Assemblage dirigé des protéines elastin-like en structures supramoléculaires définies et encapsulation de fret in Vitro

L’assemblage efficace de structures supramoléculaires pour la conception minimale des cellules et l’administration de médicaments reste difficile. Ici, nous démontrons des protocoles efficaces qui produisent des structures supramoléculaires basées sur des protéines amphiphiliques comme l’élastine. Les protocoles d’assemblage présentés génèrent des structures supramoléculaires polyvalentes aux propriétés physicochimiques adaptables, telles que vésicules, fibres et coacervates.

Les compartiments à base de membrane protéique démontrent le comportement de séparation de phase et permettent l’encapsulation de molécules fluorescentes de cargaison chimiquement diverses. Pour l’expression de F20E20-mEGFP et F20E20-mCherry, inoculer la culture d’expression principale de la pré-culture du jour au lendemain à un OD600 de 0,3. Incubez-le en 400 millilitres de LB stérile moyen complété par des antibiotiques appropriés à 37 degrés Celsius et 200 rpm.

Lorsque la culture d’expression atteint OD600 de 0,5 à 0,8, ajouter iPTG à une concentration finale d’un millimolaire, et réduire la température d’incubation à 20 degrés Celsius. Pour l’expression du PEL amphiphilique avec l’acide aminé contre nature, inoculer la culture d’expression principale de la pré-culture d’E.coli du jour au lendemain contenant les plasmides appropriés à un OD de 0,3. Incubez-le en 400 millilitres de LB stérile moyen complété par la kanamycine et le chloramphéniphénol à 37 degrés Celsius et 200 rpm.

Pour préparer le stock anormal d’acides aminés non naturels de 100 millimaux, ajoutez 206,2 milligrammes d’acide aminé contre nature à huit millilitres d’eau ultrapure. Augmenter le pH de la solution avec de l’hydroxyde de sodium trois molaire, et mélanger vigoureusement. Lorsque l’acide aminé contre nature est dissous, abaissez le pH à environ 10,5 et ajoutez de l’eau ultrapure à un volume de 10 millilitres.

Filtrez la solution avec un filtre stérile de 0,22 micromètre et aliquot dans des tubes de réaction de deux millilitres. Lorsque la culture d’expression atteint OD600 de 0,5 à 0,8, ajouter l’acide aminé contre nature à une concentration finale de deux millimolaires. Incubez-le pendant 10 minutes de plus.

Puis induire l’expression de la protéine cible et la synthétase tRNA nécessaire par l’ajout simultané d’IPTG et d’arabinose. Réduisez la température d’incubation à 20 degrés Celsius et laissez l’expression se poursuivre pendant environ 20 heures. Après l’incubation, récolter les cellules par centrifugation à quatre degrés Celsius et 4000 fois g pendant 40 minutes.

Resuspendez la pastille cellulaire dans le tampon de lyse avec le lysozyme et le PMSF. Incuber la solution pendant 30 minutes sur la glace. Congelez-le et décongelez-le deux fois en vantant dans de l’azote liquide.

Sonicate la suspension, et effacer le lysate par centrifugation à 10.000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 40 minutes. Puis purifier la protéine à l’aide de la chromatographie par affinité. Après l’élitution des protéines, conservez-la à quatre degrés Celsius jusqu’à nouvel usage.

Ajouter un microlitre de colorant fluorescent à 500 microlitres de solution ELP, et incuber la réaction pendant environ 10 heures à 15 degrés Celsius tout en secouant dans un ThermoMixer, en s’assurant de le protéger de la lumière. Pour éliminer les colorants fluorescents excessifs, équilibrer une membrane de dialyse dans de l’eau ultrapure pendant 10 minutes. Couper la membrane dans la bonne taille pour être placée sur le dessus de l’ouverture du tube de réaction avec la solution elp cliquée.

Ensuite, fixez la membrane à l’ouverture en fermant le tube avec un couvercle qui n’a pas de noyau. Remplissez l’espace entre le couvercle et la membrane avec un tampon pour éviter le piégeage de l’air. Placez ensuite le tube de réaction dans le tampon choisi, poussez-le sous la surface et tournez-le à l’envers.

Effectuez une dialyse pendant au moins trois heures à quatre degrés Celsius, ce qui permet à la dialyse de se poursuivre pendant au moins trois heures de plus après chaque changement de tampon. Pour l’enflure de THF, dialyz la solution homogène d’ELP contre le phosphate ou le tampon de Tris avec le pH stable 7.5. Préparer le lyophilisateur et le refroidir à la température de départ pour le séchage au congélateur.

Aliquot la solution protéique dialysée dans des tubes de réaction de 1,5 millilitre, et sceller avec des bouchons avec un petit trou pour éviter de perdre l’échantillon solide en raison de changements de pression au cours du gel-séchage. Congeler les échantillons dans de l’azote liquide. Sortez les échantillons de protéines congelées de l’azote liquide et placez-les immédiatement dans le lyophilisateur pour commencer à geler.

Une fois l’échantillon complètement sec, ventilez-le avec de l’azote sec et fermez immédiatement les couvercles du tube de réaction pour éviter tout contact avec l’humidité de l’air. Ajouter du THF pur aux échantillons lyophilisés et placer la solution dans un sonicateur de bain d’eau avec de l’eau glacée pendant 15 minutes. Préchauffer un thermocycleur à 30 à 60 degrés Celsius pour la formation de vésicules ou jusqu’à 90 degrés Celsius pour la formation de fibres, et préparer de nouveaux tubes de réaction avec de l’eau ultrapure ou tampon.

Après la sonication, placez la solution ELP/THF et l’eau préparée ou tampon dans le thermocycleur pendant cinq minutes. Ensuite, stratifier la solution PEL sur le dessus de l’eau ou tampon, en s’assurant que la séparation des deux phases et une interphase distincte est visible, et de placer le mélange de retour dans le thermocycleur. Laissez refroidir l’échantillon à température ambiante pendant 10 minutes et passez à la dialyse contre l’eau ou le tampon ou par microscopie par fluorescence.

Préparez une solution elp d’un à 50 micromolaires et ajoutez 10 à 20%1-butanol. Mélangez immédiatement la solution en pipetting de haut en bas. La turbidité de la solution devrait augmenter pendant le mélange, indiquant la formation de vésicules.

Pour obtenir une distribution de taille étroite, extruder les vésicules avec un mini extrudeuse à travers une membrane avec une taille poreuse d’un micromètre. Pour l’encapsulation des colorants, mélangez environ 40 microlitres de solution ELP en Tris-HCl de 10 millimolaires avec un microlitre de la solution de stock Dextran Texas Red dans DMSO. Ajouter 10 microlitres de 1 butanol et les extruder de cinq à dix fois à travers une seringue munie d’une aiguille de 0,25 x 25 millimètres.

La méthode de gonflement THF est composée de trois étapes successives et entraîne différents assemblages supramoléculaires du PEL selon la température. Les images de microscopie d’épifluorescence montrent des vésicules assemblées à partir de BDP-R20F20 et de structures fibrillaires assemblées à partir de BDP-R40F20. La méthode d’extrusion 1-butanol mène exclusivement à la formation des vésicules d’ELP.

Environ deux ordres de grandeur plus vésicules sont produites par rapport à la méthode de gonflement THF. BDP-R40F20 a été mélangé avec 10 à 15%butanol, et les vésicules ont été préparées par extrusion du mélange. Différentes structures supramoléculaires ont été assemblées à partir de BDP-R40F20 par l’intermédiaire du protocole de gonflement de THF.

Le pH du tampon et la température du processus d’assemblage ont été ajustés pour former des coacervates, des fibrilles ou des vésicules. De petites erreurs dans le protocole d’assemblage peuvent conduire à la formation d’agrégats. Des colorants chargés positivement ATTO Rho 13 et le polysaccharide dextran rouge 3000 ont été encapsulés dans le lumen des vésicules assemblées à partir de F20R20-mEGFP par l’intermédiaire de la méthode d’extrusion 1-butanol.

Les images de microscopie confoccale montrent les vésicules dans le canal vert, la cargaison dans le canal rouge, et l’encapsulation réussie dans le canal fusionné résultant. Le comportement de séparation de phase et de fusion des amphiphiles d’ELP lors du mélange des blocs de construction de PMBC simples par rapport aux populations rassemblées de PMBC a également été démontré. Le mélange avant l’assemblage du PMBC conduit à des molécules réparties de manière homogène dans la membrane PMBC assemblée, tandis que le mélange des populations de vésicules assemblées conduit à des plaques membranaires de fluorescence rouge ou verte visibles pendant au moins 20 minutes.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de prêter attention à l’ordre d’étape correcte et pour les différences entre la méthode de gonflement THF et la méthode d’extrusion butanol. Suivant ce protocole, les vésicules du PEL peuvent être utilisées comme navettes d’administration de médicaments, comme plate-forme pour les réactions enzymatiques, telles que la transcription et la traduction in vitro, ou dans la formation de cellules synthétiques minimales.