Name: Imagerie en accéléré des essaims bactériens et de la réponse collective au stress (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Découvrez l'imagerie en accéléré des essaims de Pseudomonas aeruginosa et leur réponse collective au stress bactériophage et antibiotique. Cette méthode simple visualise les dynamiques de motilité bactérienne en temps réel.

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J.-L.B., A.S., et N.M.H-K. écrit et révisé le manuscrit. Tous les auteurs ont conçu les expériences. J.-L.B. a effectué les expériences et l’analyse. Ce travail a été soutenu par le prix des NIH K22AI112816 et la subvention R21AI139968 aux A.S. et à l’Université de Californie. N.M.H-K. a reçu l’appui des bourses Lundbeck R220-2016-860 et R251-2017-1070. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la décision de soumettre l’œuvre à la publication. Nous n’avons pas d’intérêts contradictoires à déclarer.

1. Préparation des plaques d’agar grouillantes pour p. aeruginosa Swarming Time-lapse Imaging
<ol><li>Préparer 1 L de 5x M8 média minimum dans une bouteille en verre en ajoutant 64 g de Na2HPO47H2O, 15 g de KH2PO4, et 2,5 g de NaCl dans 500 mL d’eau double distillée (ddH2O). Ajuster le volume final à 1 L avec ddH2O. Autoclave supplémentaire pour stériliser et stocker les supports liquides à température ambiante.</li>
	<li>Préparer 100 ml de MgSO4 mgSO 4 (sulfate de magnésium) dans une bouteille en verre en ajoutant 24,6 g de MgSO4à 7H2O dans 50 mL ddH2O. Ajuster le volume final à 100 ml avec ddH2O. Autoclave supplémentaire à stériliser. Conserver à température ambiante.</li>
	<li>Préparer 100 ml d’acides casamino de 20 % dans une bouteille en verre en ajoutant 20 g d’acides casaminos dans 50 mL ddH2O. Ajuster le volume final à 100 ml avec ddH2O. Autoclave supplémentaire pour stériliser. Conserver à température ambiante.</li>
	<li>Préparer 100 ml de glucose de 20 % dans une bouteille en verre en ajoutant 20 g de glucose en ddH2O. Ajuster le volume final à 100 ml avec ddH2O. Stériliser par filtration avec filtre de 0,22 m. Conserver à température ambiante.</li>
	<li>Pour faire 10 plaques d’agar grouillant, ajouter 1 g d’agar dans 100 ml de ddH2O et ajuster le volume final à 160 ml avec ddH2O supplémentaire dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml. Stériliser par autoclaving.<ol>
<li>Immédiatement après l’autoclaving, placez la solution d’agar dans un bain d’eau de 55 oC pendant 15 min.</li>
		<li>Retirez la solution d’agar du bain d’eau et ajoutez 40 ml de support minimum de 5x M8, 200 L de 1 M MgSO4,2 ml de glucose de 20 % et 5 ml d’acides casamino de 20 %15. Procédez à l’étape 1.6 immédiatement après le mélange. REMARQUE : Les concentrations finales sont de 0,5 % d’agar, de 1 mM MgSO4,de 0,2 % de glucose et de 0,5 % d’acides casamino.</li>
	</ol>
</li>
	<li>À l’aide d’une pipette de 25 ml pour un volume constant, ajouter 20 ml de la solution d’agar grouillante par plat Petri de 10 cm de diamètre. REMARQUE : Un volume fixe de solution d’agar est important, car le volume affecte le temps de séchage et la teneur en humidité de l’agar. Évitez les bulles lors de la fabrication des plaques d’agar grouillantes.</li>
	<li>Laisser l’agar se solidifier en plaçant les plaques d’agar grouillantes dans une seule pile avec couvercles allumés pendant 1 h sur le banc à température ambiante. Allumez le déshumidificateur pour diminuer l’humidité relative de la pièce à 40-50% 1 h avant l’étape suivante.</li>
	<li>Séchez les plaques d’agar grouillantes pendant 30 minutes supplémentaires avec les couvercles éteints dans un capot de flux laminaire à 300 pi3/minavec 40 à 50 % d’humidité relative à température ambiante. Séchez l’intérieur des couvercles en les plaçant face vers le haut dans le capot de flux lamineur. Conserver les plaques d’agar grouillantes à 4 oC jusqu’à 24 h.</li>
	<li>Préparer les couvercles noirs de 10 cm de perpétre pour l’imagerie en lissant l’intérieur du couvercle avec du papier de verre. Placez les couvercles à l’intérieur d’une boîte d’emballage et placez la boîte d’emballage sous une hotte chimique. Vaporiser à l’intérieur des couvercles à l’aide de peinture noire. Laisser sécher les couvercles. REMARQUE : Les couvercles noirs peuvent être réutilaux pour d’autres expériences. Il est important que les couvercles soient peints afin qu’ils ne reflètent pas la lumière pendant la numérisation.</li>
</ol>2. Croissance des conditions de P. aeruginosa et de plating
<ol><li>Préparer 400 ml de bouillon de lysogeny (LB) en ajoutant 10 g de mélange de poudre LB-Miller en 400 ml ddH2O. Pour 2% de plats LB-agar Petri, ajouter 8 g d’agar supplémentaire. Autoclave pour stériliser.</li>
	<li>Verser 20 ml de milieu LB-agar fondu dans des plats Petri de 10 cm de diamètre et leur permettre de se solidifier à température ambiante pendant la nuit. Conservez les supports liquides à température ambiante et les plaques d’agar à 4 oC.</li>
	<li>Streak P. aeruginosa sur un plat LB-agar Petri à partir d’un stock congelé stocké à -80 oC à l’aide de boucles stériles ou de bâtons en bois. Incuber le plat Petri à l’envers pendant la nuit à 37 oC. Conservez la plaque LB-agar à 4 oC jusqu’à 1 semaine.</li>
	<li>Choisissez une seule colonie du plat Petri avec une boucle stérile ou un bâton en bois, inoculez-le en milieu de 2 ml LB et incuber la culture à saturation pendant la nuit (16-18 h) à 37 oC dans un jeu à roulettes à 100 tr/min.</li>
	<li>Pipet 5 'L de la culture de nuit de l’étape 2.4 à l’aide d’un tuyau P20 et tache au centre de la plaque d’agar grouillante en s’approchant de la pointe de tuyauterie à un angle (10-45 ') 2.5 cm au-dessus de la zone de repérage, pipetting vers le bas au premier arrêt, et touchant l’agar avec seulement la goutte de liquide(figure 1B).<ol>
<li>Évitez de toucher l’agar avec la pointe de la pipe car elle endommage l’agar. Utilisez un modèle afin de positionner l’endroit uniformément à travers différentes plaques d’agar grouillantes (Figure supplémentaire S1).</li>
		<li>Pour les essais grouillants traditionnels, n’utilisez que l’endroit central et sautez à l’étape 2.8. Pour les essais collectifs de réponse au stress continuent d’étape 2.6 (pour l’infection à phage) ou l’étape 2.7 (pour le stress antibiotique).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour l’infection par le phage, mélanger 30 l de culture de nuit de P. aeruginosa de l’étape 2.4 avec 6 'L de 1 x 1012 pfu/mL phage DMS3vir20. Passez immédiatement à l’étape suivante.<ol>
<li>Pipet 6 'L du mélange P. aeruginosa-phagede l’étape 2.6 à l’aide d’un tuyauterie P20 et tache à 6 positions satellites équidistantes sur un cercle concentrique de rayon de 2,8 cm centré sur le plat Petri en approchant la pointe de la pipet à un angle (10 à 45 degrés) 2,5 cm au-dessus de la zone de repérage, tuyauter vers le bas pour le premier arrêt, et toucher l’agar avec seulement la goutte de liquide(figure 1C).</li>
		<li>Évitez de toucher l’agar avec la pointe de la pipe car elle endommage l’agar. Utilisez un modèle de placage pour la cohérence(figure supplémentaire S1). Procédez à l’étape 2.8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour les traitements antibiotiques, mélanger 30 L de culture du jour au lendemain P. aeruginosa de l’étape 2.4 avec 6 'L de 3 mg/mL gentamycine, 10 'L de 100 mg/mL kanamycin, ou 7.5 'L de 100 mg/mL fosfomycin. Passez immédiatement à l’étape suivante.<ol>
<li>Pipet 6 'L d’antibiotique traité P. aeruginosa de l’étape 2.7 à l’aide d’une pipette P20 et placez-le à 6 positions satellites équidistantes sur un cercle concentrique de rayon de 2,8 cm au centre du plat en s’approchant de la pointe de la pipet à un angle (10 à 45 degrés) 2,5 cm au-dessus de la zone de repérage, en passant au premier arrêt, et en touchant l’agar avec seulement la baisse liquide(figure 1D).</li>
		<li>Évitez de toucher l’agar avec la pointe de la pipe car elle endommage l’agar. Utilisez un modèle de placage pour la cohérence(figure supplémentaire S1). Procédez à l’étape 2.8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remplacer les couvercles à vaisselle Petri transparents par des couvercles noirs fabriqués à l’étape 1.9(figure 2A).</li>
	<li>Placez les plaques d’agar grouillantes sur un scanner dans un incubateur fixé à 37 oC avec un bain d’eau de 10 L pour maintenir l’humidité à 75 %(figure 1E, figure 2B). CAUTION : Ne perturbez pas les cellules tachetées sur les plaques d’agar grouillantes. Gardez les assiettes face à face en tout temps.</li>
</ol>3. Acquisition d’images avec Scanner
<ol><li>Diminuez l’éclairage ambiant des plats Petri en attachant du tissu mat noir à une grille de 40 à 60 cm au-dessus du scanner de documents à plat. Sécurisez-le à l’aide de tyroliennes(figure 2B).</li>
	<li>Le scanner sera contrôlé à l’aide d’un logiciel de numérisation et d’un logiciel de script automatique.<ol>
<li>Dans le logiciel de numérisation, sélectionnez mode Accueil (figure 3A). Capturez des images en couleur en sélectionnant la couleur sous type d’image. Pour définir la qualité de l’image, sélectionnez Autres sous Destination et ajustez la résolution à 300 dpi. Conservez la taille standard des images en sélectionnant Original pour la taille cible. Laissez toutes les options sous les ajustements d’image non contrôlées pour la qualité standard de l’image. REMARQUE : La taille de la cible est définie à Original par défaut. Pour sélectionner d’autres options pour la taille cible, cliquez sur Aperçu en premier.</li>
	</ol></li>
	<li>Définissez le chemin d’enregistrement des images en cliquant sur l’icône du dossier à droite de Scan pour ouvrir les paramètres d’enregistrement des fichiers(figure 3A).<ol>
<li>Sélectionnez la destination de dossier pour enregistrer des images en sélectionnant d’autres sous l’emplacement et cliquez sur Parcourir. Choisissez un dossier pour enregistrer les images.</li>
		<li>Nommez les images dans la boîte à texte Prefix. Définissez le numéro de démarrage 001 pour commencer la séquence de nommage des images. Définissez le format de fichier à JPEG en choisissant JPEG (jpg) pour type sous format d’image et cliquez sur Options pour ajuster les détails. Définissez la qualité du format d’image en ajustant le niveau de compression à 16, encodez à la norme, et vérifiez le profil d’ICC d’Embed. Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre ( figure3B).</li>
		<li>Laissez la première option non contrôlée ("Overwrite tous les fichiers du même nom") et vérifiez les 3 options suivantes ("Afficher cette boîte de dialogue avant la prochaine analyse", "Dossier d’image ouvert après numérisation", et "Afficher le dialogue Ajouter page après la numérisation"). Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre</li>
		<li>Vérifiez la qualité de l’image en cliquant sur Preview. La fenêtre de prévisualisation apparaît, et l’icône Scan devient fonctionnelle(figure 3C).</li>
	</ol></li>
	<li>Utilisez le logiciel de script pour automatiser l’acquisition d’images. Le script fourni clique sur Scan dans la fenêtre Scan et OK dans la fenêtre De l’enregistrement des fichiers à intervalles de 30 minutes.<ol>
<li>Importer le script en cliquant sur La tâche ( Importer et sélectionner les fichiers Single_scan.tsk et Idle_scanning.tsk (fichiers TSK fournis sous forme de fichiers supplémentaires 1 et 2). Voir la figure 3D. REMARQUE : Single_scan.tsk clique sur le bouton Scan dans la fenêtre Scan et OK dans la fenêtre De l’enregistrement des fichiers. Idle_scanning.tsk active Single_scan.tsk toutes les 30 minutes. On peut modifier la fréquence d’analyse en modifiant l’activation de Idle_scanning.tsk.</li>
		<li>Activez la numérisation automatique à intervalles de 30 min en sélectionnant à la fois la numérisation au ralenti (importée) et l’analyse unique (importée),en cliquant à droite sur la numérisation au ralenti (importée), et en cliquant à gauche sur Enabled (figure 3D, figure supplémentaire S2). REMARQUE : La numérisation automatique s’exécute jusqu’à ce que l’utilisateur arrête manuellement le script. Pour arrêter le script, sélectionnez la numérisation Idle (importée),cliquez à droite Sur la numérisation Idle (importée)et cliquez à gauche sur Enabled. La marque de contrôle sera supprimée.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Compilation d’images Time-lapse et mesure de la répulsion des essaims
<ol><li>Effectuez le montage de films et l’analyse d’images à l’aide d’ImageJ.</li>
	<li>Importer toutes les images numérisées sur ImageJ en cliquant sur Le fichier ( Importations Séquence d’image et sélectionnez les images. Dans la fenêtre Séquence Options, vérifiez Convertir en RGB pour garder les images en couleur. Nombre d’images indique le nombre d’images sélectionnées.</li>
	<li>Gardez l’image de départ à 1 pour commencer à partir de la première image dans le dossier et les images d’échelle à 100% pour conserver la taille originale des images. Laissez utiliser la pile virtuelle non contrôlée. Cliquez sur OK et attendez que les images se chargent ( figure4A).</li>
	<li>Définissez le niveau de compression vidéo à 100 en cliquant sur Edit ( Options de vente Entrée/sortie... et ajuster la qualité JPEG à 100.</li>
	<li>Enregistrer le fichier comme un .avi en cliquant sur le fichier ( Enregistrer comme '' ' ' ' ' ' ' ' AVI. Ajuster la compression au JPEG et au taux de cadre à 5 fps(figure 4B). Enregistrez le time-lapse .avi dans le dossier désiré.</li>
	<li>Pour quantifier les distances de répulsion des essaims, ouvrez une image vers la fin de la période d’essaimage dans ImageJ. Cliquez sur le fichier (en anglais) Ouvrez et sélectionnez l’image. Ajuster l’échelle en cliquant sur Analyze . Échelle de réglage et réglage Distance en pixels à 118, distance connue à 1, rapport d’aspect Pixel à 1,0, et unité de longueur à cm(figure 4C). Laissez Global sans contrôle. Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre.</li>
	<li>Cliquez sur l’icône droite et mesurez du centre de la colonie à la position satellite jusqu’au bord de la population grouillante. Sélectionnez Analyse Mesure pour faire apparaître une nouvelle fenêtre avec les mesures (Longueur) (Figure 4D). REMARQUE : Utilisez « » pour zoomer plus près et « » pour effectuer un zoom arrière.</li>
</ol>

<ol><li>Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+density+and+mobility+protect+swarming+bacteria+against+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).</li>
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<li>Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Metabolic+and+Quorum+Sensing+Signals+Governing+the+Decision+to+Cooperate+in+a+Bacterial+Social+Trait%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait.</a> PLoS computational biology. 11 (5), 10004279(2015).</li>
<li>Bernier, S. P., Ha, D. -G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Pseudomonas+aeruginosa+surface-associated+group+behaviors+by+individual+amino+acids+through+c-di-GMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling.</a> Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole met l’accent sur la réduction de la variabilité des plaques d’agar grouillantes et la fourniture d’une méthode simple et peu coûteuse pour acquérir des images en time-lapse de P. aeruginosa grouillant et répondant au stress. Cette procédure peut être étendue à l’image d’autres systèmes bactériens en adaptant la composition des médias et les conditions de croissance. Pour P. aeruginosa, bien que M9 ou FAB milieu minimal peut être utilisé pour induire essaimage16,...

L’essaimage est une forme collective de motilité bactérienne coordonnée qui augmente la résistance aux antibiotiques et la production de facteurs de virulence dans l’hôte1,2,3. Ce comportement multicellulaire se produit sur les surfaces semi-solides qui ressemblent à celles des couches muqueuses couvrant les membranes épithéliales dans les poumons4,5. Les biosurfacteurs sont généralement produits par des populations grouillantes pour surmonter la tension de surface sur les surfaces et la production de ceux-ci est réglementée par des systèmes complexes de signalisation cellulaire, également connu sous le nom de détection du quorum6,7,8. De nombreuses espèces de bactéries sont capables d’essaimer, y compris Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, et Escherichia coli9,10,11,12. Les modèles d’essaimage créés par les bactéries sont divers et sont affectés par les propriétés physiques et chimiques de la couche de surface, y compris la composition des nutriments, la porosité et l’humidité13,14. En plus des propriétés de surface, la température de croissance et l’humidité ambiante affectent plusieurs aspects de la dynamique des essaimages, y compris le taux d’essaimage et les modèles12,13,14,15. Les variables de croissance qui affectent les essaimages créent des défis qui ont un impact sur la reproductibilité expérimentale et la capacité d’interpréter les résultats. Ici, nous décrivons une méthode standardisée simple pour surveiller la dynamique des essaims bactériens grâce à l’imagerie en time-lapse. La méthode décrit comment contrôler les conditions de croissance critiques qui affectent considérablement la progression de l’essaimage. Par rapport aux méthodes traditionnelles d’analyse des essaims, cette méthode d’imagerie en time-lapse permet de suivre simultanément la motilité de plusieurs essaims pendant de longues périodes et à haute résolution. Ces aspects améliorent la profondeur des données qui peuvent être obtenues en surveillant les essaims et facilitent l’identification des facteurs qui affectent l’essaimage.
L’essaimage dans P. aeruginosa est facilité par la production et la libération de rhamnolipids et 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)acides alplacés dans la zone environnante6,16. L’introduction du stress dû aux concentrations subtaltalgiques d’antibiotiques ou d’infection par le virus du phage a une incidence sur l’organisation d’essaims. En particulier, ces contraintes incitent P. aeruginosa à libérer la molécule de détection du quorum 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone, également connu sous le nom pseudomonas quinolone signal (PQS)17,18. Dans les essais d’essaim qui contiennent deux populations d’essaims, le PQS produit par la population induite par le stress repousse les essaims non traités d’entrer dans la région contenant le stress(figure 1). Cette réponse collective au stress constitue un système de signalisation de communication de danger qui avertit P. aeruginosa au sujet des menaces à proximité18,19. Les effets du stress sur P. aeruginosa, l’activation de la réponse collective au stress, et la répulsion des essaims peuvent être visualisés à l’aide de la méthode d’imagerie time-lapse décrite ici. Le protocole décrit ici explique comment : (1) préparer des plaques d’agar pour essaimage, (2) la culture P. aeruginosa pour deux types d’essais (des essais grouillants traditionnels ou des essais collectifs de réponse au stress)(figure 1), (3) acquérir des images en time-lapse, et (4) utiliser ImageJ pour compiler et analyser les images.
En bref, P. aeruginosa d’une culture de nuit est repéré au milieu d’une plaque d’agar grouillant tandis que P. aeruginosa qui sont infectés par le phage ou traités avec des antibiotiques sont repérés aux positions satellites. La progression de l’essaimage de P. aeruginosa est surveillée sur un scanner à plat de documents de consommation qui est placé dans un incubateur de 37 oC régi par l’humidité. Le scanner est contrôlé par un logiciel qui scanne automatiquement les plaques à intervalles réguliers au cours de la période de croissance de l’essaim, généralement 16-20 h. Cette méthode donne des vidéos simultanées en time-lapse de jusqu’à six plaques grouillantes de 10 cm. Les images sont compilées dans des films et la répulsion des essaims par des populations induites par le stress est quantifiée en utilisant un logiciel ImageJ librement disponible. Une attention particulière est accordée pour assurer la cohérence et la reproductibilité entre les différentes expériences d’essaimage.

<table><tbody><tr><td>Gélose <forte>réactifs</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>gélose Bacto, déshydratée</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td>Pour plaque de gélose LB et plaque de gélose d’essaimage</td></tr><tr><td>Casamino</td><td>acides aminés BD Difco</td><td>223050</td><td>Pour milieu d’essaimage</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16500</td><td>Dextrose. Pour les milieux d’essaimage,</td></tr><tr><td>fosfomycine, sel disodique</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>F0889</td><td>Concentration de la matière : 200 mg/mL. Dissous dans ddH2O</td></tr><tr><td>Sulfate de gentamycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1914</td><td>Concentration stock : 3 mg/mL. Dissous dans le ddH2O</td></tr><tr><td>Sulfate de kanamycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>Concentration mère : 100 mg/mL. Dissous dans du ddH2O</td></tr><tr><td>LB-Miller</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>Pour le bouillon LB et les plaques de gélose LB</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>Pour les milieux essaimage</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>Pour 5x milieux M8</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Pour 5x milieux M8</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique heptahydraté</td><td>Fisher Chemical</td><td>S373</td><td>Pour 5x milieux M8</td></tr><tr><td><fortes>souches</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>Siryaporn lab</td><td>AFS27E.118</td><td>PA14 souche</td></tr><tr><td>DMS3vir</td><td>O’Toole lab</td><td>DMS3vir20</td><td>Bactériophage</td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papier de verre en oxyde d’aluminium</td><td>3M</td><td>150 Fine</td><td>Pour couvercles noirs</td></tr><tr><td>Tissu noir</td><td>Joann</td><td>PRD7089</td><td>Tissu noir</td></tr><tr><td>Peinture en aérosol noire</td><td>Krylon</td><td>5592 Noir mat</td><td>Pour couvercles noirs</td></tr><tr><td>Erlenmeyer flask</td><td>Kimax</td><td>26500</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Bouteilles de stockage en verre</td><td>Pyrex</td><td>13951L</td><td>250 mL, 500 mL, 1 000 mL</td></tr><tr><td>Attaches zippées de 8 pouces</td><td>Gardner Bender</td><td>E173770</td><td>Pour fixer des boîtes de Pétri en tissu noir mat</td></tr><tr><td>(100 mm x 15 mm)</td><td>Plaques de</td><td></td><td>polystyrène Fisher FB0875712 100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Bâtonnets en bois</td><td>Fisher</td><td>23-400-102</td><td>Pour le stries et l’inoculation de bactéries</td></tr><tr><td><fort>Équipement</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marché de l’autoclave</td><td>Forge Industries</td><td>STM-E</td><td>Pour la stérilisation des réactifs</td></tr><tr><td>Pipette de 25 mL</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1072-5410</td><td>À pipeter 20 mL pour plaques de gélose en essaim</td></tr><tr><td>Déshumidificateur</td><td>Frigidaire</td><td>FAD704DWD 70 pintes</td><td>Pour maintenir l’humidité relative de la pièce à environ 45</td></tr><tr><td> %ImageJ</td><td>NIH</td><td>v1.52a</td><td>Logiciel pour l’analyse d’images</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>Pour la croissance des bactéries à 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>Bain-marie Isotemp</td><td>Fisher</td><td>15-462-21Q</td><td>Pour fluide de refroidissement à 55 &deg ; C</td></tr><tr><td>Hotte à flux laminaire</td><td>The Baker Company</td><td>SG603A</td><td>Pour le séchage des plaques</td></tr><tr><td>Pipette P-20</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td>Spotting sur plaques d’agglomération</td></tr><tr><td>Contrôleur de pipette</td><td>BrandTech</td><td>accu-jet</td><td>To pipette 20 mL pour l’essaimage des plaques d’agar</td></tr><tr><td>Roller Drum</td><td>New Brunswick</td><td>TC-7</td><td>Pour la croissance des bactéries à 100 tr/min</td></tr><tr><td>Scanner</td><td>Epson</td><td>Epson Perfection V370</td><td>Scanner photo pour plaques d’imagerie</td></tr><tr><td>Logiciel d’automatisation de scanner</td><td>RoboTask Lite</td><td>v7.0.1.932</td><td>Pour l’imagerie interne de 30 min</td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition d’images Epson</td><td></td><td>v9.9.2.5US</td><td>Logiciel pour plaques d’imagerie</td></tr></tbody></table>

imagerie en accéléré des essaims bactériens et de la réponse collective au stress

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

L’essaimage est une forme de motilité de surface observée chez de nombreuses espèces bactériennes, y compris Pseudomonas aeruginosa et Escherichia coli. Ici, des populations denses de bactéries se déplacent sur de grandes distances dans les communautés caractéristiques en forme de tendril au cours des heures. L’essaimage est sensible à plusieurs facteurs, y compris l’humidité moyenne, l’humidité et la teneur en éléments nutritifs. En outre, la réponse collective au stress, qui est observée dans P. aeruginosa qui sont stressés par les antibiotiques ou le bactériophage (phage), repousse les essaims de s’approcher de la zone contenant le stress. Les méthodes décrites ici traitent de la façon de contrôler les facteurs critiques qui affectent l’essaimage. Nous introduisons une méthode simple pour surveiller la dynamique des essaims et la réponse collective au stress à haute résolution temporelle à l’aide d’un scanner de documents à plat, et décrivons comment compiler et effectuer une analyse quantitative des essaims. Cette méthode simple et rentable fournit une quantification précise et bien contrôlée des essaimages et peut être étendue à d’autres types d’essais de croissance à base de plaques et d’espèces bactériennes.

Les étapes pour cultiver P. aeruginosa,stressent les cellules, et imagent les plaques d’agar grouillantes sont représentées dans la figure 1. Nous avons inoculé une seule colonie de souche P. aeruginosa UCBPP-PA14 de type sauvage à partir d’une plaque de LB-agar dans 2 ml de bouillon LB pendant la nuit à 37 oC et repérée à 5 ll au centre de la plaque d’agar qui grouille. L’imagerie en time-lapse de cette plaque révèle la croissance initiale sous la forme d’une colonie au centre, puis la...

Nous détaillons une méthode simple pour produire des films à time-lapse haute résolution d’essaims pseudomonas aeruginosa qui répondent à la bactériophage (phage) et au stress antibiotique à l’aide d’un scanner de documents à plat. Cette procédure est une méthode rapide et simple pour surveiller la dynamique des essaims et peut être adaptée pour étudier la motilité et la croissance d’autres espèces bactériennes.

Imagerie en accéléré des essaims bactériens et de la réponse collective au stress

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

Ce protocole peut être utilisé pour produire des films en accéléré de Pseudomonas aeruginosa grouillant et pour capturer la répulsion de l’essaim par bactériophage ou antibiotiques. Les films en accéléré capturent la dynamique détaillée de la réponse grouillante aux antibiotiques et au bactériophage et la technique ne nécessite qu’un déshumidificateur, un ordinateur, un incubateur et un scanner de documents. Pour préparer des plaques d’agar grouillantes pour l’imagerie grouillante de P.aeruginosa, utilisez une pipette de 25 millilitres pour ajouter 20 millilitres de solution d’agar grouillante à chaque boîte de Pétri expérimentale de 10 centimètres de diamètre.Placer les assiettes dans une seule pile avec couvercles pendant une heure à température ambiante. Allumez un déshumidificateur pour réduire l’humidité relative de la pièce à 40-50 %Lorsque l’agar s’est solidifiée, séchez les plaques d’agar grouillantes pendant 30 minutes supplémentaires dans un capot d’écoulement laminaire avec les couvercles éteints et faites face à 300 pieds cubes par minute avec une humidité relative de 40 à 50 % à température ambiante. Rangez ensuite les plaques d’agar grouillantes séchées à quatre degrés Celsius jusqu’à 24 heures.Pour le placage d’agar grouillant, maintenez une pointe de pipette P20 chargée de cinq microlitres d’une culture p.aeruginosa de nuit à un angle de 10-45 degrés 2-1/2 centimètres au-dessus du centre d’une plaque grouillante et déprimez le piston au premier arrêt touchant l’agar avec seulement la chute liquide. Utilisez un modèle pour positionner l’endroit uniformément à travers les différentes plaques d’agar grouillantes. Pour plaquer une infection de phage, mélangez d’abord 30 microlitres de P.aeruginosa cultivé pendant la nuit avec six microlitres d’une fois 10 aux 12 unités de formation de plaque par millilitre de phage DMS3 vir et ajoutez immédiatement six microlitres du mélange de phage de P.aeruginosa à six positions satellites équidistantes sur un cercle concentrique de rayon de 2,8 centimètres tel que démontré.Utilisez un modèle pour positionner l’endroit uniformément à travers différentes plaques d’agar grouillantes. Pour plaquer les traitements antibiotiques, mélanger 30 microlitres de P.aeruginosa cultivé pendant la nuit avec la concentration et le volume appropriés de l’antibiotique d’intérêt et ajouter immédiatement six microlitres des bactéries traitées aux antibiotiques à six positions satellites équidistantes sur un cercle concentrique de rayon de 2,8 centimètres autour du centre du plat. Utilisez un modèle pour positionner l’endroit uniformément à travers les différentes plaques d’agar grouillantes.Lorsque toutes les cultures ont été plaquées, remplacez les couvercles de boîte petri transparents par des couvercles noirs sur mesure. Placez soigneusement les plaques d’agar grouillantes sur un scanner dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius avec un bain d’eau de 10 litres pour maintenir l’humidité à 75%Après avoir placé les plaques dans le scanner, ouvrez le fichier et enregistrez les paramètres pour définir le chemin d’enregistrement pour les images et cliquez sur balayage et OK à intervalles de 30 minutes. Pour automatiser l’acquisition de l’image, utilisez le logiciel de script.Sélectionnez à la fois la numérisation au ralenti et l’analyse unique et cliquez à droite sur la numérisation au ralenti, puis cliquez à gauche sur activé. À la fin de l’incubation, importez toutes les images numérisées dans ImageJ. Dans la fenêtre d’options de séquence, le nombre d’images indiquera le nombre d’images sélectionnées.Continuez l’image à un pour commencer à partir de la première image dans le dossier et les images d’échelle à 100% pour conserver la taille originale des images. Cliquez secrètement sur RGB pour garder les images en couleur. Laissez l’utilisation de la pile virtuelle non contrôlée et cliquez sur OK pour charger les images.Cliquez sur fichier, enregistrer comme et AVI pour fusionner les images dans un fichier AVI. Réglez la compression en JPEG et la vitesse d’image à cinq images par seconde. Enregistrez ensuite le time-lapse AVI dans le dossier de stockage approprié.L’imagerie en accéléré d’une seule colonie de P.aeruginosa de type sauvage à partir d’une plaque d’agar LB dans le bouillon LB pendant la nuit à 37 degrés Celsius et repérée au centre d’une plaque d’agar grouillante révèle une croissance initiale sous la forme d’une colonie au centre de la plaque qui se propage dans les vrilles radialement de la colonie. Les essaims se déplacent du centre des plaques d’agar grouillantes vers la périphérie et sont repoussés par un signal de stress émis par les bactéries infectées par des phages ou traitées par la gentamycine. Les phages ou la gentamycine repérés seuls aux positions satellites ne font pas enroumer les populations pour éviter ces zones.Utilisez une pipette de 25 millilitres pour vous assurer que les plaques d’agar grouillantes contiennent exactement 20 millilitres. Il est également important d’ajuster le temps de séchage des plaques en fonction de l’environnement du laboratoire. Notre technique nous permet de visualiser les modèles grouillants globaux des populations de Pseudomonas aeruginosa.L’objectif suivant est de surveiller la motilité cellulaire individuelle à l’aide de la microscopie Brightfield.

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Enregistrement Comportement multicellulaire en<em&gt; Myxococcus xanthus</em&gt; Les biofilms en utilisant Time-lapse microcinématographie

Source : Bru, J., et al., Imagerie en accéléré des essaims bactériens et de la réponse collective au stress. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre la procédure d’analyse du comportement d’essaimage de Pseudomonas aeruginosa en observant la croissance bactérienne d’une culture centrale vers des points satellites contenant la même culture mélangée à un antibiotique, à l’aide d’une configuration de plaque de gélose et d’une imagerie en accéléré.

Comportement d’essaimage de Pseudomonas aeruginosa sous stress antibiotique

Source : Bru, J., et.al. Imagerie en accéléré des essaims bactériens et de la réponse collective au stress. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre comment visualiser et mesurer le comportement d’évitement d’essaim chez Pseudomonas aeruginosa à l’aide d’un test sur plaque de gélose en essaimage. Il montre la configuration de l’imagerie en accéléré dans des conditions contrôlées et explique comment les signaux de stress induits par les antibiotiques redirigent le mouvement bactérien, qui est...

Imagerie et quantification des réponses d’évitement de l’essaim au stress antibiotique chez Pseudomonas aeruginosa

Source : Morales-Soto, N. et al., Préparation, imagerie et quantification des essais de motilité de surface bactérienne. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo montre un test d’essaimage utilisant des bactéries qui expriment une protéine fluorescente verte pour observer la motilité de surface sur la gélose molle. L’imagerie en accéléré capture l’expansion coordonnée et la formation de vrilles, mettant en évidence la motilité de surface bactérienne.

Essai d’essaimage pour la visualisation de la motilité de surface bactérienne

Source : Cayron, J., et al. Analyse multi-échelle de la croissance bactérienne sous traitement de stress. J. Vis. Exp. (2019).Cette vidéo montre comment préparer et utiliser une plaque microfluidique pour l’imagerie des cellules bactériennes dans des conditions de stress. Il décrit le processus d’introduction d’une culture bactérienne et d’un milieu antibiotique induisant un stress, suivi d’une charge cellulaire et d’une configuration microscopique. L’imagerie time-lapse en mode contraste de...

Analyse microscopique de la croissance bactérienne sous stress à l’aide de chambres microfluidiques

Source : Guo, S., et al. Quantification de la motilité d’essaimage de surface bactérienne sur des plaques de gradient d’inducteur. J. Vis. Exp. (2022).Cette vidéo montre l’utilisation d’une plaque d’essaim à gradient à double couche pour étudier le comportement de l’essaimage bactérien sous différentes concentrations d’inhibiteurs. Une plaque avec un inhibiteur formant un gradient dans la couche inférieure est inoculée avec des bactéries et incubée. Des images sont capturées à intervalles...

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ScanLag est une méthode à haut débit pour mesurer le retard de croissance, à savoir le temps de latence, ainsi que le taux de croissance des colonies pour des milliers de cellules en parallèle. Le dépistage à l’aide de ScanLag permet de distinguer les temps de latence longs et les croissances lentes au niveau d’un seul variant.

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