Utilisation d’embryons décongelés par le gel pour la production à haut rendement de souris génétiquement modifiées

Notre protocole facilite la préparation des souris génétiquement modifiées facilement, efficacement et rapidement à partir d’embryons de souris unicellules. Notre protocole combine l’utilisation d’embryons d’un stade unicelliongelés et l’électroporation permettant la génération rapide de souris génétiquement modifiées, y compris les souris mutantes à haut rendement et à faible taux de mosaïque. Pour la fécondation in vitro, commencez par super ovulating quatre ou huit semaines femelles C57BL/6J souris par injection intraperitoneal de 7.5 unités internationales de gonadotropin de sérum enceinte de jument suivie de l’injection intraperitoneal de 7.5 unités internationales de gonadotropine chorionique humaine 48 heures plus tard.

Ensuite, retirez l’épididyme cauda des souris C57BL/6J mâles sexuellement matures de trois à cinq mois et utilisez une aiguille disséquante pour extraire des caillots de spermatozoa. Puis incuber les caillots dans une chute de 200 microlitres de HTF à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 1,5 heures pour la capacitation. 16 à 18 heures après l’injection de gonadotropine chorionique humaine, recueillir les complexes d’ovocytes cumulus des oviductes et incuber les complexes avec 200 microlitres de HTF recouverts de paraffine liquide pour une incubation d’au plus deux heures dans l’incubateur de culture cellulaire.

À la fin de l’incubation, ajouter un à cinq microlitres de suspension de sperme de la limite du milieu d’incubation à la goutte de 200 microlitres des complexes d’ovocytes cumulus et placer la co-culture dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois heures. À la fin de l’incubation, laver les ovocytes avec le milieu d’optimisation simplex complété par le potassium trois fois pour enlever les spermatozoïdes et les cumulus restants et utiliser un microscope inversé pour vérifier la formation pronucléaire et la teneur des embryons d’une cellule. Pour une cryopréservation d’embryon de cellule, transférez les embryons dans une goutte fraîche de 200 microlitres de HTF complétée par le sérum bovin foetal de 20% pour une incubation de 10 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire.

À la fin de l’incubation, transférer de 20 à 100 embryons à 50 microlitres d’une solution molaire de sulfure de diméthyle et transférer jusqu’à 100 embryons dans cinq microlitres de solution au fond d’un cryotube. Refroidir les embryons pendant cinq minutes à zéro degré Celsius avant d’ajouter 45 microlitres de solution DAP213 sur le côté du tube. Après le plafonnement, garder les cellules pendant cinq minutes supplémentaires à zéro degré Celsius avant de stocker rapidement le tube dans de l’azote liquide.

Préparez un microgramme par microlitre d’ARN CRISPR et un microgramme par microlitre de tracrRNA dans un milieu essentiel minimal de sérum réduit. Ajouter six microlitres de chaque solution d’ARN à 42 microlitres de tampon sans nucléase et placer le mélange dans un chauffe-eau sec pendant trois minutes à 95 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, refroidir le mélange à température ambiante pendant cinq minutes et préparer un microgramme par microlitre de protéines HiFi Cas9 avec un sérum réduit minimal milieu essentiel.

Ajouter six microlitres de la solution HiFi Cas9 diluée à la solution ARN et transférer jusqu’à 100 embryons décongelés en 25 microlitres de la solution complexe de ribonucléoprotéines qui en résulte dans une seule glissière en verre entier. Puis incuber les embryons pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Pour l’électroporation embryonnaire, à la fin de l’incubation, définissez les paramètres de l’électroporateur et chargez la glissière sur l’électroporateur.

L’électroporation doit être effectuée dans l’heure qui suit la décongélation de l’embryon afin de s’assurer que l’édition du génome se produit avant la première réplication de l’ADN et de prévenir le mosaicisme. Après l’électroporation, laver les embryons trois fois avec le tampon de bicarbonate Krebs-Ringer modifié deux moyens en deux lavages avec une goutte de potassium complété simplex moyen d’optimisation recouvert de paraffine liquide. Puis incuber les embryons dans le potassium frais complété simplex milieu d’optimisation dans l’incubateur de culture cellulaire du jour au lendemain.

L’utilisation de cette méthode modifiée de cryopréservation pour les embryons unicellules améliore le taux de développement des embryons décongelés au stade des deux cellules. En utilisant cette méthode, toutes les souris générées dans cette expérience représentative étaient albinos avec une seule souris mosaïque portant un manteau avec des taches blanches et noires. Ici, une section représentative d’un chromatogramme d’une souris albinos contenant l’allèle M1 peut être observée.

Comme illustré, le protocole peut générer des souris knock-in et knock-in avec une efficacité élevée et de faibles taux de mosaïque. En effet, les descendants F1 de la progéniture homozygote F0 sont hétérozygotes contenant un mutant et un allèle de type sauvage sans mutations disparates. Rappelez-vous que l’ovule fécondé est fragile au stade d’une cellule.

L’ajout de sérum bovin fœtal renforce l’embryon. Toutefois, il doit être manipulé avec soin à chaque étape. Cette méthode peut contribuer à l’analyse de la fonction génique et de la recherche sur les maladies humaines en facilitant une production plus rapide et plus efficace de souris génétiquement modifiées.