Préparation des cellules synthétiques produisant des protéines à l’aide d’extraits bactériens exempts de cellules, de liposomes et de transfert d’émulsion
27 avril 2020
Ce protocole décrit la méthode, les matériaux, l’équipement et les étapes pour la préparation ascendante de l’ARN et des protéines produisant des cellules synthétiques. Le compartiment aqueux intérieur des cellules synthétiques contenait le lysate bactérien S30 encapsulé dans un bilayer lipidique (c.-à-d. liposomes stables), à l’aide d’une méthode de transfert d’émulsion d’émulsion de l’eau dans l’huile.
Les cellules synthétiques productrices de protéines offrent une plate-forme polyvalente pour étudier les origines de la vie ainsi que des thérapies synthétiques à base de cellules pour l’administration avancée de médicaments. Cette méthode est simple et abordable pour l’arn et l’expression des protéines et peut être appliquée pour la production thérapeutique sur place de protéines directement à l’intérieur du corps. Les systèmes peuvent être utilisés pour traiter un large éventail de maladies, des maladies métaboliques et des substituts protéiques au cancer et peut-être au diabète.
Ce protocole en plusieurs étapes a un point d’arrêt défini. Lors de l’exécution pour la première fois, il est recommandé de diviser l’œuvre sur plusieurs jours. Le protocole de production de cellules synthétiques commence par la préparation du lysate S30-T7 sans cellules.
Ensuite, les lipides membranaires et la solution nutritive cellulaire sont prêts à simuler l’environnement intérieur et à soutenir la production de protéines. La dernière étape est la préparation des cellules synthétiques elles-mêmes. Préparez des cultures de démarrage en double dans des flacons Erlenmeyer de 100 millilitres.
À chaque flacon, ajouter cinq millilitres de média LB complétés de 50 microgrammes par millilitre d’ampicilline et inoculer avec une seule colonie d’E.coli. Cultivez la culture du jour au lendemain dans un shaker d’incubateur de plancher à 250 rpm et 37 degrés Celsius. Ensuite, préparez deux flacons Erlenmeyer déconcertés de litres contenant 500 millilitres de liquide tuberculeux complétés par 50 microgrammes par millilitre d’ampicilline.
Inoculer chaque flacon de deux litres avec une culture de démarrage de cinq millilitres. Placer les flacons dans un shaker à 250 r/h et 37 degrés Celsius. Surveillez périodiquement les cultures à l’aide d’un spectrophotomètre et cultivez les cultures jusqu’à oD600 entre 0,8 et un.
Pour induire l’expression de polymésase d’ARN T7, ajoutez à chaque flacon trois millilitres de 100 millimolar IPTG pour atteindre 0.6 millimolar. Continuer à cultiver les cultures jusqu’à od600 est d’environ quatre. Une fois que les cultures atteignent la densité optique désirée, transférez la suspension de chaque flacon d’Erlenmeyer en deux tubes de centrifugeuse stérilisés de 250 millilitres.
Centrifuger les tubes à 7000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnatant. Resuspendez chaque granulé en 250 millilitres de tampon de lysate S30 froid à l’aide d’un agitateur si désiré.
Centrifugeuse à 7000 fois g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Jetez le supernatant et resuspendez toutes les granulés ensemble dans 15 millilitres de tampon de lysate S30 froid. Filtrer la suspension à l’aide de tampons de gaze.
Avant de passer à l’étape suivante, précooler les pointes en flacons de 1,5 millilitre qui seront nécessaires pour stocker le lysate. Homogénéiser la suspension deux fois. Utilisez une pression de travail de 15 000 PSI avec une pression d’air de quatre barres pour la rupture cellulaire.
Recueillir l’homogénéité. Ajouter 100 microlitres de 0,1 molaire DTT par 10 millilitres de la suspension homogénéisée. Centrifugeuse de la suspension à 24, 700 fois g à 30 minutes à quatre degrés Celsius.
La TNT et le chloroforme sont classés comme irritants et nocifs et doivent donc être traités avec soin. Le chloroforme utilisé plus tard dans le protocole doit être utilisé dans une zone d’extraction des fumées. Pour préserver l’activité lysate, effectuez l’étape rapidement.
Placer 200 aliquots de microlitres de supernatant dans des flacons pré-refroidis et les casser immédiatement les congeler avec de l’azote liquide. Conservez les flacons à 80 degrés Celsius négatifs pour une utilisation future. Dissoudre séparément le POPC et le cholestérol dans le chloroforme chacun à une concentration finale de 100 milligrammes par millilitre.
Vortex chaque flacon séparément. Dans un flacon de verre de deux millilitres, mélanger les composants. Ajouter 50 microlitres de la solution cholestérol-chloroforme, 50 microlitres de la solution POPC-chloroforme et 500 microlitres d’huile minérale.
Vortex le flacon, puis pour évaporer le chloroforme, le chauffer pendant environ une heure à 80 degrés Celsius dans une hotte chimique. Avant de commencer l’étape de production des cellules synthétiques, préparez les solutions extérieures, pré-intérieures et d’alimentation décrites dans le manuscrit. Placez ensuite 1,2 millilitres de la solution extérieure dans un tube de 15 millilitres et ajoutez lentement une couche de 500 microlitres de solution lipidiques dans l’huile à partir du premier flacon de verre.
Incuber le tube à température ambiante pendant 20 minutes. Pour finaliser la préparation de la solution interne, mélanger sur la glace à un volume final de 100 microlitres en ajoutant du lysate S30-T7 et du plasmide d’ADN. Ajouter 100 microlitres de la solution intérieure avec du lysate et du plasmide au deuxième flacon de verre de deux millilitres avec 500 microlitres de solution lipidiques dans l’huile.
Pipette de haut en bas vigoureusement pendant une minute, puis vortex pour une autre minute au niveau cinq. Après avoir incubé l’émulsion qui en résulte pendant 10 minutes sur de la glace concassée, ajouter lentement l’émulsion au-dessus de la phase d’huile dans le tube de 15 millilitres. Centrifuger le tube pendant 10 minutes à 100 fois g et quatre degrés Celsius.
Puis centrifugeuse pendant 10 minutes à 400 fois g et quatre degrés Celsius. À la fin de la centrifugation, une pastille doit être observable au fond du tube. Pour extraire la pastille, retirez d’abord l’excès de couche d’huile.
Ensuite, chargez une pointe de pipette parée avec environ 400 microlitres de solution extérieure et utilisez la pointe pipette pour recueillir la pastille, libérant la solution extérieure pendant que la pointe pipette traverse la phase d’huile. Essuyez la pointe pipette et transférez la pastille dans un tube propre de 1,5 millilitre. Centrifugeuse la pastille pendant 10 minutes à 1000 fois g et quatre degrés Celsius.
Retirez le supernatant et réutilisez la pastille dans 100 microlitres de solution d’alimentation. Pour l’expression des protéines, incuber la suspension pendant deux heures à 37 degrés Celsius sans trembler. Les plasmides exprimant le modèle de protéine sfGFP et Renilla luciferase ont été introduits dans la synthèse des protéines sans cellules, les réactions en vrac cfps, et les cellules synthétiques.
La production de protéines a été évaluée à l’aide de plusieurs méthodes. L’analyse occidentale de tache a détecté la production his6 de sfGFP dans les réactions en vrac de CFPS et à l’intérieur des cellules synthétiques. Purifié sfGFP His6 a été utilisé comme un contrôle positif.
Un microscope fluorescent avec un Brightfield et un filtre GFP montrent des cellules synthétiques qui produisent sfGFP. La cytométrie d’écoulement a été employée pour analyser sfGFP produisant des cellules synthétiques. Le calcul de la population active de cellules synthétiques était basé sur le seuil d’intensité de fluorescence sfGFP défini par l’échantillon négatif d’ADN représenté par l’histogramme rouge.
L’intensité moyenne de fluorescence des cellules synthétiques productrices de sfGFP a été calculée à partir de la population active de cellules synthétiques et normalisée à l’échantillon négatif d’ADN. Les distributions de diamètre des cellules synthétiques actives ont été calculées sur la base du signal sfGFP. L’activité de renilla luciferase a été quantifiée avec des mesures de luminescence.
Cette méthode est très polyvalente et peut être optimisée pour différentes protéines cibles en modifiant l’origine du lysate, la composition lipidique et les concentrations de solutions intérieures. L’analyse FACS des cellules synthétiques produisant une protéine marqueur fluorescent pourrait être effectuée pour fournir une valeur quantitative de la fraction des cellules synthétiques actives. L’analyse occidentale des taches mesurerait la production de protéines.
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Aperçu
Ce protocole décrit la préparation de cellules synthétiques produisant de l'ARN et des protéines en utilisant une méthode de transfert d'émulsion eau-dans-huile. Les cellules synthétiques encapsulent un lysat bactérien S30 au sein d'une bicouche lipidique, offrant ainsi une plateforme pour des applications thérapeutiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biotechnologie
- Biologie synthétique
- Systèmes dépourvus de cellules
Contexte
- Les cellules synthétiques peuvent imiter des fonctions biologiques.
- Elles sont utiles pour l'étude des origines de la vie.
- Ces cellules peuvent être utilisées pour la production thérapeutique de protéines sur site.
- Les applications incluent le traitement de diverses maladies.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode pour produire des cellules synthétiques.
- Faciliter l'expression d'ARN et de protéines.
- Explorer des applications thérapeutiques dans la délivrance de médicaments.
Méthodes utilisées
- Préparation d'un lysat S30-T7 sans cellules.
- Encapsulation du lysat dans des bicouches lipidiques.
- Utilisation de la méthode de transfert par émulsion eau-dans-huile.
- Protocole en plusieurs étapes avec des points d'arrêt définis.
Résultats principaux
- Encapsulation réussi du lysat S30 dans des cellules synthétiques.
- Potentiel démontré pour la production de protéines sur site.
- Plateforme polyvalente pour diverses applications thérapeutiques.
- Le protocole peut être réalisé sur plusieurs jours pour plus d'efficacité.
Conclusions
- Les cellules synthétiques représentent un outil prometteur pour la recherche et la thérapie.
- La méthode est simple et rentable.
- Applications potentielles dans le traitement des maladies métaboliques et du cancer.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
Ce protocole permet l'assemblage ascendant de cellules synthétiques destinées à une production contrôlée de protéines, offrant une plateforme polyvalente pour la validation de cibles et la réduction des risques mécanistiques en phase de découverte précoce. En encapsulant des systèmes d'expression dépourvus de cellules vivantes dans des vésicules lipidiques, il permet des résultats quantitatifs reproductibles pour le développement de tests et le criblage phénotypique. Cette approche facilite la continuité translationnelle depuis la découverte jusqu'aux étapes précliniques, en particulier pour la production de protéines thérapeutiques et les applications de délivrance de médicaments.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des mécanismes transcriptionnels et traductionnels dans un environnement isolé imitant la cellule.
- Valeur opérationnelle : Fournit un système défini pour la validation fonctionnelle de cibles grâce à une production protéique mesurable.
- Valeur prédictive : Facilite l'identification de candidats thérapeutiques en permettant un test rapide de constructions génétiques en fonction de leur efficacité d'expression protéique.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des mesures quantitatives de fluorescence et de luminescence pour le criblage à haut contenu de variants génétiques.
- Valeur opérationnelle : Permet la standardisation des dosages de production protéique grâce à un lysat encapsulé et une composition contrôlée de la solution interne.
- Extensibilité : Facilite la production de millions de cellules synthétiques pour l'évaluation reproductible de composés ou de constructions.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence translationnelle : Sert de plateforme contrôlée pour la production à la demande de protéines thérapeutiques, soutenant la preuve de concept préclinique.
- Dérisquage mécanistique : Permet l'étude de l'activité des protéines et ARN de façon isolée, réduisant l'ambiguïté dans l'interprétation des voies biologiques.
- Fiabilité prédictive : Permet d'évaluer le rendement d'expression et la stabilité avant l'intégration dans un système cellulaire.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase de découverte précoce en fournissant un système d'expression acellulaire qui fait le lien entre la conception génétique et la validation fonctionnelle, précédant les tests cellulaires et les modèles précliniques.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur des constructions génétiques par la mesure directe de la synthèse protéique dans un système minimal.
- Écrantage : Fournit des cellules synthétiques prêtes à l'essai produisant des signaux quantitatifs (fluorescence, luminescence) pour évaluer l'efficacité d'expression.
- Analyse : Autorise la normalisation des données de production protéique à l'aide de seuils d'intensité de sfGFP et de calculs de la population de cellules actives.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans les travaux précliniques en démontrant le potentiel de production de protéines thérapeutiques dans un format apte à la délivrance.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour la production de protéines ciblant diverses molécules grâce à l'interchangeabilité des lysats et des plasmides.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant la complexité cellulaire et en isolant les processus de transcription-translation.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité grâce à des étapes standardisées de préparation des lysats, d'encapsulation lipidique et de transfert d'émulsion.
- Valeur stratégique : Optimise l'efficacité du capital en permettant une itération rapide et peu coûteuse des constructions d'expression avant tout investissement dans des systèmes cellulaires.
- Impact sur le portefeuille : Favorise une priorisation ajustée au risque en fournissant dès les premières étapes des données quantitatives sur le rendement et la fonctionnalité des protéines.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture bactérienne, préparation de lysats sans cellules et manipulation de lipides.
- Dépend d'instruments tels qu'un spectrophotomètre, une centrifugeuse, un homogénéisateur et des détecteurs de fluorescence/luminescence.
- Implique une standardisation interéquipes de l'activité du lysat, de la composition lipidique et de la formulation de la solution interne.
- Implique des ajustements selon les différents constructions plasmidiques et protéines cibles, par modulation de l'origine et de la concentration du lysat.
- Comprend des limites pratiques telles que la manipulation à froid, l'extraction des vapeurs de chloroforme et des points d'arrêt définis pour une exécution sur plusieurs jours.
