Name: Découper et cultiver des cœurs de porc dans des conditions physiologiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Apprenez à découper et cultiver des tranches de cœur de porc pendant six jours dans des conditions physiologiques. Cette méthode permet d'évaluer l'efficacité des thérapies contre l'insuffisance cardiaque et de tester la toxicité cardiaque aiguë.

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TMAM est soutenu par la subvention des NIH P30GM127607 et la subvention de l’American Heart Association 16SDG29950012. RB est soutenu par P01HL78825 et UM1HL113530.

Toutes les procédures animales étaient conformes aux lignes directrices institutionnelles de l’Université de Louisville et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux.
1. Préparation pour le tranchage (Un jour avant le tranchage)
<ol><li>Préparation du microtome vibrant
	<ol>
<li>Placez la lame en céramique dans son support en suivant ces étapes : après avoir soigneusement déballé la lame, placez le bord tranchant en premier dans la fente de l’outil de lame. Ensuite, placez la lame dans le support en desserrant les deux vis sur les bras du support et faites glisser la lame sous chaque laveuse et poussez-la fermement contre les arrêts arrière. Serrez les vis pour fixer la lame. REMARQUE: Les vis ne doivent pas être trop étanches.</li>
		<li>Calibrer la lame à l’aide du protocole d’étalonnage et des outils selon le protocole du fabricant. REMARQUE: En bref, afin de faciliter l’alignement de la la lame avec l’axe de déplacement et de minimiser les déviations de l’axe Z, la microtome vibrante utilise un dispositif d’étalonnage démontable. Lorsque le dispositif d’étalonnage est branché à l’instrument, sa présence sera automatiquement détectée, et la microtome vibrante prendra le contrôle de l’ajustement des réglages d’amplitude et de fréquence de la lame à une magnitude qui permet le mieux l’ajustement de l’erreur d’alignement de la lame.<ol>
<li>Appuyez sur le bouton Slice pour démarrer le processus d’alignement qui déplacera automatiquement la lame de sorte que le tranchant soit en position optimale par rapport au dispositif d’étalonnage pour la meilleure évaluation de l’alignement. Suivez les instructions à l’écran pour apporter des ajustements à la lame à l’aide du tournevis fourni pour vous assurer que l’alignement Z se trouve à moins de 1 m.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Autoclavez le bain intérieur et toutes les parties métalliques de la microtome vibrante.</li>
	</ol></li>
	<li>Autoclavez les grands plateaux métalliques (pour la collecte des tranches et le trempage des couvercles de plaque de stimulation électrique), tous les récipients en verre, les lames régulières de rectangle, les forceps, les ciseaux, la courroie de chronométrage d’imprimante (les couper en morceaux de 6 mm de large), les rondelles en métal et 5 L d’eau distillée double (ddH2O).</li>
	<li>Stériliser un pot de 1 L, un pot de 500 ml et un plateau en plastique pour le cœur in situ et la perfusion in vitro avec la solution cardioplégique.</li>
	<li>Préparer 2 L de la solution de Lanière de Tranchage dans un bécher de 2 L.
	<ol>
<li>Pour 1 L de la solution de LaThyrode, mélanger 3 g/L 2,3-butanedione monoxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucose (10 mM D-glucose (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucose (10 mM D-glucose (10 mM D-glucose (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucose (10 mM D-glucose (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucose (10 mM D-glucose (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 mL de solution de 1 M), 1,8 mM CaCl2 (1,8 mL de solution M), jusqu’à 1 L de ddH2O. Ajuster le pH à 7,40 à l’aide de NaOH. Ensuite, filtrez la solution à l’aide d’un système de 1 000 ml, 0,22 m, de filtre/stockage sous vide et stockez à 4 oC pendant la nuit.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer 4 L de la solution cardioplégique.
	<ol>
<li>Pour 1 L de la solution cardioplégique, mix 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl2 (1,2 mL de solution 1 M), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl2 (3,25 g), 10 mM NaHCO3 (0,84 g), 1 U/mLparin, heparin jusqu’à 1 L de ddH2O. Ajuster le pH à 7,40 à l’aide de NaOH. Ensuite, filtrez la solution à l’aide d’un système de 1 000 ml, 0,22 m, de filtre/stockage sous vide et stockez à 4 oC pendant la nuit. REMARQUE: Ajouter 1 000 héparine U/L dans la solution cardioplegia le jour du tranchage (voir l’étape 2.1).</li>
	</ol></li>
	<li>Prépare fraîchement 500 ml de milieu de culture dans la bouteille d’origine dans une armoire de biosécurité : mélange moyen 199, supplément 1x insuline-transfertrin-sélénium (ITS), sérum bovin fœtal à 10 % (FBS), 5 ng/mL facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF), 10 ng/mL FGF-basic, et 2x anticomytique anticomytique. Filtrer stériliser à travers le 0,22 m, filtre à vide / système de stockage et stocker à 4 oC pendant la nuit. REMARQUE: Ne pas ajuster le pH, ajouter VEGF et FGF fraîchement avant utilisation.</li>
	<li>Préparer 4 % de plaques de gel d’agar.
	<ol>
<li>Ajouter 200 ml de ddH stérilisé2O dans un flacon stérilisé de 500 ml. Peser 8 g d’agarose et verser délicatement dans le flacon. Faire bouillir pendant 2 minutes au micro-ondes, puis laisser refroidir pendant 5 minutes à température ambiante.</li>
		<li>Verser 25 ml dans chaque plat Petri de 100 mm dans une armoire de biosécurité (préparer 6 plats) et attendre 1 h pour se solidifier. Ensuite, sceller les plaques avec du film de paraffine, envelopper avec une pellicule propre, et conserver à 4 oC.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer 4 L d’éthanol à 70 % en diluer l’éthanol absolu à 200 preuves dans le ddH2O autoclaved.</li>
	<li>Préparer 2x antibiotique-antimycotique en ddH stérilisé2O : mélanger 980 ml de ddH stérilisé2O avec 20 ml d’antimycotique antibiotique sous l’armoire de biosécurité.</li>
</ol>2. Perfusion de coeur de porc
<ol><li>Ajouter 1 ml d’héparine U/mL à chaque 1 L de solution cardioplégique. Gardez la solution sur la glace. REMARQUE: Au moins 3 L sont nécessaires pour la perfusion et la préservation du cœur pendant le transfert à la salle de culture tissulaire.</li>
	<li>Prenez les articles suivants à la salle de chirurgie porcine: un grand seau à glace plein de glace, un plateau métallique stérilisé (garder sur le seau à glace pour la perfusion cardiaque), un pot stérilisé de 500 ml, un pot de 1 L (pour transférer le cœur dans la solution cardioplégie de retour à la salle de culture des tissus , sur la glace), et un plateau en plastique stérilisé plein de glace (pour garder la solution cardioplégique sur la glace).</li>
	<li>Préparer un système in situ de perfusion cardiaque contenant un stopcock à 3 voies, une seringue de 60 ml, un cathéter d’aiguille papillon de 18 G et l’extension de la tuyauterie au réservoir de solution cardioplégique.</li>
	<li>Anesthésiez d’abord le porc mâle du Yorkshire (2 à 3 mois, 20 à 25 kg) d’abord avec une injection intramusculaire d’un cocktail de kétamine (20 mg/kg)/xylazine (2 mg/kg). Confirmer l’anesthésie appropriée par la perte de tension de mâchoire. Ensuite, transférer le porc à la salle de chirurgie, intubate et ventiler mécaniquement les poumons comme décrit précédemment14.</li>
	<li>Maintenir l’anesthésie avec (1,5 à 2 %) Isoflurane.</li>
	<li>Placez l’animal sur la position latérale droite et rasez la fourrure de la poitrine. Nettoyez la peau avec un gommage d’alcool, puis stérilisez le site chirurgical avec 10% (w/v) solution povidone-iode.</li>
	<li>Ouvrez la poitrine par l’incision gauche de thoracotomy utilisant un scalpel à l’espace intercostal de4ème, et employez un rétracteur de coffre entre les côtes pour tenir la poitrine ouverte et exposer le coeur. REMARQUE: Utilisez tous les instruments stérilisés pour cette procédure.</li>
	<li>Insérez le cathéter d’aiguille papillon dans l’oreillette gauche et fixez l’aiguille avec une fermeture de la corde de sac à main. Après l’injection intraveineuse d’une dose de bolus d’héparine (100 U/kg), commencez à perfuser le cœur in situ avec 500 ml de solution cardioplégique glacée (pour ralentir la fréquence cardiaque) par l’intermédiaire du cathéter auriculaire gauche.</li>
	<li>Anesthésiez profondément le porc avec 5% d’isoflurane. A accisez rapidement le cœur de la poitrine avec des ciseaux chirurgicaux. Cannulate l’aorte avec une canule aortique et perfuser le cœur in vitro avec un autre 1 L de solution cardioplégique glacée (100 mL/min) pour éliminer le sang vascularisé.</li>
	<li>Après la perfusion cardiaque, gardez le cœur dans un pot de 1 L rempli de solution de cardioplegie glacée et gardez sur la glace pendant le transfert à la salle de culture tissulaire.</li>
</ol>3. Tissu de coeur de porc tranchement
<ol><li>Installez le bain de tissu sur le vibratome, ajoutez de la glace à la veste de refroidissement de bain de tissu, puis ajoutez la solution de Tyrode dans le bain de tissu. Installez un bocal en plastique de 1 L pour recueillir l’élimination de la glace fondue dans la veste de refroidissement du bain de tissu.</li>
	<li>Sous l’armoire de biosécurité, transférer le cœur de porc sur un plateau contenant 1 L de solution cardioplégique froide fraîche.</li>
	<li>Disséquer le cœur pour isoler le ventricule gauche à l’aide de scalpels stériles rétractables. Ensuite, couper le ventricule gauche en blocs de 1 à 2 cm3 chacun à l’aide de lames de rectangle de rasoir. Utilisez une pièce pour trancher et garder les morceaux restants dans un tube de 50 ml dans la solution froide de Tyrode sur la glace pour couper plus tard, si nécessaire. REMARQUE: Masser le tissu avant de trancher avec les mains, surtout si c’est le deuxième bloc. Massaging aide à restaurer la configuration correcte des fibres musculaires et empêche toute raideur dans le bloc cardiaque.</li>
	<li>Ajouter 1 à 2 gouttes de colle tissulaire(tableau des matériaux)au porte-échantillons métalliques et coller un morceau du bloc d’agar de 4 % avec une surface d’environ 1 cm2.</li>
	<li>Ajouter 1 à 2 gouttes de colle de tissu sur l’agar.</li>
	<li>Collez le bloc cardiaque à l’agar avec le côté épicardique cardiaque face vers le bas sur la colle de tissu et assurez-vous qu’il est aussi plat que possible. Ensuite, transférer le support de tissu avec le bloc cardiaque à sa position dans le bain de tranchement du vibratome.</li>
	<li>Attachez le tube d’oxygène au bain de tranchage et le plateau métallique rempli de la solution de Tyrode pour la collecte des tranches (bain oxygéné de Tyrode). Ensuite, ajouter des passoires cellulaires de 40 m dans le plateau métallique pour recueillir les tranches après la coupe.</li>
	<li>Ajustement de la position de tranchement
	<ol>
<li>À l’aide du logiciel d’exploitation vibratome et du tableau de bord, ajustez la hauteur de la lame/échantillon. Sélectionnez le bouton de hauteur et suivez les instructions à l’écran pour ajuster la hauteur. Idéalement, ayez la lame près du dessus du tissu mais au-dessous des muscles papillaires et assurez-vous qu’il y a du liquide couvrant le tissu et la lame avant de trancher.</li>
		<li>Ajuster par où commencer à trancher le tissu en sélectionnant le bouton d’avance. Appuyez sur le bouton de la tranche et augmentez la vitesse à l’aide du bouton pour déplacer la lame vers le bord du tissu. Ensuite, appuyez à nouveau sur la tranche pour s’arrêter, et appuyez sur le bouton d’avance pour inactiver le processus.</li>
		<li>Ajuster les paramètres de coupe : vitesse d’avance de 0,03 mm/s, fréquence des vibrations de 80 Hz et amplitude horizontale des vibrations de 2 mm. Ensuite, commencez à trancher en sélectionnant le bouton de tranche.</li>
		<li>Laisser la tranche vibratome jusqu’à ce qu’elle atteigne l’extrémité du tissu, mais avant qu’elle ne frappe l’extrémité arrière du support du spécimen. À ce stade, appuyez à nouveau tranche pour arrêter. Appuyez sur le bouton Retour pour revenir à la position de départ.</li>
		<li>Sélectionnez la répétition automatique (en cliquant deux fois) qui permettra au microtome vibrant de répéter automatiquement le processus de tranchage jusqu’à 99 fois.</li>
	</ol></li>
	<li>Collecte des tranches
	<ol>
<li>Attendez jusqu’à ce que les tranches sont pleine longueur et semblent bonnes (après avoir passé les couches de muscle papillaire), puis commencer à recueillir les tranches.</li>
		<li>Recueillir les tranches à l’aide d’une pipette pasteur en plastique rempli de la solution froide Tyrode pour saisir doucement le tissu de la baignoire. Si nécessaire, utilisez des forceps et des ciseaux de printemps pour dissocier la tranche du bloc cardiaque si le tissu est encore attaché.</li>
		<li>Transférer la tranche dans une souche cellulaire dans le bain oxygéné de Tyrode (voir étape 3.7) et utiliser le liquide dans la pipette en plastique Pasteur pour amener le tissu à s’allonger à plat sur l’une des passoires cellulaires, puis ajouter une laveuse métallique sur le dessus pour retenir le tissu vers le bas. REMARQUE: Les tranches doivent être incubées au moins pendant 1 h dans la solution du Tyrode avant le traitement (c’est pour le BDM de détendre le tissu).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Tranches de coeur de culturing
<ol><li>
Préparation des tranches pour la culture
	<ol>
<li>Couper la tranche des bords pour éviter tout bord inégal. Ensuite, collez-le des deux extrémités à la ceinture de chronométrage d’imprimante stérilisée de 6 mm de large avec des fils métalliques incorporés à l’aide de colle de tissu.</li>
		<li>Transférer les tranches de coeur soutenues à 6 plaques de puits qui contiennent 6 ml de milieu de culture dans chaque puits.</li>
		<li>Placez le couvercle de la plaque de stimulation(Tableau des matériaux) sur le dessus de la plaque de 6 puits et connectez le couvercle au stimulateur électrique de culture cellulaire(tableau des matériaux). Ajuster le stimulateur pour stimuler électriquement les tranches cardiaques à 10 V, 1,2 Hz en continu tout le temps. REMARQUE : Après avoir branché la stimulation, les tranches de coeur commenceront à battre, et ce mouvement sera visuellement évident.</li>
		<li>Transférer les plaques dans un incubateur et maintenir à 37 oC avec de l’air humidifié et 5% de CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Changez la culture moyenne 3x par jour et ajoutez 6 ml de milieu de culture par puits pendant chaque changement de média. REMARQUE: Le milieu de culture est oxygéné pendant 5 minutes avant chaque changement de média. Moyen doit être changé au moins 1x par jour; c’est correct le week-end si nécessaire. Deux jours de seulement 1 changement de média par jour est le maximum qui est testé.</li>
	<li>
Modifier le couvercle de la plaque de stimulation tous les jours pour empêcher la libération de particules de graphite toxiques dans le milieu de la culture (généralement pendant le changement médiatique à la mi-journée).
	<ol>
<li>Retirez le couvercle de la plaque de stimulation du plat de culture et insérez la prise de mousse blanche où le couvercle se connecte au câble pour le stimulateur électrique de culture cellulaire, pour empêcher les dommages à l’eau au circuit électrique.</li>
		<li>Placer le couvercle de l’assiette dans un bain d’eau autoclavée avec 2x antibiotique-antimycotique. Gardez-le dans ce bain (c.-à-d. bain de rinçage) toute la nuit.</li>
		<li>Le lendemain, déplacez le couvercle de la plaque dans un bain d’éthanol de 70 % pendant 5 à 15 minutes pour décontaminer. Secouez autant de liquide de l’appareil avant de changer de bain.</li>
		<li>Ensuite, transférer le couvercle de la plaque dans le troisième et dernier bain (c.-à-d., bain propre), qui se compose d’eau autoclavée et 2x antibactérien-antimycotique, pour rincer toutes les traces d’éthanol restantes.</li>
		<li>Après avoir rincé le couvercle de la plaque dans le bain propre, utilisez une lingette propre sans peluche (pulvérisée à l’éthanol) pour sécher toute eau résiduelle sur les pièces en plastique, puis retirer le morceau de mousse blanche et placer soigneusement le couvercle de la plaque sur la plaque de culture. REMARQUE: Ne touchez pas les électrodes de graphite noir qui entrent dans le puits, car l’appareil ne sera plus stérile.</li>
		<li>En utilisant des forceps stériles, assurez-vous que le tissu est au centre du puits afin que le couvercle de la plaque ne touche pas le tissu. Assurez-vous que le côté incurvé du couvercle de la plaque correspond avec le côté incliné de la plaque et que les coins carrés s’alignent. REMARQUE : Pour minimiser la contamination des couvercles de plaque de stimulation, gardez-les dans des plaques propres et vides de 6 plaques de puits après avoir terminé l’expérience.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuez un essai MTT, des mesures de calcium et des évaluations de fonction contractile sur les tranches fraîches de coeur de porc (jour 0), et après 6 jours dans la culture selon Ou et al.13.</li>
</ol>

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</ol>

TMAM détient des participations dans Tenaya Therapeutics. Les autres auteurs ne rapportent aucun conflit.

Ici, nous décrivons le protocole vidéo détaillé pour notre méthode récemment publiée pour le débit moyen simplifié (processus jusqu’à 48 tranches / dispositif) méthode qui permet la culture des tranches de cœur de porc pour une période suffisamment longue pour tester la cardiotoxicité aigue13. Les conditions proposées imitent l’environnement du cœur, y compris la fréquence de stimulation électrique, la disponibilité des nutriments et l’oxygénation intermittente. Nous attribuons la viabilité prolon...

La cardiotoxicité induite par la drogue est une cause majeure de retrait du marché1. Dans la dernière décennie du 20e siècle, huit médicaments non-cardiovasculaires ont été retirés du marché car ils ont entraîné la mort subite due à des arythmies ventriculaires2. En outre, plusieurs thérapies anticancéreuses (bien que dans de nombreux cas efficaces) peuvent conduire à plusieurs effets cardiotoxiques, y compris la cardiomyopathie et les arythmies. Par exemple, les thérapies traditionnelles (p. ex., anthracyclines et rayonnement) et les traitements ciblés (p. ex., trastuzumab) du cancer du sein peuvent entraîner des complications cardiovasculaires chez un sous-ensemble de patients3. Une étroite collaboration entre les cardiologues et les oncologues (via le domaine émergent de la « cardio-oncologie ») a contribué à rendre ces complications gérables en veillant à ce que les patients puissent être traités efficacement2. Les effets cardiovasculaires des nouveaux agents sont moins clairs, y compris les inhibiteurs Her2 et PI3K, surtout lorsque les thérapies sont utilisées en combinaison. Par conséquent, il existe un besoin croissant de stratégies de dépistage précliniques fiables pour les toxicités cardiovasculaires associées aux thérapies anticancéreuses émergentes avant les essais cliniques humains. Le manque de disponibilité des systèmes de culture pour les tissus cardiaques humains qui est fonctionnellement et structurellement viable pour plus de 24 h est un facteur limitant pour des tests de cardiotoxicité fiables. Par conséquent, il est urgent de développer un système fiable pour la culture des tissus cardiaques humains dans des conditions physiologiques pour tester la toxicité des médicaments.
Le récent mouvement vers l’utilisation de cardiomyocytes pluripotents induits par les cellules souches induites par l’homme (smS-h) dans les tests de cardiotoxicité a fourni une solution partielle pour résoudre ce problème; cependant, la nature immature des hiPSC-CMs et la perte d’intégrité tissulaire par rapport à la nature multicellulaire du tissu cardiaque sont des limites majeures de cette technologie4. Une étude récente a partiellement surmonté cette limitation par la fabrication de tissus cardiaques à partir de hiPSC-CMs sur les hydrogels et les soumettant à une augmentation progressive de la stimulation électrique au fil du temps5. Cependant, leurs propriétés électromécaniques n’ont pas atteint la maturité vue dans le myocarde humain adulte. En outre, le tissu cardiaque est structurellement plus compliqué, étant composé de divers types de cellules, y compris les cellules endothéliales, les neurones et divers types de fibroblastes stromal liés avec un mélange très spécifique de protéines de matrice extracellulaire6. Cette hétérogénéité de la population cellulaire non cardiomyocyte7,8,9 dans le cœur adulte de mammifères est un obstacle majeur dans la modélisation des tissus cardiaques en utilisant des types individuels de cellules. Ces limitations majeures soulignent l’importance de développer des méthodes pour permettre la culture du tissu cardiaque intact pour des études optimales impliquant des conditions physiologiques et pathologiques du cœur5.
La culture des tranches de cœur humain est un modèle prometteur de myocarde humain intact. Cette technologie donne accès à un système multicellulaire 3D complet qui est similaire au tissu cardiaque humain qui pourrait refléter de façon fiable les conditions physiologiques ou pathologiques du myocarde humain. Cependant, son utilisation a été sévèrement limitée par la courte période de viabilité dans la culture, qui ne s’étend pas au-delà de 24 h en utilisant les protocoles les plus robustes signalés jusqu’en 201810,11,12. Cette limitation était due à de multiples facteurs, y compris l’utilisation de l’interface air-liquide pour la culture des tranches, et l’utilisation d’un simple milieu de culture qui ne supporte pas les exigences énergétiques élevées du tissu cardiaque. Nous avons récemment développé un système de culture submergé qui est en mesure de fournir une stimulation électrique continue et optimisé les composants des médias de la culture pour garder les tranches de tissu cardiaque viables pour un jusqu’à 6 jours13. Ce système de culture a le potentiel de devenir un puissant modèle prédictif in situ humain pour les tests de cardiotoxicité aigus pour combler l’écart entre les résultats précliniques et cliniques d’essais. Dans l’article actuel, nous détaillant le protocole pour trancher et se poursier les tranches de coeur à l’aide d’un cœur de porc à titre d’exemple. Le même processus s’applique aux cœurs humains, aux chiens, aux moutons ou aux chats. Avec ce protocole, nous espérons diffuser la technologie à d’autres laboratoires de la communauté scientifique.

<table><tbody><tr><td>1 000 ml, 0,22 et micro ; m, Systèmes de filtration/stockage sous vide</td><td>VWR</td><td>28199-812</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td><td>Fisher</td><td>AC150375000</td><td></td></tr><tr><td>500 mL, 0,22 & micro ; m, Filtre à vide/Systèmes de stockage</td><td>VWR</td><td>28199-788</td><td></td></tr><tr><td>Couvercle de parabole C à 6 puits (couvercle de plaque de stimulation électrique)</td><td>Ion Optix</td><td>CLD6WFC</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 6 puits</td><td>Fisher</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline USA</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-Antimycotique</td><td>Thermo</td><td>15-240-062</td><td></td></tr><tr><td>C-Pace EM ( </td><td>Ion Optix</td><td>CEP100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium (CaCl2)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Lames en céramique pour microtome vibrant</td><td>Campden Instruments</td><td>7550-1-C</td><td></td></tr><tr><td>Cooley Chest Retractor</td><td>Millennium Surgical</td><td>63-G5623</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel jetable #20</td><td>Biologyproducts.com</td><td>DS20X</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers, stérile, Corning</td><td>VWR</td><td>21008-952</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Thermo</td><td>A3160502</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fisher</td><td>NC9475675</td><td></td></tr><tr><td>Héparine sel sodique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl BLUE Colle à tissu</td><td>Amazon</td><td></td><td><a href="https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ » target="_blank">https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/</a></td></tr><tr><td>Iris Ciseaux à ressort</td><td>Fisher</td><td>NC9019530</td><td></td></tr><tr><td>Iris Ciseaux</td> <td>droitsFisher</td><td>731210</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>ITS Supplément de milieu liquide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine HCl (500 mg/10 mL)</td><td>West-Ward</td><td>NDC 0143-9508</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (MgCl2)</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Mayo SuperCut Ciseaux</td> <td>chirurgicauxAROSurgical Instruments Corporation</td><td>AROSuperCut&trade ; 07.164.17</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199, Earle’s Salts</td><td>Thermo</td><td>11-150-059</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur d’oxygène</td><td>Praxair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réservoirs d’oxygène -</td><td>Praxair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur en plastique</td><td>Fisher</td><td>13-711-48</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>AC193780010</tr><tr><td>Imprimante Distribution Courroie</td><td>Amazon</td><td></td><td><a href="https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ » target="_blank">https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/</a></td></tr><tr><td>Lames rectangulaires de rasoir</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF basic</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr><td>VEGF humain recombinant</td><td>R& D Systems</td><td>293-VE-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>Scalpels rétractables</td><td>Fisher</td><td>22-079-716</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium (NaHCO3)</td><td>Fisher</td><td>AC217125000</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>AC327300010</td><td></td></tr><tr><td>Microtome vibrant</td><td>Campden Instruments</td><td>7000 SMZ-2</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine HCl (100 mg/mL)</td><td>Approvisionnement vétérinaire Heartland</td><td>NADA 139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

découper et cultiver des cœurs de porc dans des conditions physiologiques

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

De nombreux nouveaux médicaments échouent dans les études cliniques en raison d’effets secondaires cardiotoxiques que les essais in vitro actuellement disponibles et les modèles animaux in vivo mal prédire les responsabilités cardiaques humaines, posant un fardeau de plusieurs milliards de dollars sur l’industrie pharmaceutique. Par conséquent, il existe un besoin médical non satisfait dans le monde entier de meilleures approches pour identifier la cardiotoxicité des médicaments avant d’entreprendre des essais coûteux et longs « d’abord chez l’homme ». À l’heure actuelle, seules les cellules cardiaques immatures (cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme [hiPSC-CMs]) sont utilisées pour tester l’efficacité thérapeutique et la toxicité des médicaments, car elles sont les seules cellules cardiaques humaines qui peuvent être cultivées pendant de longues périodes. pour tester l’efficacité et la toxicité des médicaments. Cependant, un type de cellule unique ne peut pas reproduire le phénotype du tissu cardiaque 3D complexe qui est formé de plusieurs types de cellules. Fait important, l’effet des médicaments doit être testé sur les cardiomyocytes adultes, qui ont des caractéristiques différentes et des réponses de toxicité par rapport aux hélico-CM immatures. Culturing tranches cardiaques humaines est un modèle prometteur de myocarde humain intact. Cette technologie donne accès à un système multicellulaire complet qui imite le tissu cardiaque humain et reflète les conditions physiologiques ou pathologiques du myocarde humain. Récemment, grâce à l’optimisation des composantes des médias culturels et des conditions de culture pour inclure la stimulation électrique continue à 1,2 Hz et l’oxygénation intermittente du milieu de la culture, nous avons développé une nouvelle configuration du système culturel qui préserve la viabilité et la fonctionnalité des tranches de cœur humain et porcine pendant 6 jours dans la culture. Dans le protocole actuel, nous détail faisons part de la méthode de découpe et de culture du cœur de porc. Le même protocole est utilisé pour la culture des tranches de cœurs humains, de chiens, de moutons ou de chats. Ce système de culture a le potentiel de devenir un puissant modèle prédictif in situ humain pour les tests de cardiotoxicité aigu qui comble l’écart entre les résultats des tests précliniques et cliniques.

À l’aide d’un stimulateur électrique de culture cellulaire disponible dans le commerce qui peut accueillir huit 6 plaques de puits à la fois, nous avons imité le milieu cardiaque adulte en induisant la stimulation électrique à la fréquence physiologique (1,2 Hz), et examiné pour les composants moyens fondamentaux pour prolonger la durée des tranches fonctionnelles de coeur de porc dans la culture13. Puisque le porc et les coeurs humains sont semblables dans la tail...

Ce protocole décrit comment trancher et culturer le tissu cardiaque dans des conditions physiologiques pendant 6 jours. Ce système de culture pourrait être utilisé comme une plate-forme pour tester l’efficacité de nouvelles thérapies d’insuffisance cardiaque ainsi que des tests fiables de cardiotoxicité aigue dans un modèle cardiaque 3D.

Découper et cultiver des cœurs de porc dans des conditions physiologiques

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

Ce protocole est pour trancher et culturer des sections de tissu cardiaque pendant six jours dans des conditions physiologiques qui peuvent être employées pour l’essai aigu de toxicité cardiaque aussi bien que l’efficacité d’essai des thérapies d’arrêt du coeur. Ce système de culture a le potentiel de devenir un puissant modèle in situ humain prédictif pour les tests de toxicité cardiaque aiguë qui comblera l’écart entre les résultats des essais précliniques et cliniques. Qinghui Qu, un directeur de laboratoire de notre laboratoire, démontrera les procédures.Pour obtenir des tranches de tissu cardiaque de porc, ajoutez d’abord de la glace à la veste de refroidissement du bain de tissu d’un vibratome et ajoutez la solution Tyrode au bain. Utilisez un bocal en plastique d’un litre pour recueillir le ruissellement de glace fondue de la veste de refroidissement de bain de tissu et transférer le coeur de porc à un plateau contenant un litre de solution cardioplégique froide fraîche dans une armoire de biosécurité. Utilisez des scalpels stériles rétractables pour disséquer le cœur pour isoler le ventricule gauche et utiliser des lames de rasoir rectangulaires pour couper le ventricule gauche en blocs d’un à deux centimètres cubes.Réserver un bloc tissulaire pour le tranchage et placer les morceaux restants de bloc de tissu dans un tube de 50 millilitres de solution tyrode froide sur la glace. Masser délicatement le bloc de tissu réservé et ajouter une à deux gouttes de colle tissulaire au porte-échantillon métallique du vibratome. Collez un morceau de bloc d’agar de 4% avec une surface d’environ un centimètre carré à la colle et ajoutez une à deux gouttes de colle de tissu à l’agar.Attachez le bloc cardiaque au côté épidardium cardiaque d’agar vers le bas avec le tissu aussi plat contre le support que possible et placez le support de tissu avec le bloc de coeur dans le bain de tranchement du vibratome. Il est crucial de coller le bloc cardiaque à l’agar avec le côté épidardium cardiaque face vers le bas sur la colle tissulaire et de s’assurer que le tissu est aussi plat que possible. Attachez ensuite le tube d’oxygène au bain de tranchage et au plateau métallique rempli de solution Tyrode et placez 40 passoires à cellules micromètres sur le plateau métallique pour recueillir les sections des tissus cardiaques au fur et à mesure qu’elles sont tranchées.Utilisez le logiciel d’exploitation vibratome pour ajuster la hauteur de la lame et de l’échantillon de sorte que la lame est proche du haut du tissu, mais en dessous des muscles papillaires et le liquide couvre le tissu et la lame. Sélectionnez avance pour ajuster où commencer à trancher le tissu. Appuyez sur la tranche pour augmenter la vitesse et utilisez le bouton pour déplacer la lame vers le bord du tissu.Appuyez à nouveau sur trancher pour arrêter et avancer pour inactiver le processus. Ajustez ensuite les paramètres de coupe indiqués et pressez la tranche pour commencer à trancher le tissu. Lorsque la lame atteint l’extrémité du tissu, mais avant qu’elle n’atteigne l’extrémité du porte-spécimen, appuyez à nouveau sur trancher pour arrêter et appuyer sur le retour pour revenir à la position de départ.Lorsque les tranches atteignent toute la longueur et semblent être de bonne qualité, utilisez une pipette Pasteur en plastique remplie de solution tyrode froide pour recueillir doucement le tissu du bain à l’aide de forceps et ciseaux de printemps pour disloquer la tranche du cœur si nécessaire. Placez chaque tranche recueillie dans une passoire à cellules unique dans le bain tyrode oxygéné et utilisez la solution dans la pipette pour presser le tissu sur la surface de la passoire cellulaire. Placez ensuite une laveuse métallique sur le dessus du tissu pour la retenir.Après au moins une heure dans la solution tyrode oxygénée, couper l’extérieur de chaque tranche pour enlever les bords inégaux et coller l’extrémité de chaque tranche sur un morceau de six millimètres de large de la ceinture de synchronisation de l’imprimante en polyuréthane stérilisée avec des fils métalliques intégrés. Placez les tranches de cœur soutenues dans des plaques de six puits contenant six millilitres de milieu de culture par puits et utilisez des forceps stériles pour vous assurer que le tissu est au centre du puits. Faites en sorte que le couvercle de la plaque ne touche pas le tissu et placez la plaque sur la plaque de culture de sorte que le côté incurvé de la couverture de plaque corresponde avec le côté incliné de la plaque et que les coins carrés s’alignent.Placer les tranches dans un incubateur de 37 degrés Celsius et de 5 % de dioxyde de carbone. Remplacez les supernatants de culture par six millilitres de culture fraîche oxygénée trois fois par jour. Connectez le couvercle au stimulateur électrique de culture cellulaire et ajustez le stimulateur pour fournir en continu 10 volts d’électricité et une fréquence de 1,2 hertz aux tranches cardiaques.Après avoir branché la stimulation, les tranches cardiaques commenceront à battre. Tous les jours pendant le changement de milieu de midi, remplacez la couverture de plaque de stimulation du plat de culture pour empêcher la libération des particules toxiques de graphite dans le milieu de culture. Insérez le bouchon de mousse blanche où le couvercle utilisé se connecte au câble pour le stimulateur électrique de culture cellulaire afin d’éviter les dommages causés par l’eau au circuit électrique et placez le couvercle de la plaque dans un bain d’eau autoclavée complété par un antibiotique/antimycotique 2X.Le lendemain, décontaminer le couvercle de la plaque dans un bain à 70% d’éthanol pendant cinq à 15 minutes avant de transférer le couvercle dans un bain d’eau fraîche autoclavé complété par 2X antibiotique / antimycotique pendant trois minutes. Après le rinçage du couvercle de la plaque, utilisez un lingette propre sans peluche pulvérisée à l’éthanol pour enlever l’eau résiduelle des pièces en plastique et enlever le bouchon de mousse blanche. Le couvercle est alors prêt à être remis dans la plaque de culture.En utilisant cette nouvelle configuration de culture biomimétique comme démontré, la viabilité des tranches de coeur de porc a été maintenue pendant six jours tel qu’évalué par l’essai de MTT. Dans les six premiers jours, semblables aux réponses observées pour les tranches fraîches de coeur, il n’y a aucun transitoire spontané de calcium dans les cardiomyocytes de tranche de coeur de porc. Les cardiomyocytes ont répondu à la stimulation électrique et bêta-adrénergique externe.En outre, la force contractile et les réponses à l’isoproterenol ont été maintenues dans la culture de tranche de coeur pendant jusqu’à six jours semblables à celle observée dans les tranches fraîches de coeur. Plusieurs évaluations structurelles et fonctionnelles peuvent être effectuées sur les tranches cardiaques, y compris les tests de viabilité du MTT, l’immunostaining, la microscopie électronique, les mesures transitoires du calcium, les évaluations des fonctions contractiles, les évaluations métaboliques et l’analyse. Nous utilisons actuellement ce système de culture pour tester la toxicité cardiaque aiguë et l’efficacité des médicaments et des thérapies géniques d’intérêt pour les tranches de porc et de cœur humain.

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