Name: Un tableau de gouttelettes femtoliter pour la synthèse massive de protéines parallèles à partir de molécules d’ADN unique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Découvrez la synthèse de protéines sans cellule dans des gouttelettes femtoliter uniformes pour mesurer rapidement l'activité enzymatique. Cette méthode élimine les étapes complexes d'expression et de purification protéique.

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Ces travaux ont été soutenus par le numéro de subvention JSPS KAKENHI JP18K14260 et le budget de l’Agence japonaise pour les sciences et la technologie de la Terre marine. Nous remercions Shigeru Deguchi (JAMSTEC) et Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) d’avoir fourni les installations de caractérisation. Nous remercions Ken Takai (JAMSTEC) pour le support logiciel commercial. La microfabrication a été réalisée à Takeda Sentanchi Supercleanroom, l’Université de Tokyo, soutenue par le « Nanotechnology Platform Program » du Ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie (MEXT), Japon, Grant Number JPMXP09F19UT0087.

<ol><li>Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplets+for+ultrasmall-volume+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Droplets for ultrasmall-volume analysis.</a> Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).</li>
<li>Squires, T. M., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics%3A+fluid+physics+at+the+nanoliter+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Modern+Physics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale.</a> Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).</li>
<li>Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics+for+high-throughput+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics for high-throughput biological assays.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).</li>
<li>Zhu, P. A., Wang, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+and+active+droplet+generation+with+microfluidics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Passive and active droplet generation with microfluidics: a review.</a> Lab on a Chip. 17 (1), 34-75 (2017).</li>
<li>Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturising+the+laboratory+in+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Miniaturising the laboratory in emulsion droplets.</a> Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).</li>
<li>Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+tubes+to+drops%3A+droplet-based+microfluidics+for+ultrahigh-throughput+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 46 (11), 114004(2013).</li>
<li>Zhang, Y., Jiang, X. Microfluidic tools for DNA analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+Y+%22DNA+Nanotechnology%22">DNA Nanotechnology</a>. Fan, C. , Springer. Heidelberg. 113-153 (2013).</li>
<li>Dubuc, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+microcompartmentalised+transcription-translation+for+the+prototyping+of+synthetic+communication+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks.</a> Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).</li>
<li>Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+approaches+in+synthetic+biology+utilizing+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics.</a> Genes. 9 (3), (2018).</li>
<li>Lee, K. H., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+cell-free+protein+synthesis+in+synthetic+biology%3A+Interfacing+bio-machinery+with+synthetic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments.</a> Biotechnology Journal. 8 (11), 1292-1300 (2013).</li>
<li>Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+artificial+life%3A+techniques+for+bottom-up+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology.</a> Micromachines. 10 (5), (2019).</li>
<li>Bowman, E. K., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdroplet-assisted+screening+of+biomolecule+production+for+metabolic+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications.</a> Trends in Biotechnology. , (2019).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+high-throughput+screening+based+on+digital+protein+synthesis+in+a+massively+parallel+femtoliter+droplet+array%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array.</a> Science Advances. 5 (8), 8185(2019).</li>
<li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+an+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. , (2019).</li>
<li>Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+high-performance+perfluorinated+polymer+electret+and+its+application+to+micro+power+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (10), 104011(2008).</li>
<li>Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-molecule+enzymatic+assay+in+a+directly+accessible+femtoliter+droplet+array%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array.</a> Lab on a Chip. 10 (24), 3355-3362 (2010).</li>
<li>Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrayed+lipid+bilayer+chambers+allow+single-molecule+analysis+of+membrane+transporter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity.</a> Nature Communications. 5, 4519(2014).</li>
<li>Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+surface+plasmon+waveguides+and+devices+in+Cytop+with+integrated+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vacuum+Science+%26+Technology+B%22%5BJournal%5D)">Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels.</a> Journal of Vacuum Science & Technology B. 28 (4), 729-735 (2010).</li>
<li>Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensing+using+straight+long-range+surface+plasmon+waveguides%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides.</a> Optics Express. 21 (1), 698-709 (2013).</li>
<li>Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+invisible+visible%3A+a+microfluidic+chip+using+a+low+refractive+index+polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer.</a> Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).</li>
<li>Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+voltage+electrowetting+using+thin+fluoroploymer+films%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 303 (2), 517-524 (2006).</li>
<li>Lin, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+voltage+electrowetting-on-dielectric+platform+using+multi-layer+insulators%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B-Chemical%22%5BJournal%5D)">Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators.</a> Sensors and Actuators B-Chemical. 150 (1), 465-470 (2010).</li>
<li>Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfluidic+system+for+long-term+perfusion+culture+and+on-line+monitoring+of+intestinal+tissue+models%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models.</a> Lab on a Chip. 8 (5), 741-746 (2008).</li>
<li>Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoropolymer-coated+PDMS+microfluidic+devices+for+application+in+organic+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry-a+European+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis.</a> Chemistry-a European Journal. 24 (46), 12078-12083 (2018).</li>
<li>de Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wetting%3A+statics+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Modern+Physics%22%5BJournal%5D)">Wetting: statics and dynamics.</a> Reviews of Modern Physics. 57 (3), 827-863 (1985).</li>
<li>Holtze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+surfactants+for+water-in-fluorocarbon+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions.</a> Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).</li>
<li>Wagner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+fluorinated+polyglycerols+for+droplet+microfluidics+as+an+alternative+to+PEG-based+copolymer+surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants.</a> Lab on a Chip. 16 (1), 65-69 (2016).</li>
<li>Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics%3A+a+tool+for+biology%2C+chemistry+and+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).</li>
<li>Mazutis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+microfluidic+systems+for+high-throughput+single+DNA+molecule+isothermal+amplification+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis.</a> Analytical Chemistry. 81 (12), 4813-4821 (2009).</li>
<li>Galinis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+nanoparticles+for+improved+protein+synthesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie-International+Edition%22%5BJournal%5D)">DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 55 (9), 3120-3123 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+bioassays%3A+theory%2C+applications%2C+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Digital bioassays: theory, applications, and perspectives.</a> Analytical Chemistry. 89 (1), 92-101 (2017).</li>
<li>Mazutis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+and+sorting+using+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics.</a> Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).</li>
<li>Courtois, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+device+for+monitoring+time-dependent+in+vitro+expression+from+single+genes+in+picolitre+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets.</a> ChemBioChem. 9 (3), 439-446 (2008).</li>
<li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactants+in+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).</li>
<li>Agresti, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4004-4009 (2010).</li>
<li>Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+completely+in+vitro+ultrahigh-throughput+droplet-based+microfluidic+screening+system+for+protein+engineering+and+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution.</a> Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).</li>
<li>Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding%3A+tracking+mobile+micro-reactors+for+high-throughput+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).</li>
<li>Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li>
<li>Mukhopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+PDMS+isn%27t+the+best%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">When PDMS isn't the best.</a> Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).</li>
<li>Bradshaw, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+sequence+of+Escherichia+coli+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (6), 3473-3477 (1981).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C. Volume measurements in confocal microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMantilla%2C+CB+%22Techniques+in+Confocal+Microscopy%22">Techniques in Confocal Microscopy</a>. Conn, P. M. , Academic Press. Oxford, UK. 143-162 (2010).</li>
<li>Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+counting+of+biomolecules+with+femtoliter+dropret+chamber+array%5BTitle%5D)+AND+%22The+17th+International+Conference+on+Solid-State+Sensors%2C+Actuators+and+Microsystems+%28TRANSDUCERS+%26+EUROSENSORS+XXVII%22%5BJournal%5D)">Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array.</a> The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. , 630-632 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-localization+for+fast+analysis+of+arrayed+microfluidic+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays.</a> Analytical Methods. 4 (10), 3466-3470 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+dimensional+barcode-inspired+automatic+analysis+for+arrayed+microfluidic+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays.</a> Biomicrofluidics. 7 (3), 034110(2013).</li>
<li>Gonzalez, R. C., Woods, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGonzalez%2C+RC+%22Digital+image+processing%22">Digital image processing</a>. , Pearson. New York, NY. (2018).</li>
<li>Cohen, L., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+arrays+for+protein+and+nucleic+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 345-363 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La mesure hautement quantitative basée sur les gouttelettes hautement uniformes, stables et biocompatibles de FemDA a permis la distribution discrète, la caractéristique unique de notre étude différant des autres. Nous avons systématiquement optimisé et détaillé les processus de microfabrication et de formation de gouttelettes dans cet article. Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole établi.
Tout d’abord, le revêtement uniforme du polymère CYTOP très visqueux sur le substrat rectan...

Les chercheurs utilisent des réacteurs pour effectuer des réactions bio/chimiques. Des efforts importants ont été déployés pour réduire la taille du réacteur et augmenter le débit expérimental afin de réduire la consommation de réactifs tout en améliorant l’efficacité du travail. Ces deux aspects visent à libérer les chercheurs d’une lourde charge de travail, en réduisant les coûts et en accélérant la recherche et le développement. Nous disposons d’une feuille de route historique claire sur le développement des technologies des réacteurs du point de vue des volumes de réaction et du débit : béchers/flacons/tubes à essai simples, tubes millilitres, tubes microlitres, microlitres 8 tubes, microlitres 96/384/1536-puits, et nanolitre microfluidique/picoliter/femtoliter réacteurs1,2,3,4,5,6,7. Analogue à la réduction de la taille des caractéristiques des transistors sur les puces de circuits intégrés dans l’industrie des semi-conducteurs au cours des dernières décennies, les microréacteurs bio/chimiques sont en cours de réduction du volume et d’intégration du système. Ces outils à petite échelle ont eu un impact profond sur la biologie synthétique à base de cellules ou sans cellules, la biomaufacturing, et le prototypage et le dépistage à haut débit8,9,10,11,12. Cet article décrit nos efforts récents sur le développement d’une technologie unique de tableau de gouttelettes et démontre son application dans CFPS13, une technologie fondamentale pour la biologie synthétique et les communautés de dépistage moléculaire14. En particulier, nous fournissons intentionnellement un protocole optimisé et peu coûteux pour rendre le dispositif FemDA accessible à tous. Le protocole à faible coût et facile à manipuler pour l’appareil miniaturisé contribuerait aux objectifs éducatifs des universités et aiderait à diffuser la technologie.
FemDA prépare des gouttelettes de femtoliter à une densité ultra-élevée de 106 par 1 cm2 sur un substrat en verre planaire. Nous avons enduit un polymère hydrophobe, CYTOP15, sur le substrat de verre et gravé sélectivement (enlevé) CYTOP à des positions prédéfinies pour générer un tableau de microchambre sur le substrat. Ainsi, la microchambre qui en résulte est composée d’une paroi hydrophobe (CYTOP) et d’un fond hydrophile (verre). Lorsque l’eau et l’huile coulent séquentiellement sur la surface à motifs, l’eau peut être emprisonnée et scellée dans les microchambres. La structure hydrophile-in-hydrophobe est essentielle pour repousser l’eau à l’extérieur des microchambres, isoler les microréacteurs individuels et conserver une minuscule solution aqueuse à l’intérieur de l’espace femtoliter. La propriété unique a été appliquée avec succès pour la préparation de gouttelettes d’eau dans l’huile et de microcompartements bicalaires lipidiques16,17. Par rapport au prototype16, nous avons d’abord optimisé le processus de microfabrication pour réaliser une élimination complète du polymère CYTOP ainsi qu’une exposition complète du fond de verre. CYTOP est un fluoropolymère spécial dont la tension de surface est extrêmement faible (19 mN/m) inférieure à celle des matériaux microréacteurs conventionnels tels que le verre, les plastiques et le silicone. Ses bonnes performances optiques, électriques et chimiques ont déjà été utilisées dans le traitement de surface des dispositifs microfluidiques18,19,20,21,22,23,24. Dans le système FemDA, pour obtenir un bon mouillage de l’huile sur la surface du CYTOP, la tension de surface de l’huile doit être inférieure à celle de la surface solide25. Sinon, l’huile liquide en contact avec la surface solide tend à devenir sphérique plutôt que de se répandre sur la surface. En outre, nous avons constaté que certaines huiles populaires de perfluorocarbone (par exemple, 3M FC-40)16 et les huiles hydrofluoroéther (par exemple, 3M série Novec) peuvent dissoudre CYTOP à la suite de la morphologie amorphe de CYTOP, qui est fatale à la mesure quantitative et serait discutable en termes de contamination croisée entre les gouttelettes. Heureusement, nous avons identifié une huile biocompatible et respectueuse de l’environnement présentant une tension de surface inférieure (< 19 mN/m)13. Nous avons également trouvé un nouveau surfactant qui peut se dissoudre dans l’huile sélectionnée et fonctionner dans une faible concentration (0,1%, au moins 10 fois plus faible que précédemment rapporté populaires26,27)13. L’interface eau/huile qui en résulte peut être stabilisée par le surfactant. En raison du taux d’évaporation élevé de l’huile, après la chasse d’eau avec l’huile, nous avons appliqué une autre huile biocompatible et respectueuse de l’environnement pour remplacer la première pour sceller les microchambres. Nous appelons la première huile (ASASHIKLIN AE-3000 avec 0,1 wt % SURFLON S-386) l’huile de chasse d’eau et la deuxième huile (Fomblin Y25) l’huile d’étanchéité, respectivement.
La stratégie d’étanchéité à l’huile en deux étapes peut réaliser une formation robuste du tableau de gouttelettes femtoliter en quelques minutes et sans instrumentation sophistiquée. En raison du problème d’évaporation, il a été considéré comme difficile de générer des microréacteurs plus petits que les volumes de picolteur28. FemDA a abordé ce problème en optimisant systématiquement les matériaux et les procédés utilisés pour la préparation des microréacteurs/gouttelettes. Plusieurs caractéristiques notables des gouttelettes résultantes incluent l’uniformité élevée (ou monodispersité), la stabilité, et la biocompatibilité à l’échelle femtoliter. Le coefficient de variation (CV) du volume des gouttelettes n’est que de 3% (sans correction de vignette pour les images microscopiques), le plus petit CV parmi les plates-formes de gouttelettes dans le monde, ce qui assure une mesure très parallèle et quantitative. La gouttelette de femtoliter est stable pendant au moins 24 heures sans contamination croisée entre les gouttelettes à température ambiante, ce qui est précieux pour une mesure fiable du cours du temps. En ce qui concerne la biocompatibilité, nous avons réussi à synthétiser diverses protéines à partir d’un modèle d’ADN à copie unique dans la gouttelette femtoliter, qui avait été précédemment considéré comme difficile ou inefficace29,30. Il serait digne d’élucider pourquoi certaines protéines capables d’être synthétisées dans le FemDA ne peuvent pas être synthétisées dans d’autres systèmes de gouttelettes. FemDA n’était pas seulement un progrès technique, mais a également réalisé une mesure quantitative sans précédent qui peut corréler le rendement des protéines (tel que reflété par l’intensité de fluorescence de la gouttelette) au nombre de molécules d’ADN de modèle dans chaque gouttelette. En conséquence, l’histogramme de l’intensité de fluorescence des gouttelettes du CFPS à base de FemDA a montré une distribution discrète qui peut être bien ajustée par une somme de distributions gaussiennes d’intervalles de pointe à pic égaux. En outre, la probabilité d’occurrence de gouttelettes contenant différents nombres de molécules d’ADN était un ajustement parfait à une distribution poisson31. Ainsi, le rendement protéique différent dans chaque gouttelette peut être normalisé en fonction de la distribution discrète. Cette caractéristique critique nous permet de séparer l’information d’activité enzymatique de l’intensité apparente, qui n’a pas encore été disponible avec d’autres plates-formes de microréacteurs. Les systèmes de tri des cellules/gouttelettes microfluidiques existants sont habiles dans le tri entièrement automatique et bons pour concentrer des échantillons, mais parfois ne peuvent produire qu’un histogramme relativement large ou à longue queue dans l’aspect analytique32,33. Notre système FemDA hautement quantitatif et biocompatible établit une nouvelle référence et une norme analytique élevée dans le domaine du développement des microréacteurs.
Les huiles et les surfactants qui pourraient être utilisés pour la préparation des gouttelettes sont encore très limitées34. La combinaison d’ASASHIKLIN AE-3000 et DE SURFLON S-386 établie à FemDA est un nouveau membre de l’arsenal croissant de l’interface physiochimique entre la phase aqueuse et la phase13de l’huile. La nouvelle interface de FemDA est physiquement stable, chimiquement inerte et biologiquement compatible avec les machines complexes de transcription, de traduction et de modification post-translationnelle pour de nombreuses sortes de protéines13. Il serait plutôt intéressant de trouver une protéine qui ne peut pas être synthétisée dans les paramètres de gouttelettes à la place. En outre, l’économie de coûts des réactifs est plus évidente dans le système de gouttelettes femtoliter que celle dans les systèmes de réacteurs nanolitres et picoliter35,36. En particulier, il y aurait souvent un grand volume mort, qui est principalement causé par des tubes ou des fournitures externes, dans les systèmes de génération de gouttelettes microfluidiques, mais pas dans notre FemDA. Le format de tableau est également favorisé par une caractérisation microscopique répétée et détaillée (similaire à ce qu’on appelle l’analyse à haute teneur) pour chaque réacteur37, plutôt que par un seul instantané pour un objet en mouvement rapide. L’échelle femtoliter a permis l’intégration de plus d’un million de réacteurs sur une zone de la taille d’un doigt, alors que le même nombre de réacteurs nanolitres (s’il existe) nécessite une superficie de plus de mètres carrés, ce qui ne serait sans aucun doute pas pratique pour fabriquer ou utiliser un tel système.

<table><tbody><tr><td>(3-aminopropyl)triéthoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>1 mL seringue</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Kanto Chemical</td><td>EL grade</td><td>EL : pour utilisation électronique.</td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser 3D</td><td>Lasertec</td><td>OPTELICS HYBRID</td><td>D’autres microscopes similaires (par exemple, Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) sont également applicables.</td></tr><tr><td>Seringue de 50 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-50LZ</td><td></td></tr><tr><td>6,8-difluoro-4-méthylumbelliferyl phosphate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D6567</td><td>Préparer une solution mère de 5 mM dans du sulfoxyde de diméthyle</td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Kanto Chemical</td><td>EL grade</td><td>EL : pour utilisation électronique. Pureté 99,8 %.</td></tr><tr><td>Souffleur d’air</td><td>Hozan</td><td>Z-263</td><td></td></tr><tr><td>Bloc d’aluminium</td><td>BIO-BIK</td><td>AB-24M-02</td><td></td></tr><tr><td>Support de microtubes en aluminium</td><td>BIO-BIK</td><td>AB-136C</td><td></td></tr><tr><td>ASAHIKLIN AE-3000</td><td>AGC</td><td>(Échantillon d’essai)</td><td>Un échantillon d’essai gratuit peut être disponible sur demande à AGC.</td></tr><tr><td>BEMCOT PS-2 essuie-glace</td><td>Ozu</td><td>028208</td><td></td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie avec piston</td><td>Kai</td><td>BPP-10F</td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture</td><td>Matsunami Glass</td><td>No. 1 (24 mm & times ; 32 mm, 0,13 ~ 0,17 mm d’épaisseur)</td><td>Taille-personnalisé.</td></tr><tr><td>Support de coloration en verre</td><td>de couverture Nakayama</td><td>803-131-11</td><td></td></tr><tr><td>CRECIA TechnoWipe clean Wiper</td><td>Nippon Paper Crecia</td><td>C100-M</td><td></td></tr><tr><td>Tapis de découpe</td><td>GE Healthcare</td><td>WB100020</td><td></td></tr><tr><td>CYTOP</td><td>AGC</td><td>CTL-816AP</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur de désaération</td><td>Thinky</td><td>AR-100</td><td></td></tr><tr><td>Cutter de bureau</td><td>Roland</td><td>STIKA SV-8</td><td></td></tr><tr><td>Le développeur</td><td>AZ Electronic Materials</td><td>AZ 300 MIF</td><td>AZ Electronic Materials a été acquis par Merck. D’autres révélateurs alcalins peuvent également être applicables mais devraient nécessiter une optimisation des conditions de développement (temps, température, etc.)</td></tr><tr><td>Ruban adhésif double face Kapton film</td><td>tape Teraoka Seisakusho</td><td>7602 #25</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Kanto Chemical</td><td>EL grade</td><td>EL : pour utilisation électronique. Pureté 99.5 %.</td></tr><tr><td>Version Fidji</td><td></td><td></td><td>: ImageJ 1.51n</td></tr><tr><td>Coupe-câble plat</td><td>Tokyo-IDEAL</td><td>MT-0100</td><td></td></tr><tr><td>Huile de fomblin</td><td>Solvay</td><td>Y25, ou Y25/6</td><td>Un échantillon de test gratuit peut être disponible sur demande auprès de Solvay. Fomblin Y25/6 est une alternative si Y25 n’est pas facilement disponible.</td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>AS ONE</td><td>TH-900</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille d’injection</td><td>Terumo</td><td>NN-2270C</td><td>22G &times ; 70 mm</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence inversée</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td>Spécification d’épifluorescence, caméra CCD ou sCMOS, platine motorisée, système de mise au point automatique et objectif à grande ouverture numérique sont nécessaires.</td></tr><tr><td>KaleidaGraph</td><td>Synergy</td><td></td><td>Version : 4.5</td></tr><tr><td>Aligneur de masque</td><td>SUSS</td><td>MA-6</td><td>D’autres aligneurs de masque sont également applicables tant que le mode de contact sous vide est disponible.</td></tr><tr><td>Pipette MICROMAN</td><td>GILSON</td><td>E M250E</td><td>Pointe de piston capillaire : CP250</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td> Version <td>Microsoft</td><td></td><td>: 16.16.15</td></tr><tr><td>Mini chambre à vide</td><td>AS ONE</td><td>MVP-100MV</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-90101</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Tube PCR</td><td>NIPPON Genetics</td><td>FG-021D/SP</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>AS ONE</td><td>GD90-15</td><td>Diamètre 90 mm, hauteur 15 mm.</td></tr><tr><td>Photoresist</td><td>AZ Electronic Materials</td><td>AZ P4903</td><td>AZ Electronic Materials a été rachetée par Merck. AZ P4620 est une alternative.</td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>BioTek</td><td>POWERSCAN HT</td><td></td></tr><tr><td>Gants en polyéthylène</td><td>AS ONE</td><td>6-896-02</td><td>Nom commercial : Saniment.</td></tr><tr><td>Kit de synthèse de protéines in vitro PURExpress</td><td>New England Biolabs</td><td>E6800S ou E6800L</td><td>Pour une réaction de synthèse de protéines acellulaire.</td></tr><tr><td>Système de gravure par ions réactifs</td><td>Samco</td><td>RIE-10NR</td><td>D’autres systèmes RIE sont également applicables, mais doivent nécessiter une optimisation des conditions RIE (débit de gaz, pression de la chambre, puissance RF, temps de gravure, etc.)</td></tr><tr><td>Inhibiteur de la RNase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>Scotch tape</td><td>3M</td><td>810-1-18D</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hydroxyde de sodium</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>194-09575</td><td>8 M concentration ; danger.</td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Oshigane</td><td>SC-308</td><td></td></tr><tr><td>SURFLON S-386 tensioactif</td><td>AGC</td> <td>(Échantillon d’essai)Un</td> <td>échantillon d’essai gratuit peut être disponible sur demande auprès d’AGC.</td></tr><tr><td>Élastomère de silicone SYLGARD 184</td><td>Dow</td><td>Sylgard184</td><td>Composition chimique : polydiméthylsiloxane. Le rapport de mélange par défaut est base : agent de durcissement = 10 : 1 (m/m).</td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>Ideal-tek</td><td>2WF. SA.1 2A</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur à ultrasons</td><td>AS ONE</td><td>ASU-2M</td><td></td></tr><tr><td>Mandrin</td><td>d’aspirateur Oshigane</td> <td>(personnalisé)</td><td>Matériel : delrin ; étage d’échantillon rectangulaire avec plusieurs trous (48 trous, chacun de 1 mm de diamètre) ; la taille est personnalisée pour s’adapter à la taille du verre de couverture (24 mm & fois ; 32 mm).</td></tr></tbody></table>

un tableau de gouttelettes femtoliter pour la synthèse massive de protéines parallèles à partir de molécules d’adn unique

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

Les progrès réalisés dans la résolution spatiale et la sensibilité à la détection de l’instrumentation scientifique permettent d’appliquer de petits réacteurs pour la recherche biologique et chimique. Pour répondre à la demande de microréacteurs haute performance, nous avons mis au point un dispositif femtoliter droplet array (FemDA) et illustré son application dans des réactions massivement parallèles de synthèse de protéines sans cellules (CFPS). Plus d’un million de gouttelettes uniformes ont été facilement générées dans une zone de la taille d’un doigt à l’aide d’un protocole d’étanchéité à l’huile en deux étapes. Chaque gouttelette était ancrée dans une microchamber femtoliter composée d’un fond hydrophile et d’un paroi latérale hydrophobe. La structure hydrophile-in-hydrophobe hybride et les huiles d’étanchéité et les surfactants dédiés sont essentiels pour conserver de façon stable la solution aqueuse femtoliter dans l’espace femtoliter sans perte d’évaporation. La configuration femtoliter et la structure simple du dispositif FemDA ont permis une consommation minimale de réactifs. La dimension uniforme des réacteurs à gouttelettes a rendu les mesures quantitatives et temporelles à grande échelle convaincantes et fiables. La technologie FemDA a corrélé le rendement protéique de la réaction du SCFP avec le nombre de molécules d’ADN dans chaque gouttelette. Nous avons rationalisé les procédures concernant la microfabrication de l’appareil, la formation des gouttelettes de femtoliter, et l’acquisition et l’analyse des données d’image microscopiques. Le protocole détaillé avec le faible coût de fonctionnement optimisé rend la technologie FemDA accessible à tous ceux qui ont des installations de nettoyage standard et un microscope à fluorescence classique à leur place.

Le processus de microfabrication consiste en le nettoyage du substrat, la fonctionnalisation de surface, le revêtement CYTOP, la photolithographie, la gravure sèche, le décapage photorésiste et le nettoyage final. Fait important, le protocole présenté a permis l’enlèvement complet du polymère cytop hydrophobe à l’intérieur des microchambres Figure 3A),produisant une structure hydrophile-in-hydrophobe très parallèle sur un substrat en verre de couverture standard. À l’aide du protocole d’étan...

L’objectif global du protocole est de préparer plus d’un million de gouttelettes de femtoliter commandées, uniformes, stables et biocompatibles sur un substrat planaire de 1 cm2 qui peut être utilisé pour la synthèse des protéines sans cellules.

Un tableau de gouttelettes femtoliter pour la synthèse massive de protéines parallèles à partir de molécules d’ADN unique

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Plus d’un million d’uniformes des gouttelettes sont produits sur le substrat de la taille d’un doigt. Et des molécules d’ADN unique sont distribuées au hasard dans chaque gouttelette. Le rendement protéique est proportionnel au nombre de molécules dans une gouttelette.Notre technique peut être utilisée pour une mesure rapide et quantitative de l’activité enzymatique sans expression et purification compliquées des protéines. Pour commencer, placez un verre de couverture sur une grille de coloration et placez la grille dans huit hydroxyde de sodium molaire. Sonicate le verre de couverture et la grille de coloration pendant 15 minutes à température ambiante.Retirer la grille de coloration de l’hydroxyde de sodium et rincer le verre de couverture avec de l’eau 10 fois. Séchez le verre de couverture avec un pistolet à air comprimé. Cuire ensuite et sécher le verre de couverture sur une plaque chaude à 200 degrés Celsius pendant cinq minutes.Préparez une solution 0,05% aminosilane. Plongez le verre de couverture dans cette solution et incubez-le pendant une heure à température ambiante. Rincer le verre de couverture cinq fois à l’eau pure.Ensuite, séchez le verre de couverture à l’aide d’un pistolet à air comprimé. Cuire sur l’assiette chaude à 80 degrés Celsius pendant cinq minutes. Placez le substrat en verre de couverture sur un mandrin sous vide personnalisé pour le revêtement de spin.Distribuez de 70 à 90 microlitres de polymère CYTOP de type A au centre du substrat de verre. Puis faire tourner immédiatement le polymère. Le revêtement polymère initial endommage la qualité du tableau final des microchambres.Distribuez le polymère au centre du verre de couverture sans introduire de bulles d’air. Ramasser le verre enduit en le tenant dans les coins et le placer sur une feuille d’aluminium. Cuire au four pendant 30 minutes à 80 degrés Celsius, puis pendant une autre heure à 200 degrés Celsius.Distribuez 0,2 à 0,3 millilitres de photorésistant au centre du substrat. Enduire immédiatement le photorésistant à 6000 rpm pendant 60 secondes. Utilisez un lingette imbibé d’éthanol pour enlever l’excès de photorésistant des bords du substrat.Cuire le substrat à 110 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pour réhydrater le photorésiste, laissez le substrat reposer pendant 30 minutes à une humidité relative de 42 à 60% Chargez le substrat dans le gouttière du masque et exposez-le pendant 25 secondes en mode contact sous vide. Puis immerger le substrat dans le développeur pendant cinq minutes pour dissoudre le photorésiste exposé.Rincer le substrat 10 fois à l’aide d’eau pure. Ensuite, séchez le substrat à fond à l’aide du pistolet à air comprimé. Placez le substrat dans la chambre de réaction de la machine à graver réactif-ion et gravez le cytop couvert photorésist avec le plasma d’oxygène.Après la gravure, retirer le reste du photorésist en sonnant le substrat en acétone pendant cinq minutes à température ambiante. Puis sonicate le substrat en propanol pendant cinq minutes. Rincer, sonifier et rincer à nouveau le substrat à l’aide d’eau pure décrite dans le manuscrit.Ensuite, séchez le substrat avec un pistolet à air comprimé. À l’aide d’un coupeur de bureau, coupez du ruban adhésif Kapton à double enduit dans les formes microcanal définies. Collez les morceaux de ruban adhésif coupés au fond d’une boîte de Pétri plate pour servir de maître pour le moulage du PDMS.Verser le mélange PDMS dans la boîte de Pétri à motifs de bande. Ensuite, placez la boîte de Pétri dans une mini chambre à vide et désaérer le mélange PDMS pendant une à trois heures. Ensuite, placez la boîte de Pétri dans un four à 60 degrés Celsius et laissez-la toute la nuit pour guérir le PDMS.Une fois que le PDMS a guéri, peler l’élastomer durci de la boîte de Petri et utiliser un coupeur à câble plat pour découper les blocs de microcanal PDMS. Perforez ensuite un trou à chaque extrémité de chaque microcanal. Le substrat précédemment préparé aura une zone pour le tableau de microchambre.Placez le microcanal PDMS sur cette partie du substrat. Puis insérez une pointe de pipet de 200 microlitres dans l’un des trous du microcanal PDMS. Tout d’abord, préparez la solution de réaction CFPS dans un tube PCR.Ensuite, à l’aide d’une pointe de tuyaut non filtrant de 200 microlitres, dessinez 10 microlitres de la solution. Insérez la pointe pipet dans le trou d’entrée du microcanal PDMS et poussez vers le bas sur le piston pipet jusqu’à ce que la solution déborde de la sortie de microcanal. Transférez l’appareil FemDA dans un bloc d’aluminium pré-réfrigéré.Confirmez que la zone du réseau de microchambres passe rapidement de translucide à transparente. Dessiner 300 microlitres d’huile à chasse d’eau pré-réfrigérée et transférer immédiatement l’huile dans la pointe pipet du trou d’entrée de microcanal. L’huile de chasse d’eau se déplace dans la microcanal et extrudes la solution de réaction excédentaire située à l’extérieur des microchambres.Retirez simultanément les deux pointes insérées de pipet de l’appareil. Déplacez immédiatement l’appareil du bloc d’aluminium au film de paraffine. Insérez la pointe de pipet préparée contenant l’huile d’étanchéité dans l’entrée du microcanal PDMS et injectez l’huile jusqu’à ce qu’elle déborde de la sortie.Les gouttelettes de femtoliter sont scellées dans des microchambres individuelles par l’huile. Ouvrez l’image BF déconcentrée. Pour supprimer les arrière-plans continus lisses de chaque image, sélectionnez Soustraire l’arrière-plan du menu Processus.Entrez 20 pour le rayon de balle roulante. Cochez la case Aperçu et sélectionnez Ok. Sélectionnez Oui lorsqu’on vous demande s’il y a à traiter toutes les images.Ensuite, pour réduire le bruit, sélectionnez Processus, Filtres, Médiane. Entrez 2,0 pour le rayon en pixels. Cochez la case Aperçu et sélectionnez Ok.Sélectionnez Oui lorsqu’on vous demande s’il y a à traiter toutes les images. Ensuite, sélectionnez Image, Ajuster, Seuil pour séparer les images des microchambres de l’arrière-plan de l’image. Dans le menu Plugins, sélectionnez FemDA, FemDA Analysis.Entrez le nombre minimum et maximum approximatif de pixels d’une seule microchambre. La circularité minimale et maximale attendue des microchambres et les numéros d’image de début et d’extrémité, puis sélectionnez Générer un retour sur investissement pour détecter les microchambres. Les IA détectés avec succès sont affichés dans le menu popup ROITable.Dans la fenêtre d’analyse FemDA, sélectionnez Appliquer le masque ROI. Examinez l’image pour voir si les microchambres ont été correctement détectées. Ouvrez l’image de fluorescence et amenez-la à l’avant.Cliquez à nouveau sur Appliquer le masque ROI pour ajouter les ROM à l’image de fluorescence. Dans la fenêtre d’analyse FemDA, sélectionnez One-Shot pour analyser les données du point final de l’image. Entrez N pour le nombre de pixels haut de gamme pour utiliser les pixels haut de gamme de chaque retour sur investissement pour calculer l’intensité moyenne de la gouttelette correspondante.Cliquez ensuite sur Mesurer l’intensité pour calculer les intensités moyennes de toutes les gouttelettes détectées. Le ROITable est mis à jour avec les nouvelles données de l’image de fluorescence et l’histogramme est affiché dans une nouvelle fenêtre. Exportez les données en cliquant sur le bouton Enregistrer sous forme de texte.La solution fluorescente a été encapsulée dans les microchambres de FemDA et l’intensité de fluorescence, qui est corrélée avec la taille de gouttelette a été mesurée utilisant la microscopie. On a constaté que les gouttelettes avaient une répartition de taille étroite. L’image 3D reconstruite de la microscopie confoccale a également montré la taille cohérente de gouttelette au fil du temps.Les gouttelettes sont restées stables à température ambiante sans perte d’évaporation ni contamination croisée chez les gouttelettes pendant au moins 24 heures. La protéine fluorescente mNeonGreen a été synthétisée dans FemDA. Et les données d’image de pile ont été analysées à l’aide de l’image simultanée déconcentré champ lumineux.Puisque l’intensité de fluorescence de chaque gouttelette est mesurée de son rendement protéique, l’histogramme suggère fortement un nombre inégal de molécules d’ADN par gouttelette. La probabilité que des gouttelettes contiennent différents nombres de molécules d’ADN correspondait parfaitement à une distribution de Poisson. La synthèse de l’enzyme phosphatase alcaline a également été effectuée dans FemDA avec des images capturées toutes les cinq minutes.La réaction a montré une distribution discrète semblable de l’intensité de fluorescence des gouttelettes à un moment plus tôt et les résultats d’histogramme ont vérifié que le nombre inégal des molécules d’ADN dans les gouttelettes. Une molécule d’ADN unique encapsulée dans des gouttelettes individuelles peut être encore récupérée, amplifiée et séquencée, ce qui rend possible le dépistage des protéines les plus élevées. Une technique de gouttelette comportant soit un petit volume et soit une stabilité élevée permet un diagnostic moléculaire rapide et précis des maladies cancéreuses avec des biomarqueurs spécifiques.

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L’étude décrit un protocole pour créer de grandes quantités (μg-mg) d’ADN pour des campagnes de dépistage de protéines à partir de fragments de gènes synthétiques sans clonage ni utilisation de cellules vivantes. Le gabarit minimal est digéré et circularisé de manière enzymatique, puis amplifié à l’aide d’une amplification de cercle roulant isotherme. Des réactions d’expression sans cellules pourraient être effectuées avec le produit non purifié.

Méthodes enzymatiques rapides pour l’amplification de modèles linéaires minimaux pour le prototypage de protéines à l’aide de systèmes sans cellules

Découvrez la synthèse de protéines sans cellule dans des gouttelettes femtoliter uniformes pour mesurer rapidement l'activité enzymatique. Cette méthode élimine les étapes complexes d'expression et de purification protéique.

Un tableau de gouttelettes femtoliter pour la synthèse massive de protéines parallèles à partir de molécules d’ADN unique

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