il est très important que toutes les colonies touchent le velours. Retirer la plaque LB et placer la plaque sélective sur le velours. Répétez le tapage soigneur. Il est encore une fois important que la plaque touche complètement le velours. Ensuite, retirer la plaque sélective. Les plaques sont incubées à température ambiante pendant la nuit. Le lendemain, la LB et la plaque antibiotique sont nécessaires pour l’évaluation. Placez les plaques les unes au-dessus des autres et comparez la croissance. Vous pouvez facilement repérer les espaces exempts de colonies. Ce sont les colonies qui ne sont pas résistantes aux antibiotiques. Ainsi, ces colonies ont perdu le plasmide. En fin de compte, marquer le nombre de colonies manquantes sur la plaque antibiotique. Ce nombre vous donne la perte de plasmide. Répétez le placage réplique de toutes les populations au cours de l’expérience d’évolution chaque semaine. La perte de plasmide peut être provoquée par la malformation multiplasmide. Lorsque vous travaillez sur une construction plasmide dire pour l’expression d’un gène donné dans votre souche hôte préféré le comportement natif d’un plasmide in vivo en ce qui concerne la confirmation d’un état peut prendre est généralement quelque chose qui est négligé. Mais dans un contexte évolutif, une telle confirmation des changements pourrait être d’une très grande importance. L’analyse des confirmations plasmides peut être une entreprise très délicate. En particulier, les multimères plasmides sont difficiles à analyser parce qu’ils ne peuvent pas être identifiés correctement par PCR ou par séquençage. De l’autre côté, les multimères plasmides sont difficiles à analyser par électrophorèse gel en raison de leur taille potentiellement grande et leur mobilité électrophoretic lente. Notre protocole offre une méthode simple et simple pour le criblage et l’identification des multimères plasmides dans je dirais n’importe quelle préparation plasmide donnée. Pour les molécules plasmides visuelles extraire le plasmide de 5 mL stationnaire de la culture cellulaire pendant la nuit en utilisant la lyse alcaline. L’extraction plasmide de plasmides à faible copie entraîne souvent une contamination par l’ADN chromosomique de l’hôte qui doit être digéré avant la visualisation. Pour éliminer la contamination chromosomique de l’ADN traiter l’ADN plasmide extrait avec Plasmid-Safe

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