Configuration de la spectrométrie de masse plasmatique capillaire couplée à l’électrophorèse (CE-ICP-MS) pour la quantification des espèces de redox de fer (Fe(II), Fe(III))
4 mai 2020
Cette méthode de spéciation de redox de fer est basée sur la spectrométrie de masse plasmatique capillaire couplée à l’électrophorèse-inductivement couplée avec l’empilage d’échantillon combiné avec l’analyse courte dans une course. La méthode analyse rapidement et fournit de faibles limites de quantification pour les espèces de redox de fer à travers une gamme variée de tissus et d’échantillons de biofluides.
Le fer excessif a comme conséquence le fer redox-actif libre deux-plus qui peut causer des effets dévastateurs dans la cellule, tels que le stress oxydant et les décès cellulaires par peroxydation de lipide connue sous le nom de ferroptose. Les mesures quantitatives du fer ferreux et du fer ferrique sont la clé d’un aperçu plus étroit de ces processus nuisibles. Cette technique CE-ICP-Ms fournit à la fois : une analyse rapide et de faibles limites de quantification, qui sont toutes deux nécessaires à la quantification des espèces de redox de fer.
Commencez par choisir un nébuliseur avec un faible volume d’auto-aspiration et de préparer les pièces appropriées pour monter l’interface maison. Connectez deux connecteurs luer femelles à trois voies avec un connecteur cone luer mâle en connectant l’extrémité gauche de la barre luer à trois voies inférieure au connecteur masculin et au connecteur masculin à la connexion moyenne du luer à trois voies supérieur. Ensuite, placez un tube d’un centimètre sur le fil de platine et utilisez un tube en silicone d’un centimètre pour connecter le premier tube et la buse d’un connecteur luer mâle.
Fixez l’assemblage à la connexion moyenne du connecteur luer à trois sens inférieur par rotation de vis. Poussez un tube d’un centimètre au-dessus de la sortie du capillaire CE et placez-le à huit à neuf centimètres de l’extrémité, puis connectez-le à la buse du connecteur luer mâle avec un tube en silicone. Placez l’ensemble de l’assemblage à travers la barre du connecteur t à trois voies supérieur et fixez le connecteur luer mâle et l’extrémité gauche du connecteur luer à trois voies femelle par rotation de vis.
Fixez ensuite le tube en silicone de 25 centimètres à la buse d’un connecteur luer mâle et fixez tout l’assemblage au bas de la barre à partir du connecteur de leurre à trois sens inférieur. Poussez fermement le tube de silicone d’un centimètre, cinq millimètres au-dessus de l’extrémité du nébuliseur. Tandis que le deuxième connecteur mâle de cône de luer est branché dans la partie saillante du tube.
Déplacez la partie d’interface avec le capillaire CE saillant vers le cône mâle au nébuliseur, puis insérez soigneusement le capillaire à travers le cône mâle et la partie plus large du capillaire nébuliseur. Si nécessaire, ajustez la longueur du capillaire saillant en dévissant le luer mâle gauche, en déplaçant le luer avec des tubes attachés dans la position requise et en le réinstallant. Les connecteurs luer à trois voies femelles supérieures devraient s’adapter étroitement au cône mâle.
Une fois terminé avec la configuration procéder avec ICP-Ms. Des courbes d’étalonnage ont été créées pour le fer trois et le fer deux espèces de redox. Les limites de détection étaient de 3,1 microgrammes par litre pour le fer deux et 3,2 microgrammes par litre pour le fer trois et la linéarité a été démontrée jusqu’à 150 microgrammes par litre.
L’analyse du lysate cellulaire SH-SY5Y a montré une migration légèrement plus lente pour les espèces de redox de fer en raison de la conductivité un peu plus élevée. Les concentrations mesurées de fer trois et de fer deux étaient de 330 microgrammes par litre et de 84 microgrammes par litre, respectivement. Résultant en un rapport fer deux à trois de 0,25.
L’étape la plus importante de ce protocole est l’insertion soigneuse du capillaire CE saillant à travers l’interface montée et son positionnement approprié lié au capillaire nébuliseur. Les méthodes présentées ici peuvent devenir un outil prometteur pour approfondir la perspicacité dans les processus moléculaires dépendants du fer. Des études soigneusement conçues sont nécessaires pour valider si la quantification du fer deux fois plus et trois de fer peut servir de biomarqueur potentiel pour identifier les tissus à risque de dommages mortels médiés par le fer dans le contexte des maladies neurodégénératives et cancéreuses.
Aperçu
Cette étude présente une nouvelle méthode de spéciation redox du fer utilisant l'électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse avec plasma induit (CE-ICP-MS). Cette technique permet une analyse rapide et des limites de quantification faibles pour les espèces redox du fer dans divers tissus et fluides biologiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biochimie
- Chimie analytique
Contexte
- Un excès de fer peut entraîner un stress oxydatif et la mort cellulaire.
- La mesure quantitative du fer ferreux et ferrique est essentielle pour comprendre ces processus.
- La ferroptose est une forme de mort cellulaire associée à un surcharge en fer.
- Les méthodes existantes peuvent ne pas offrir la rapidité et la sensibilité nécessaires pour la quantification du fer.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode rapide et sensible pour quantifier les espèces redox du fer.
- Étudier les implications de la quantification du fer dans les maladies neurodégénératives et le cancer.
- Valider le potentiel de la quantification du fer comme biomarqueur de dommages tissulaires.
Méthodes utilisées
- Électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse avec plasma induit (CE-ICP-MS).
- Préparation de l'échantillon impliquant un montage d'interface maison.
- Courbes de calibration pour les espèces redox du fer deux et du fer trois.
- Analyse du lysat de cellules SH-SY5Y pour la mesure de la concentration en fer.
Résultats principaux
- Les limites de détection étaient de 3,1 µg/L pour le fer deux et de 3,2 µg/L pour le fer trois.
- Une réponse linéaire a été observée jusqu'à 150 µg/L.
- Les concentrations mesurées étaient de 330 µg/L pour le fer trois et de 84 µg/L pour le fer deux.
- Le rapport du fer deux sur le fer trois s'est révélé être de 0,25.
Conclusions
- La méthode développée est prometteuse pour l'étude des processus moléculaires dépendants du fer.
- Une mise en place soigneuse est cruciale pour des mesures précises.
- Des études supplémentaires sont nécessaires pour explorer le rôle de la quantification du fer dans les contextes pathologiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La quantification précise des espèces redox du fer (Fe(II)/Fe(III)) est essentielle pour comprendre les lésions cellulaires médiées par le fer dans les contextes neurodégénératifs et oncologiques. La méthode CE-ICP-MS permet une détection rapide et sensible de ces espèces dans des matrices biologiques complexes, facilitant ainsi l'identification précoce des mécanismes à risque pour les hypothèses thérapeutiques impliquant le stress oxydatif et les voies de ferroptose. Cette capacité améliore la validation des cibles en fournissant des biomarqueurs quantitatifs spécifiques au statut redox, utiles au tri des projets dans les programmes en phase de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'interroger l'homéostasie redox du fer comme hypothèse thérapeutique dans les modèles de maladies.
- Valeur opérationnelle : Fournit des lectures quantitatives spécifiques au statut redox afin de clarifier les voies mécanistiques de la mort cellulaire induite par le fer.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans les cibles guidées par des biomarqueurs en corrélant les rapports Fe(II)/Fe(III) avec le stress oxydatif et les issues de la ferroptose.
Développement de tests et criblage
- Prêt-à-l’emploi du test : Offre de faibles limites de détection (3,1–3,2 µg/L) et une réponse linéaire jusqu’à 150 µg/L, permettant une quantification fiable dans les lysats dilués et les biofluides.
- Reproductibilité : Présente une précision du temps de migration inférieure à 3 % et une précision de mesure de 2,2 à 3,5 %, garantissant des résultats cohérents lors du criblage de composés.
- Extensibilité : La focalisation par conductivité-pH permet des volumes d’injection plus élevés sans compromettre la séparation, améliorant ainsi le débit pour la validation des tests.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet la mesure des espèces redox du fer dans les lysats de SH-SY5Y et dans le LCR, reliant ainsi la découverte à des systèmes pertinents pour la maladie.
- Décisions ajustées au risque : La précision de récupération (97–105 %) et la confirmation par ajout standard soutiennent une quantification fiable des biomarqueurs pour des critères d'acceptation ou de rejet.
- Réduction du risque mécanistique : Facilite l'évaluation des stratégies de modulation du fer en fournissant des lectures directes des espèces Fe(II) et Fe(III) dans les modèles précliniques.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode CE-ICP-MS s'intègre aux flux de travail de la phase précoce de découverte en fournissant des données quantitatives spécifiques aux états redox, qui éclairent les étapes de validation de la cible et d'identification des candidats, en particulier pour les voies impliquant un stress oxydatif dépendant du fer.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses sur la dysrégulation du fer dans les modèles de maladies neurodégénératives et de cancer grâce à une quantification résolue par espèce.
- Écrantage : Permet la standardisation des tests grâce à une faible limite de quantification (LOQ) et une haute précision, facilitant l'évaluation fiable des effets des composés sur les états redox du fer.
- Analytique : Génère des résultats quantitatifs basés sur les aires des pics ainsi que des métriques de temps de migration, permettant la comparaison entre différentes conditions et l'analyse de tendances.
- Recherche translationnelle : S'associe à la validation préclinique par le biais de mesures d'espèces de fer dans des lysats cellulaires et des biofluides, soutenant l'harmonisation des biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Une détection indépendante de la plateforme par spectrométrie de masse avec source plasma à couplage inductif (ICP-MS) permet une réutilisation pour de multiples cibles élémentaires au-delà du fer, augmentant ainsi l'utilité à long terme.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en distinguant les contributions du Fe(II) et du Fe(III) au stress oxydatif et à la ferroptose.
- Valeur opérationnelle : Assure la reproductibilité grâce à la séparation améliorée par empilement et à la réduction des interférences en mode DRC.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en fournissant des biomarqueurs redox quantitatifs associés aux états pathologiques du fer.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des composés en fonction de leur impact sur la spéciation du fer dans des modèles pertinents pour la maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la mise en place de l'électrophorèse capillaire et l'optimisation de la spectrométrie de masse avec source plasma à couplage inductif (ICP-MS), particulièrement en mode DRC avec le gaz réactif NH3.
- Dépend d'un assemblage d'interface stable entre le capillaire d'électrophorèse capillaire et le nébuliseur afin de préserver l'intégrité du signal et d'éviter les décalages redox.
- Implique une standardisation entre les équipes pour les paramètres d'électrolyte de fond (HCl 20 mM) et de tension (+25 kV) afin d'assurer la reproductibilité.
- Requiert une adaptation pour les échantillons à conductivité variable (par exemple, le LCR) en utilisant l'ajout de standard pour confirmer l'identification des pics.
- Limite pratique : la sensibilité de la méthode aux effets de matrice de l'échantillon impose une dilution ou une standardisation pour une quantification précise dans les biofluides complexes.
