Approche stéréotaxique angulaire adaptable pour des techniques de neuroscience polyvalentes

Ce protocole est important car il s’agit d’une procédure stéréotaxique adaptable qui peut être utilisée chez les souris et les rats, et peut être appliquée à de nombreuses nouvelles techniques neuroscientifiques. Le principal avantage de cette procédure stéréotaxique adaptable est sa capacité à être utilisée pour cibler des régions difficiles et difficiles à atteindre du cerveau. La démonstration de la procédure sera assurée par Chelsea Faber, une jeune et talentueuse chercheuse postdoctorale du laboratoire.

Après avoir vérifié que le cadre et le micromanipulateur ont été calibrés, placez la jauge de hauteur centrale dans la douille de la plaque de base du support de tête. Fixez la lunette de centrage dans le porte-outil et visez la lunette. Ajustez la position du micromanipulateur jusqu’à ce que le réticule soit aligné et focalisé sur le réticule de la jauge, et placez les barres d’oreille dans les supports de manière à ce que les lignes indicatrices des deux côtés soient à zéro.

Utilisez les boutons médial-latéral et antéro-postérieur du support de tête pour tracer l’axe des barres d’oreille dans les plans X et Y au-dessus du réticule de la jauge de hauteur centrale. Pour aligner la position de la barre d’oreille dans l’axe Z, retirez les barres d’oreille du support et retirez la jauge de hauteur centrale. Ensuite, replacez les barres d’oreille et recentrez les barres à zéro.

Ensuite, regardez à nouveau vers le bas et utilisez respectivement les boutons de décalage vertical et d’inclinaison coronale pour abaisser et faire pivoter les barres d’oreille jusqu’à ce que le réticule de la lunette reste centré entre les barres d’oreille tout au long de la rotation coronale. Pour aligner l’axe de rotation central pour les coordonnées angulaires, fixez la lunette de centrage dans le porte-outil et positionnez le micromanipulateur sur les coordonnées calculées. Notez que la coordonnée droite/gauche pour l’implantation angulaire correspond à la longueur du côté A.En regardant vers le bas de la lunette, marquez cette coordonnée pour représenter le point auquel la canule entrera dans le cerveau, une fois la tête tournée.

Repositionnez le micromanipulateur sur la ligne médiane et utilisez le bouton d’inclinaison coronale pour faire pivoter la tête à l’angle calculé. Si le réticule de la lunette ne s’aligne pas avec le repère de référence, utilisez le bouton de décalage vertical pour ajuster la position de la tête dans l’axe Z jusqu’à ce que le réticule s’aligne le plus près possible du repère. À ce stade, le point de rotation arbitraire doit être aligné avec le centre de rotation de la stéréotaxe.

Tournez la tête vers l’arrière jusqu’à la position coronale de zéro degré avant de passer aux étapes suivantes de forage et de micro-injection. Après avoir effectué la micro-injection, remettez la tête à la position de niveau zéro degré et utilisez une perceuse à main pour placer deux trous, à l’avant, et deux trous, à l’arrière, suffisamment loin des trous de fraise de coordination inclinés pour accueillir la partie virole de la fibre optique qui se trouve au-dessus du crâne. Lorsque tous les trous ont été percés, utilisez un petit tournevis à tête plate pour insérer les vis à os aussi doucement que possible, de sorte qu’elles reposent fermement dans le crâne sans pénétrer dans le cerveau.

Fixez une canule à fibre optique dans le porte-canule et placez le porte-canule dans le porte-outil. Tournez la tête à l’angle calculé, en notant que les coordonnées du micromanipulateur ne s’appliquent pas au nouvel outil. Utilisez le centre des trous de fraise inclinés comme cible d’implantation.

Abaissez la fibre optique jusqu’à ce qu’elle touche juste la dure-mère au centre du trou de bavure et mettez à zéro le micromanipulateur dans l’axe Z. Abaissez lentement la fibre optique jusqu’à la coordonnée angulaire ventrale dorsale, puis utilisez du gel cyanoacrylate pour connecter la virole de fibre optique aux vis d’ancrage ipsilatérales. Utilisez une pointe de micropipette pour appliquer un accélérateur.

Une fois que le gel a complètement durci, desserrez doucement et soulevez le porte-canule jusqu’à ce qu’il soit dégagé de la virole. Implantez la deuxième fibre optique à la coordonnée angulaire controlatérale, puis nivelez la tête. Pour plus de sécurité, utilisez le gel cyanoacrylate et l’accélérateur pour établir une connexion supplémentaire entre les deux canules à fibre optique inclinées, et appliquez une petite quantité relativement mince de ciment dentaire à la surface du crâne, en prenant soin de bien couvrir les vis d’ancrage et la base des canules à fibre optique.

Afin d’interroger le rôle des neurones du noyau ventromédian de l’hypothalamus dans le contrôle de la glycémie, dans cette analyse représentative, une approche stéréotaxique standard, non angulaire, a été utilisée pour la micro-injection bilatérale d’un canal inhibiteur du virus de la rhodopsine dans le noyau ventromédial. Étant donné la proximité du noyau ventromédian avec la ligne médiane, les contraintes d’espace ne permettaient pas une implantation non angulaire de fibres optiques bilatérales, ce qui a nécessité le développement d’une stratégie chirurgicale permettant d’implanter précisément des fibres optiques à un angle. Les choses les plus importantes à retenir sont simplement d’être patient et de prendre votre temps, car il est essentiel d’être cohérent et précis dans vos affectations de coordonnées.

Cette procédure peut être adaptée et appliquée à toute méthode neuroscientifique nécessitant une micro-injection ou une implantation dans le cerveau des rongeurs, y compris les approches de chimiogénétique, d’optogénétique et de photométrie de fibres.