Name: Isolement et caractérisation d’exosomes à partir de fibroblastes musculaires squelettiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Découvrez l'isolation d'exosomes à partir de fibroblastes musculaires squelettiques de souris par ultracentrifugation différentielle. Cette méthode reproductible permet d'obtenir des biomarqueurs diagnostiques pour l'étude des maladies fibrotiques.

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Alessandra d’Azzo est titulaire de la chaire de génétique et de thérapie génique de Jewelers for Children (JFC). Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du NIH R01GM104981, RO1DK095169 et CA021764, la Fondation Assise de Memphis et l’American Lebanese Syrian Associated Charities.

Toutes les procédures chez la souris ont été effectuées selon des protocoles sur les animaux approuvés par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’hôpital de recherche pour enfants St. Jude et les directives des National Institutes of Health.
1. Préparation des solutions et des milieux
<ol><li>Préparer la solution de digestion en mélangeant 15,4 mL de PBS avec 2,5 mL de collagénase P à 20 mg/mL (concentration finale de 5 mg/mL), 2 mL de dispase II à 11 U/mL (concentration finale de 1,2 U/mL) et 100 μL de CaCl2 à 1,0 M (concentration finale de 5 mM).</li>
	<li>Préparer 500 mL de milieu de fibroblastes primaires (DMEM complet) en mélangeant 440 mL de DMEM avec 50 mL de FBS (10 %), 5,0 mL de stylo/streptocoque (100 U/mL et 100 μg/mL, respectivement) et 5,0 mL de supplément de glutamine (2 mM). Filtrez et stérilisez le milieu à l’aide d’un filtre à vide de 0,22 μm.</li>
	<li>Préparer le sérum exempt d’exosomes par ultracentrifugation de FBS pendant la nuit dans des tubes en polypropylène de 38,5 mL à 100 000 x g à 4 °C et transférer le surnageant dans un nouveau tube.</li>
	<li>Préparez 500 mL de milieu exempt d’exosomes en mélangeant 440 mL de DMEM avec 50 mL de sérum sans exosomes (10 %), 5 mL de stylo/streptocoque (100 U/mL et 100 μg/mL) et 5 mL de supplément de glutamine (2 mM). Filtrez et stérilisez le milieu à l’aide d’un filtre à vide de 0,22 μm.</li>
	<li>Préparer 0,5 M de Tris-HCl (pH 7,4) en dissolvant 6,057 g de base de Tris dans 90 mL de dH 2 O et en ajustant le pH à 7,4 avec HCl. Régler le volume à 100 mL avec dH2O.</li>
	<li>Préparer une solution de 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4)/1 mM de Mg(Ac)2 (solution de travail du saccharose) en mélangeant 97,9 mL de dH 2 Oavec 2 mL de Tris-HCl 0,5 M (pH = 7,4) et 100 μL de 1 M Mg(Ac)2. Ajoutez des inhibiteurs de protéase à la solution juste avant l’utilisation et conservez la solution sur de la glace.</li>
	<li>Préparer des solutions de gradient de densité de saccharose sur de la glace conformément au tableau 1. Ces solutions sont suffisantes pour préparer deux tubes de gradient de saccharose.</li>
	<li>Préparez 100 % de TCA en ajoutant 40 mL de dH2O à 100 g de poudre de TCA et mélangez jusqu’à dissolution complète. Réglez le volume final avec dH2O à 100 mL.</li>
	<li>Préparer de l’éthanol à 80 % en mélangeant 20 mL de dH2O avec 80 mL d’éthanol à 100 %.</li>
	<li>Préparer le tampon de Western Blot en mélangeant 1,8 L de dH2O avec 200 mL de tampon de fonctionnement 10x.</li>
	<li>Préparer le tampon de transfert Western Blot en mélangeant 1,4 L de dH2O avec 200 mL de tampon de transfert 10x et 400 mL de méthanol. Prérefroidir le tampon de transfert à 4 °C.</li>
	<li>Préparer 20 fois une solution saline tamponnée Tris (TBS) en dissolvant 122 g de base Tris et 180 g de chlorure de sodium dans 850 mL de dH2O (pH 8,0). Réglez le volume à 1 L avec dH2O.</li>
	<li>Préparer le tampon de blocage en dissolvant 5 g de lait écrémé en poudre avec 1 mL de Tween-20 à 10 %, 5 mL de 20x TBS et 94 mL de dH2O.</li>
	<li>Préparer le tampon d’anticorps en dissolvant 3 g de BSA avec 1 mL de Tween-20 à 10 %, 5 mL de 20x TBS et 94 mL de dH2O.</li>
	<li>Préparer le tampon de lavage en mélangeant 100 mL de 20x TBS et 20 mL de 10% Tween-20 (10x) avec 1,88 L de dH2O.</li>
	<li>Préparer la solution de développement en mélangeant 1 volume de luminol/enhance avec 1 volume de tampon de peroxyde stable.</li>
</ol>2. Dissection du muscle gastrocnémien (GA) de la souris15,16
<ol><li>Préparer des tubes de 50 ml contenant 10 ml de PBS sur glace.</li>
	<li>Euthanasier les souris dans une chambre de CO2 suivie d’une luxation cervicale.</li>
	<li>Retirez le muscle gastrocnémien des deux jambes et transférez-les dans le tube avec PBS sur glace. REMARQUE : Retirez le muscle soléaire du muscle GA avant de transférer le muscle GA au PBS.</li>
</ol>3. Isolement et culture de fibroblastes primaires de souris
<ol><li>Pesez les muscles et transférez-les dans un plat de 10 cm sous une hotte de biosécurité. Hachez les muscles avec des scalpels jusqu’à ce qu’ils deviennent une pâte fine.</li>
	<li>Transférez la pâte musculaire finement hachée dans un tube de 50 mL et ajoutez 3,5 fois le volume/mg de tissu de solution de digestion dans le tube et incubez pendant 45 min à 37 °C. Bien mélanger la suspension à l’aide d’une pipette de 5 ml toutes les 10 minutes (cela facilitera la dissociation complète). REMARQUE : Alternativement, un dissociateur tissulaire peut être utilisé pour cette étape.</li>
	<li>Ajouter 20 mL de DMEM complet à la suspension cellulaire pour inactiver la solution de digestion. Transférer dans une crépine en nylon de 70 μm placée sur un tube de 50 ml. Recueillir l’écoulement et laver la crépine cellulaire avec 5 mL supplémentaires de DMEM complet.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g à température ambiante (RT) pendant 10 min et retirer délicatement le surnageant.</li>
	<li>Remettre la pastille en suspension dans 10 mL de DMEM complete et ensemencer les cellules dans une boîte de 10 cm.</li>
	<li>Cultiver les cellules à 37 °C, 5 % CO 2, 3 % O2 (passage 0 ou P0). REMARQUE : 1) Ces cultures doivent être maintenues à un faible niveau d’oxygène pour garantir des conditions physiologiques similaires (le niveau d’O 2 dans le muscle squelettique est d’environ2,5 %)17. 2) Le numéro de passage (p. ex., P0) d’une culture cellulaire est un enregistrement du nombre de fois où la culture a été sous-cultivée. 3) Les fibroblastes primaires à P0 sont systématiquement cultivés jusqu’à 100% de confluence plus 1 jour (et seulement pour P0). Il s’agit de purger d’autres types de cellules et de s’assurer que les cellules présentes dans la culture ne sont que des fibroblastes, appauvris en cellules myogéniques sur la base d’un examen au microscope. Le muscle squelettique d’un animal adulte à l’âge de 2 mois contient environ 2 % de progéniteurs myogéniques4. De plus, les progéniteurs myogéniques ne se fixent généralement pas aux plats non enrobés ; Par conséquent, ils sont perdus lors de la sous-culture18,19,20. Les cellules myogéniques ont besoin d’un milieu différent (F10) complété par 20 % de FBS et de facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF)18. Dans le DMEM complet, les fibroblastes moyens ont un taux de prolifération plus élevé que les cellules myogéniques, ce qui entraîne l’élimination de ces cellules contaminantes avant le premier passage.</li>
	<li>Rincez les cellules P0 avec du PBS lorsqu’elles sont confluentes à 100 % plus 1 jour. Ajouter 1 mL de solution de trypsinisation et incuber à 37 °C, 5 % de CO 2, 3 % d’O2 pour détacher les cellules. Arrêtez l’activité enzymatique en utilisant 10 mL de DMEM complet.</li>
	<li>Centrifuger les alvéoles à 300 x g pendant 10 min à RT et remettre en suspension la pastille dans 20 mL de DMEM complet et semer dans un plat de 15 cm (passage 1 ou P1). Les cellules sont cultivées jusqu’à 80 % à 90 % de confluence et peuvent être étendues jusqu’au passage 3. NOTE : Selon les expériences en aval, le passage 1, le passage 2 (P2) ou le passage 3 (P3) peuvent être utilisés.</li>
</ol>4. Ensemencement des cellules et collecte du milieu conditionné
<ol><li>Laver les fibroblastes (P1, P2 ou P3) avec 10 mL de PBS, ajouter 2,5 mL de solution de trypsinisation aux cellules et incuber à 37 °C, 5 % CO 2, 3 % O2. Arrêtez l’activité enzymatique en utilisant 10 mL de DMEM complet. REMARQUE : Après le passage 4, les cellules primaires sont jetées et ne doivent pas être utilisées pour d’autres expériences, car elles changent de caractéristiques.</li>
	<li>Recueillir les cellules et centrifuger à 300 x g à RT pendant 10 min.</li>
	<li>Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de milieu exempt d’exosomes et compter les cellules.</li>
	<li>Ensemencer les cellules à raison de 1,5–2,0 x 106 cellules par boîte (15 cm) et incuber à 37 °C, 5 % CO 2, 3 % O2.</li>
	<li>Recueillir le milieu conditionné entre 16 et 24 h dans des tubes de 50 ml sur de la glace. REMARQUE : Si les cellules ne sont pas confluentes à 80 %, un milieu libre exosomal frais peut être ajouté à nouveau et recueilli après une période supplémentaire de 16 à 24 h. Les deux collections peuvent être combinées pour un traitement ultérieur.</li>
</ol>5. Purification des exosomes par centrifugation différentielle et ultra-centrifugation
REMARQUE : Toutes les étapes sont effectuées à 4 °C ou sur de la glace. Équilibrez le tube avec un tube rempli d’eau si nécessaire.
<ol><li>Centrifuger le milieu conditionné à 300 x g pendant 10 min pour éliminer les cellules vivantes et transférer le surnageant dans un nouveau tube de 50 mL.</li>
	<li>Éliminer les cellules mortes par centrifugation à 2 000 x g pendant 10 min et transférer le surnageant dans un tube en polypropylène de 38,5 mL.</li>
	<li>Centrifuger le surnageant à 10 000 x g pendant 30 min pour l’élimination des organites, des corps apoptotiques et des fragments de membrane. Transvaser le surnageant dans un tube ultra-transparent de 38,5 ml.</li>
	<li>Ultracentrifuger le surnageant à 100 000 x g pendant 1,5 h pour granuler les exosomes.</li>
	<li>Jetez soigneusement le surnageant, en laissant environ 1 mL de milieu conditionné, et lavez la pastille d’exosome dans un volume total de 30 mL de PBS glacé.</li>
	<li>Centrifuger à 100 000 x g pendant 1,5 h et éliminer soigneusement le surnageant par pipetage, en veillant à ne pas perturber la pastille exosomale.</li>
	<li>Remettre la pastille en suspension dans du PBS glacé (~25 μL par plat de 15 cm) et mesurer la concentration en protéines à l’aide du kit de dosage des protéines BCA et d’un lecteur de microplaques à 562 nm. REMARQUE : La concentration en protéines est mesurée par une dilution 1 :2 avec 0,1% de Triton-X100 dans dH2O. Le rendement des exosomes d’une boîte de 15 cm (20 mL de milieu conditionné) de fibroblastes primaires à 80 % de confluence est de ~3–4 μg.</li>
</ol>6. Caractérisation des exosomes par gradient de densité de saccharose
<ol><li>Charger le gradient de saccharose dans un tube ultra-clair de 13 mL en pipetant (de bas en haut) les éléments suivants : 1,5 mL de 2,0 M, 2,5 mL de 1,3 M, 2,5 mL de 1,16 M, 2,0 mL de 0,8 M et 2,0 mL de solutions de saccharose 0,5 M.</li>
	<li>Mélangez 30 à 100 μg d’exosomes avec une solution de saccharose à 0,25 M et ajustez le volume à 1 mL.</li>
	<li>Chargez soigneusement les exosomes au-dessus des gradients et ultra-centrifugez les échantillons pendant 2,5 h à 100 000 x g et 4 °C.</li>
	<li>Retirez les tubes de l’ultra-centrifugeuse et placez-les sur de la glace et collectez des fractions de 1,0 ml en commençant par le haut du gradient. Transférez-les dans des tubes de 1,7 ml sur de la glace.</li>
	<li>Ajouter 110 μL de TCA à 100 % dans chaque tube, bien mélanger et incuber pendant 10 min à RT.</li>
	<li>Centrifuger pendant 10 min à 10 000 x g et RT et jeter soigneusement le surnageant.</li>
	<li>Remettre le granulé en suspension dans 500 μL d’éthanol 80 % pré-refroidi et laisser les échantillons à laver pendant 10 min à -20 °C.</li>
	<li>Centrifuger pendant 10 min à 10 000 x g et 4 °C et jeter le surnageant.</li>
	<li>Séchez la pastille pendant 10 à 15 minutes à RT et remettez-la en suspension dans du PBS pour des expériences in vitro. Mesurer la concentration en protéines à l’aide d’un kit de dosage des protéines BCA ou remettre la pastille en suspension directement dans 14,5 μL de dH2O, 5 μL de tampon Laemmli 4x et 0,5 μL de DTT 1 M pour les analyses par transfert Western.</li>
</ol>7. Détection d’exosomes par Western blot
<ol><li>Mélanger 5 à 10 μg d’exosomes de l’étape 5.7 avec 5 μL de tampon Laemmli 4x et 0,5 μL de DTT 1 M, puis ajuster le volume final à 20 μL avec dH2O. Chauffer tous les échantillons, y compris ceux de l’étape 6.9, pendant 5 min à 98 °C.</li>
	<li>Chargez les échantillons dans un gel anti-taches TGX à 10 % et chargez les échelles de protéines selon les recommandations du fabricant. REMARQUE : Choisissez le pourcentage du gel en fonction du poids moléculaire de la protéine d’intérêt.</li>
	<li>Faire fonctionner le gel à 100 V pendant ~1 h dans le tampon de fonctionnement jusqu’à ce que le colorant de charge se trouve au fond du gel. REMARQUE : La durée d’exécution peut varier en fonction de l’équipement utilisé ou du type et du pourcentage de gel.</li>
	<li>Imagez le gel. Les images des gels sans taches sont utilisées comme contrôle de la charge pour les immunoblots.</li>
	<li>Transférer le gel à l’aide d’une membrane PVDF pendant 1,5 h à 80 V ou toute la nuit à 30 V à 4 °C.</li>
	<li>Bloquer les membranes dans le tampon de blocage pendant 1 h à RT.</li>
	<li>Incuber les membranes pour des anticorps spécifiques (tableau 2) dans un tampon d’anticorps pendant une nuit à 4 °C avec agitation.</li>
	<li>Laver les membranes dans un tampon de lavage et incuber les membranes avec les anticorps secondaires appropriés (tableau 2) pendant 1 h à RT avec agitation.</li>
	<li>Lavez les membranes dans un tampon de lavage et imagez les membranes à l’aide d’une solution de développement et d’un imageur basé sur une caméra. Vous pouvez également utiliser un film radiographique pour développer les membranes.</li>
</ol>

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</ol>

Aucun des auteurs n’a de conflit d’intérêts à déclarer.

Une étape cruciale pour l’isolement réussi des exosomes des milieux de culture, telle que décrite dans ce protocole, est l’établissement et le maintien appropriés de cultures primaires de fibroblastes de souris à partir du muscle squelettique adulte. Ces cultures doivent être maintenues à un faible niveau d’oxygène pour garantir des conditions physiologiques similaires (le niveau d’O2 dans le muscle squelettique est de ~2,5 %)15. Les fibroblastes primaires changeront de caractéristiques...

Les exosomes sont des vésicules extracellulaires hétérogènes dont la taille varie de 30 à 150 nm. Ils sont des acteurs clés établis dans les processus physiologiques et pathologiques, étant donné leur distribution omniprésente dans les tissus et les organes 1,2. Les exosomes transportent une cargaison complexe de protéines, de lipides, de types d’ADN et de types d’ARN, qui varient selon le type de cellules dont ils sont dérivés 1,2,3. Les exosomes sont enrichis en protéines qui ont des fonctions différentes (c’est-à-dire que les tétraspanines, y compris CD9 et CD63) sont responsables des événements de fusion. Par exemple, les protéines de choc thermique HSP70 et HSP90 sont impliquées dans la liaison et la présentation de l’antigène. De plus, Alix, Tsg101 et la flottilline participent à la biogenèse et à la libération des exosomes et sont largement utilisés comme marqueurs de ces nanovésicules 2,3,4.
Les exosomes contiennent également une variété d’ARN (c’est-à-dire des microARN, de longs ARN non codants, des ARN ribosomiques) qui peuvent être transférés aux cellules réceptrices, où ils influencent la signalisation en aval3. Étant entourés d’une seule unité de membrane, la bioactivité des exosomes dépend non seulement de la cargaison de protéines et d’acides nucléiques, mais aussi des composants lipidiques de la membrane limitante1. Les membranes exosomiques sont enrichies en phosphatidylsérine, en acide phosphatidique, en cholestérol, en sphingomyéline, en acide arachidonique et en autres acides gras, qui peuvent tous influencer la stabilité des exosomes et la topologie membranaire 2,3. En raison de l’arrangement de la cargaison et des lipides, les exosomes initient des voies de signalisation dans les cellules réceptrices et participent au maintien d’une physiologie tissulaire normale 1,2,4,5. Dans certaines conditions pathologiques (c’est-à-dire la neurodégénérescence, la fibrose et le cancer), il a été démontré qu’ils déclenchent et propagent des stimuli pathologiques 4,6,7,8,9,10,11.
En raison de leur capacité à propager des signaux à des sites voisins ou éloignés, les exosomes sont devenus des biomarqueurs précieux pour le diagnostic ou le pronostic des maladies. De plus, les exosomes ont été utilisés expérimentalement comme véhicules de composés thérapeutiques 2,12. L’application potentielle de ces nanovésicules en clinique rend la méthode d’isolement de plus en plus importante afin d’obtenir un rendement, une pureté et une reproductibilité maximum. Différentes techniques d’isolement des exosomes ont été développées et mises en œuvre. En général, les exosomes peuvent être isolés à partir de milieux de culture cellulaire conditionnés ou de fluides corporels par centrifugation différentielle, chromatographie d’exclusion de taille et capture immunitaire (à l’aide de kits disponibles dans le commerce). Chaque approche présente des avantages et des inconvénients uniques qui ont été discutés précédemment 1,2,13,14.
Le protocole décrit se concentre sur 1) l’isolement et la culture de fibroblastes primaires à partir de muscles gastrocnémiens de souris adultes et 2) la purification et la caractérisation des exosomes libérés dans le milieu de culture par ces cellules. Il n’existe actuellement pas de protocole bien établi pour l’isolement des exosomes des fibroblastes primaires dans le cadre d’études fonctionnelles. Les fibroblastes primaires ne sécrètent pas de grandes quantités d’exosomes, ce qui rend le processus d’isolement et de purification difficile. Ce protocole décrit la purification de grandes quantités d’exosomes purs à partir de grands volumes de culture tout en maintenant leur intégrité morphologique et leur activité fonctionnelle. Des exosomes purifiés obtenus à partir d’un milieu conditionné ont été utilisés avec succès dans des expériences d’absorption in vitro pour induire des voies de signalisation spécifiques dans les cellules réceptrices. Ils ont également été utilisés pour des analyses protéomiques comparatives de cargaisons exosomiques provenant de plusieurs échantillons biologiques4.

<table><tbody><tr><td>Boîtes de 10 cm</td><td>Midwest Scientific, TPP</td><td>TP93100</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de 15 cm</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP93150</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage des protéines BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine Fraction V</td><td>Roche</td><td>10735094001</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5430R avec rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11</td><td>Eppendorf</td><td>022620659/5427754008</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie Chemidoc MP BioRad</td><td></td><td>12003154</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase P</td><td>Sigma, Roche</td><td>11 213 857 001</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>cOmplete cocktail d’inhibiteurs de protéase</td><td>Millipore/Sigma, Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Criterion Blotter avec électrodes à plaques</td><td>BioRad</td><td></td><td></td>1704070</tr><tr><td>Criterion TGX gel protéique sans coloration</td><td>BioRad</td><td>5678034</td><td>10 % 18 puits, midi-gel</td></tr><tr><td>Criterion cellule d’électrophorèse verticale (midi)</td><td>BioRad</td><td>NC0165100</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma, Roche</td><td>04 942 078 001</td><td>protéase neutre, grade II</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma/Millipore, Roche</td><td>10708984001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modification Eagles Medium</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate Saline tamponnée</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol 200 proof</td><td>Pharmco by Greenfield Global</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL tubes coniques à centrifuger</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Fluostar Omega lecteur de microplaques multimode</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX supplément</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P Membranes de transfert</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli tampon d’échantillon (4x)</td><td>BioRad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’acétate de magnésium</td><td>Sigma</td><td>63052-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Lait écrémé en poudre</td><td>LabScientific</td><td>M-0842</td><td></td></tr><tr><td>O2/CO2 incubateur</td><td>Sanyo</td><td>MC0-18M</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15140-122</td><td>10 000 U/ml</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger Premium</td><td>Fisher Scientific, Midwest Scientific</td><td>AVSC1510</td><td>1,7 mL</td></tr><tr><td>Scalpels jetables</td> <td>protégésFisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de coulée</td><td>BioRad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Système de filtration sous vide stérile à libération rapide-GP</td><td>Millipore</td><td>S2GPU05RE</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Filtre à cellules stériles (70 mm)</td><td>Fisher Scientific, marque Fisher</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal west Femto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34096</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en polypropylène à paroi mince</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de transfert</td><td>BioRad</td><td>16110734</td><td></td></tr><tr><td>Acide trichloracétique</td><td>Sigma</td><td>91228-100G</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>BioRad</td><td>1610719</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100 solution</td><td>Sigma</td><td>93443-100mL</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>12604-013</td><td>Sans rouge de phénol</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioRad</td><td>#1610781</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-centrifugeuse Optima XPM</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99842</td><td></td></tr><tr><td>Tube ultra-clair (14x89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Tubes ultra-clairs (25x89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie Isotemp 220</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS220</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et caractérisation d’exosomes à partir de fibroblastes musculaires squelettiques

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Les exosomes sont de petites vésicules extracellulaires libérées par pratiquement toutes les cellules et sécrétées dans tous les fluides biologiques. De nombreuses méthodes ont été développées pour l’isolement de ces vésicules, notamment l’ultracentrifugation, l’ultrafiltration et la chromatographie d’exclusion de taille. Cependant, tous ne sont pas adaptés à la purification et à la caractérisation des exosomes à grande échelle. Voici un protocole pour l’établissement de cultures de fibroblastes primaires isolés à partir de muscles squelettiques de souris adultes, suivis de la purification et de la caractérisation des exosomes à partir des milieux de culture de ces cellules. La méthode est basée sur l’utilisation d’étapes de centrifugation séquentielles suivies de gradients de densité de saccharose. La pureté des préparations exosomiques est ensuite validée par des analyses par transfert Western à l’aide d’une batterie de marqueurs canoniques (c’est-à-dire Alix, CD9 et CD81). Le protocole décrit comment isoler et concentrer des exosomes bioactifs pour la microscopie électronique, la spectrométrie de masse et les expériences d’absorption pour les études fonctionnelles. Il peut facilement être mis à l’échelle ou réduit et adapté pour l’isolement d’exosomes à partir de différents types de cellules, de tissus et de fluides biologiques.

Ce protocole est adapté à la purification d’exosomes à partir de grands volumes de milieu conditionné de manière rentable. La procédure est hautement reproductible et cohérente. La figure 1 montre une image de microscopie électronique à transmission (MET) d’exosomes purifiés à partir du milieu de culture de fibroblastes primaires de souris. La figure 2 montre le profil d’expression protéique des marqueurs exosomaux canoniques et l’absence de contaminants protéiq...

Ce protocole illustre 1) l’isolement et la culture de fibroblastes primaires à partir du muscle gastrocnémien de souris adulte ainsi que 2) la purification et la caractérisation des exosomes à l’aide d’une méthode d’ultracentrifugation différentielle combinée à des gradients de densité de saccharose suivis d’analyses par western blot.

Isolement et caractérisation d’exosomes à partir de fibroblastes musculaires squelettiques

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

L’avantage d’utiliser la centrifugation différentielle pour ce protocole est qu’elle est facilement évolutive jusqu’au litre et donc idéale pour isoler les exosomes des fibroblastes primaires. Les exosomes purifiés peuvent être obtenus à partir de différents types de cellules et de tissus isolés à partir de divers modèles de maladies. Les exosomes peuvent être utilisés comme biomarqueurs diagnostiques.Diantha van de Vlekkert, une scientifique du laboratoire d’Azzo, démontrera cette procédure pour commencer, pesez les muscles de la souris, puis transférez-les dans une boîte de 10 centimètres. En travaillant sous une cagoule de biosécurité, hachez les muscles avec des scalpels pour produire une pâte fine. Transférez la pâte musculaire finement hachée dans un tube de 50 millilitres et ajoutez la solution de digestion en utilisant 3,5 fois le volume par milligramme de tissu.Incuber pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius. Pour aider à la dissociation complète, mélangez soigneusement la suspension avec une pipette de 5 millilitres toutes les 10 minutes. Pour inactiver la solution de digestion, ajoutez 20 millilitres de DMEM Complete à la suspension cellulaire.Pipetez à travers une passoire en nylon de 70 micromètres placée sur un tube de 50 millilitres, puis lavez la crépine cellulaire avec 5 millilitres supplémentaires de DMEM Complete. Centrifugez la suspension cellulaire à 300 g pendant 10 minutes à température ambiante. Retirez délicatement le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de DMEM Complete.Ensemencez les cellules dans une boîte de 10 centimètres, puis placez la boîte dans l’incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et 3 % d’oxygène. Les cultures de fibroblastes du muscle squelettique doivent être maintenues à un faible niveau d’oxygène pour assurer des conditions de lumière physiologiques. Le niveau d’oxygène dans le muscle squelettique est d’environ 2,5 %Une fois que les cellules ont atteint 100 % de confluence, cultivez-les pendant un jour supplémentaire, puis rincez-les avec du PBS et ajoutez un millilitre de solution de trypsinisation.Après avoir incubé les cellules pendant 10 minutes, arrêtez la trypsinisation en ajoutant 10 millilitres de DMEM Complete. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres, puis centrifugez les cellules à 300 g pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans 20 millilitres de DMEM complet et ensemencez les cellules dans un plat de 15 centimètres.Prélever le milieu conditionné à partir des fibroblastes cultivés dans un tube de 15 millilitres. Centrifugez le milieu conditionné à 300 g pendant 10 minutes pour granuler les cellules vivantes. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de 50 millilitres et granulez les cellules mortes en centrifugeant le tube à 2 000 g pendant 10 minutes.Ensuite, transférez le surnageant dans un tube en polypropylène de 38,5 millilitres et centrifugez le tube à 10 000 g pendant 30 minutes pour éliminer les organites, les corps apoptotiques et les fragments de membrane. Pour granuler les exosomes, transférez le surnageant dans un tube ultraclair de 38,5 millilitres et ultracentrifugez-le à 100 000 g pendant 1,5 heure. Jetez soigneusement le surnageant, en laissant environ un millilitre de milieu conditionné.Lavez la pastille d’exosome et remettez-la en suspension dans jusqu’à 30 millilitres de PBS glacé. Centrifugez à nouveau les exosomes à 100 000 g pendant 1,5 heure. Pour compléter la purification, prélever le surnageant par pipetage, en prenant soin de ne pas déranger la pastille exosomale.L’étape de la pastille d’exosome peut être lâche et facilement détachée. Par conséquent, l’élimination du surnageant PBS doit être effectuée très soigneusement à l’aide d’une pipette de 200 microlitres. Remettez le granulé en suspension dans du PBS glacé en utilisant 25 microlitres par boîte de 15 centimètres de fibroblastes.Enfin, mesurez la concentration en protéines à l’aide du kit de dosage des protéines BCA et d’un lecteur de microplaques à 562 nanomètres. Ce protocole est une méthode hautement reproductible et cohérente pour purifier les exosomes. La microscopie électronique à transmission montre les tailles relativement uniformes de ces exosomes.L’immunotransfert des lysats d’exosomes montre un modèle canonique d’expression des protéines et l’absence de contaminants protéiques de la LDH et de la calnexine. Les exosomes ont été séparés par un gradient de densité de saccharose, et les fractions individuelles ont été sondées sur un western blot avec des anticorps contre Alix, CD9 et CD81. Les exosomes se sédimentent systématiquement en fractions trois à six.Les exosomes bioactifs isolés et concentrés peuvent être utilisés pour des analyses de microscopie électronique et de spectrométrie de masse, ainsi que pour des expériences d’absorption in vitro et in vivo pour des études fonctionnelles. Ce protocole est adapté à l’isolement d’exosomes à partir de cellules à faible sécrétion et peut être appliqué pour explorer l’implication des exosomes dans les maladies fibrotiques humaines.

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Isolement et culture des fibres musculaires est...

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Découvrez l'isolation d'exosomes à partir de fibroblastes musculaires squelettiques de souris par ultracentrifugation différentielle. Cette méthode reproductible permet d'obtenir des biomarqueurs diagnostiques pour l'étude des maladies fibrotiques.

Isolement et caractérisation d’exosomes à partir de fibroblastes musculaires squelettiques

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