Isolement et caractérisation d’exosomes à partir de fibroblastes musculaires squelettiques
16 mai 2020
Ce protocole illustre 1) l’isolement et la culture de fibroblastes primaires à partir du muscle gastrocnémien de souris adulte ainsi que 2) la purification et la caractérisation des exosomes à l’aide d’une méthode d’ultracentrifugation différentielle combinée à des gradients de densité de saccharose suivis d’analyses par western blot.
L’avantage d’utiliser la centrifugation différentielle pour ce protocole est qu’elle est facilement évolutive jusqu’au litre et donc idéale pour isoler les exosomes des fibroblastes primaires. Les exosomes purifiés peuvent être obtenus à partir de différents types de cellules et de tissus isolés à partir de divers modèles de maladies. Les exosomes peuvent être utilisés comme biomarqueurs diagnostiques.
Diantha van de Vlekkert, une scientifique du laboratoire d’Azzo, démontrera cette procédure pour commencer, pesez les muscles de la souris, puis transférez-les dans une boîte de 10 centimètres. En travaillant sous une cagoule de biosécurité, hachez les muscles avec des scalpels pour produire une pâte fine. Transférez la pâte musculaire finement hachée dans un tube de 50 millilitres et ajoutez la solution de digestion en utilisant 3,5 fois le volume par milligramme de tissu.
Incuber pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius. Pour aider à la dissociation complète, mélangez soigneusement la suspension avec une pipette de 5 millilitres toutes les 10 minutes. Pour inactiver la solution de digestion, ajoutez 20 millilitres de DMEM Complete à la suspension cellulaire.
Pipetez à travers une passoire en nylon de 70 micromètres placée sur un tube de 50 millilitres, puis lavez la crépine cellulaire avec 5 millilitres supplémentaires de DMEM Complete. Centrifugez la suspension cellulaire à 300 g pendant 10 minutes à température ambiante. Retirez délicatement le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de DMEM Complete.
Ensemencez les cellules dans une boîte de 10 centimètres, puis placez la boîte dans l’incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et 3 % d’oxygène. Les cultures de fibroblastes du muscle squelettique doivent être maintenues à un faible niveau d’oxygène pour assurer des conditions de lumière physiologiques. Le niveau d’oxygène dans le muscle squelettique est d’environ 2,5 %Une fois que les cellules ont atteint 100 % de confluence, cultivez-les pendant un jour supplémentaire, puis rincez-les avec du PBS et ajoutez un millilitre de solution de trypsinisation.
Après avoir incubé les cellules pendant 10 minutes, arrêtez la trypsinisation en ajoutant 10 millilitres de DMEM Complete. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres, puis centrifugez les cellules à 300 g pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans 20 millilitres de DMEM complet et ensemencez les cellules dans un plat de 15 centimètres.
Prélever le milieu conditionné à partir des fibroblastes cultivés dans un tube de 15 millilitres. Centrifugez le milieu conditionné à 300 g pendant 10 minutes pour granuler les cellules vivantes. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de 50 millilitres et granulez les cellules mortes en centrifugeant le tube à 2 000 g pendant 10 minutes.
Ensuite, transférez le surnageant dans un tube en polypropylène de 38,5 millilitres et centrifugez le tube à 10 000 g pendant 30 minutes pour éliminer les organites, les corps apoptotiques et les fragments de membrane. Pour granuler les exosomes, transférez le surnageant dans un tube ultraclair de 38,5 millilitres et ultracentrifugez-le à 100 000 g pendant 1,5 heure. Jetez soigneusement le surnageant, en laissant environ un millilitre de milieu conditionné.
Lavez la pastille d’exosome et remettez-la en suspension dans jusqu’à 30 millilitres de PBS glacé. Centrifugez à nouveau les exosomes à 100 000 g pendant 1,5 heure. Pour compléter la purification, prélever le surnageant par pipetage, en prenant soin de ne pas déranger la pastille exosomale.
L’étape de la pastille d’exosome peut être lâche et facilement détachée. Par conséquent, l’élimination du surnageant PBS doit être effectuée très soigneusement à l’aide d’une pipette de 200 microlitres. Remettez le granulé en suspension dans du PBS glacé en utilisant 25 microlitres par boîte de 15 centimètres de fibroblastes.
Enfin, mesurez la concentration en protéines à l’aide du kit de dosage des protéines BCA et d’un lecteur de microplaques à 562 nanomètres. Ce protocole est une méthode hautement reproductible et cohérente pour purifier les exosomes. La microscopie électronique à transmission montre les tailles relativement uniformes de ces exosomes.
L’immunotransfert des lysats d’exosomes montre un modèle canonique d’expression des protéines et l’absence de contaminants protéiques de la LDH et de la calnexine. Les exosomes ont été séparés par un gradient de densité de saccharose, et les fractions individuelles ont été sondées sur un western blot avec des anticorps contre Alix, CD9 et CD81. Les exosomes se sédimentent systématiquement en fractions trois à six.
Les exosomes bioactifs isolés et concentrés peuvent être utilisés pour des analyses de microscopie électronique et de spectrométrie de masse, ainsi que pour des expériences d’absorption in vitro et in vivo pour des études fonctionnelles. Ce protocole est adapté à l’isolement d’exosomes à partir de cellules à faible sécrétion et peut être appliqué pour explorer l’implication des exosomes dans les maladies fibrotiques humaines.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Ce protocole illustre l'isolement et la culture de fibroblastes primaires à partir du muscle gastrocnémien de souris adulte, ainsi que la purification et la caractérisation d'exosomes à l'aide d'une méthode d'ultracentrifugation différentielle combinée à des gradients de densité de saccharose, suivie d'analyses par immunotransfert (western blot). La possibilité d'isoler des exosomes à partir de fibroblastes primaires confère à cette méthode une importance particulière pour l'étude de leur potentiel en tant que biomarqueurs diagnostiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Biologie cellulaire
- Recherche sur les exosomes
- Maladies fibrosantes
Contexte
- L'isolement de fibroblastes primaires permet d'obtenir des informations sur les mécanismes cellulaires.
- Les exosomes jouent un rôle essentiel dans la communication cellulaire et peuvent servir de biomarqueurs de maladies.
- La technique permet une isolation d'exosomes à grande échelle à partir de divers tissus.
Méthodes utilisées
- Ultracentrifugation différentielle pour la purification des exosomes
- Muscle gastrocnémien de souris comme système biologique
- Analyses par immunotransfert pour la caractérisation
Résultats principaux
- Exosomes isolés et caractérisés avec succès à partir de fibroblastes.
- Observation d'un schéma constant de sédimentation des exosomes à travers des gradients de saccharose.
- Mise en évidence de l'absence de contaminants protéiques dans les exosomes purifiés.
Conclusions
- Cette étude établit une méthode reproductible pour isoler les exosomes, ce qui pourrait contribuer à la compréhension des maladies fibrosantes.
- Les résultats mettent en évidence les applications thérapeutiques potentielles des exosomes en diagnostic.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans le secteur industriel
L'isolement d'exosomes à partir de fibroblastes primaires du muscle squelettique permet une production extensible de vésicules extracellulaires pour la découverte de biomarqueurs et des études fonctionnelles dans les modèles de maladies fibrotiques. Le protocole permet une purification reproductible à l'aide de centrifugations différentielles et de gradients de densité au saccharose, facilitant des applications en aval telles que la spectrométrie de masse et la microscopie électronique. Cette approche améliore la validation des cibles en fournissant une source constante d'exosomes bioactifs pour la réduction des risques mécanistiques en recherche préclinique.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse du contenu des exosomes dérivés des fibroblastes afin de préciser les mécanismes de signalisation paracrine dans l'homéostasie tissulaire et la fibrose.
- Valeur opérationnelle : Fournit une méthode reproductible pour isoler les exosomes à partir de cellules primaires, assurant un approvisionnement régulier pour l'analyse des voies cibles.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Les exosomes purifiés fournissent des profils quantitatifs en protéines et en lipides adaptés à la normalisation des dosages et au développement de panels de biomarqueurs.
- Valeur opérationnelle : La méthode permet le traitement de grands volumes, ce qui permet le criblage à haut débit des cargaisons associées aux exosomes dans différentes conditions expérimentales.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Les exosomes isolés à partir de fibroblastes associés à des maladies soutiennent l'alignement translationnel des biomarqueurs et la validation fonctionnelle préclinique.
- Valeur opérationnelle : L'adaptabilité du protocole à divers tissus et fluides facilite la continuité intermodèles dans les études de dé-risque de cibles.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la biologie précoce de la cible à la validation préclinique, en particulier pour les études impliquant la communication entre cellules stromales et la signalisation médiée par des vésicules extracellulaires.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses sur le rôle des exosomes des fibroblastes dans la progression de la fibrose et la signalisation intercellulaire.
- Écrantage : Permet la préparation normalisée d'échantillons d'exosomes en vue d'une analyse comparative de la composition des cargaisons dans différentes conditions.
- Analytique : Génère des échantillons prêts à être analysés par immunobuvardage, microscopie électronique et spectrométrie de masse, pour une caractérisation multi-omique.
- Recherche translationnelle : Relie l'isolement des exosomes des fibroblastes à des modèles précliniques de maladies fibrotiques grâce à une production reproductible et échelonnée de vésicules.
- Réutilisation en milieu professionnel : Ce protocole, adaptable à différents types cellulaires et tissus, s'impose comme une plateforme réutilisable pour des programmes de biomarqueurs fondés sur les exosomes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant la variabilité de la pureté et du rendement des exosomes.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à des étapes standardisées de centrifugation et de purification par gradient.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'aller/arrêt en fournissant des candidats biomarqueurs fiables issus de sources cellulaires mécaniquement pertinentes.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des pistes diagnostiques ou thérapeutiques fondées sur les exosomes, en se basant sur des données fonctionnelles cohérentes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules primaires, en ultracentrifugation et en techniques de western blot.
- Dépend de l'accès à un équipement d'ultracentrifugation et à des capacités de préparation de gradients de saccharose.
- Exige une standardisation entre les équipes pour une évaluation cohérente du rendement et de la pureté des exosomes.
- L'adaptation à des modèles de tissus humains ou malades peut nécessiter une optimisation des conditions de digestion et de culture.
- Les limitations pratiques incluent la possibilité de co-isoler des agrégats protéiques si les étapes du gradient ne sont pas soigneusement exécutées.
