Rt-PCR quantitatif à haut débit dans les échantillons de C. elegans en vrac et en vrac à l’aide de la technologie nanofluidique

Notre protocole a amélioré à la fois le débit et le temps pour obtenir des données RT-qPCR directement à partir d’un seul échantillon ou de petits échantillons en vrac sans avoir besoin d’isoler l’ARN. Grâce à ce protocole, plus de 9 000 résultats de RT-qPCR peuvent être obtenus en seulement deux jours de travail sur banc, un processus qui prendrait généralement environ cinq semaines avec la qPCR standard à 96 puits. Ce protocole fournit un test RT-qPCR plus rapide, robuste et très sensible chez C. elegans, ce qui est idéal pour surveiller la variabilité interindividuelle de l’expression génique entre les vers isogéniques.

Commencez par cueillir les vers de leur pelouse bactérienne sur une plaque de milieu de croissance de nématodes frais non ensemencés et laissez les vers se déplacer autour de la plaque pendant cinq minutes. Pendant que les vers s’acclimatent, dans une hotte sans RNase, mélangez 10 microlitres de tampon de lyse avec un à 100 Dnase I par échantillon et placez le couvercle d’une bande PCR à l’envers sur la plate-forme d’une lunette de dissection. Ensuite, ajoutez 10 microlitres du mélange de lyse dans les bouchons de tube PCR bombés et retirez les vers de la plaque pour éviter de transférer des bactéries dans chaque fente du couvercle.

Lorsque tous les vers ont été transférés, fermez les bouchons et faites tourner les tubes pendant cinq secondes avant de placer les tubes dans une fiole de Dewar remplie d’azote liquide. Après les cinq dernières secondes, décongelez les tubes dans un bain d’eau à 40 degrés Celsius avant de répéter la procédure de gel/décongélation neuf fois de plus. Après le dernier cycle de congélation/décongélation, mélangez les échantillons lysés sur un mélangeur thermique pendant 20 à 30 minutes à quatre degrés Celsius et environ 1800 tours par minute.

À la fin de l’incubation par mélange, faites tourner les échantillons comme démontré et ajoutez un microlitre de solution d’arrêt fraîchement décongelée dans chaque tube. Pour la transcription inverse d’échantillons chauds en vrac, dans une hotte sans RNase, préparez un mélange maître de tampon enzymatique et ajoutez 14 microlitres de mélange principal à 11 microlitres de chaque échantillon. Faites passer les échantillons dans un thermocycleur à l’aide du programme de transcription inverse indiqué et diluez le produit d’ADNc résultant dans un rapport de un à quatre dans de l’eau sans nucléases.

Pour une préamplification spécifique à la cible, ajoutez 3,75 microlitres de mélange maître de préamplification dans un puits par échantillon dans une plaque de 96 puits et ajoutez 1,25 microlitre de chaque solution d’ADNc à chaque puits de mélange maître. Lorsque tous les échantillons ont été chargés, couvrez la plaque avec du ruban adhésif et vortex brièvement les échantillons avant de les faire tourner par centrifugation, puis chargez la plaque sur un thermocycleur et exécutez le programme comme indiqué. Pour retirer les amorces non incorporées de la préamplification, à la fin du thermocycle, centrifugez la plaque d’échantillon et retirez soigneusement le joint.

Ajoutez deux microlitres d’exonucléase I master mix à chaque réaction de préamplification et refermez, centrifugez et chargez la plaque dans le thermocycleur. À la fin du cycle, diluez les échantillons avec 18 microlitres de tampon Tris-EDTA. Pour configurer une puce multi-réseaux, ajoutez 3,6 microlitres de mélange maître de chargement de test et 0,4 microlitre d’amorce inverse directe de 50 micromolaires dans un puits par échantillon dans une plaque de 384 puits.

Ajoutez ensuite 2,2 microlitres de mélange maître d’échantillon et 1,8 microlitres de chaque échantillon traité par exonucléase préamplifiée I dans les puits appropriés de la plaque. Pour configurer une puce à matrice unique, ajoutez 5,4 microlitres du mélange maître de chargement du test et 0,6 microlitre de l’amorce inverse directe à un puits par échantillon d’une deuxième plaque de 384 puits, puis ajoutez 3,3 microlitres de mélange maître d’échantillon et 2,7 microlitres de chaque échantillon traité à l’exonucléase I préamplifiée dans les puits appropriés de la plaque monomatrice préparée. Pour amorcer la puce nanofluidique pour la première course, en tenant la puce à un angle de 45 degrés, injectez lentement et soigneusement 150 microlitres de liquide de ligne de contrôle dans les accumulateurs de la puce.

Lorsque tout le fluide a été chargé, retirez le film protecteur bleu du bas de la puce et placez la puce dans la machine d’amorçage PCR nanofluidique avec le code-barres vers l’extérieur. Exécutez ensuite le script Prime(153x). Après l’amorçage, placez la puce sur une surface sombre et, au fur et à mesure que chaque test ou mélange d’échantillons est chargé, retirez les bouchons barrières correspondants si nécessaire et ajoutez le volume approprié de test ou de mélange d’échantillons aux entrées correspondantes de la puce nanofluidique conformément au plan expérimental.

Après le chargement, placez la puce dans le thermocycleur nanofluidique et exécutez le protocole approprié dans le logiciel de collecte de données. Si la puce multi-array n’est pas utilisée entière, effectuez une exécution post-script pour permettre l’utilisation en aval des matrices de puces restantes. Pour vérifier si le protocole Worm-to-Ct est une méthode d’extraction d’ADNc valide, la méthode a été comparée aux méthodes d’extraction standard de thiocyanate-phénol-chloroforme de guanidium.

À l’échelle mondiale, les niveaux d’expression de l’ARNm hsp-70 par 100 nanogrammes d’ARN total étaient comparables en utilisant les méthodes phénol-chloroforme et ver vers Ct. Cependant, dans les cas où l’expression de hsp-70 était la plus élevée, l’expression était plus élevée avec la méthode du ver à Ct, ce qui indique une sensibilité améliorée. Pour l’extraction au thiocyanate-phénol-chloroforme de guanidium dans des échantillons en vrac, hsp-70 a diminué de 82,7 chez les mutants hsf-1 par rapport aux témoins et de 92,3 % pour les mutants chauds à Ct, ce qui indique que la diminution était comparable entre les deux méthodes.

À l’aide d’ADNc obtenus à partir d’échantillons en vrac de 25 vers ou d’une moyenne de 36 échantillons de vers uniques, les méthodes ont détecté des niveaux d’expression comparables pour tous les chaperons testés, ce qui indique que les paramètres obtenus à partir de vers uniques sont fiables. Ici, l’expression moyenne de plusieurs transcrits hsp de vers uniques après un court choc thermique est montrée. Comme observé, la variabilité de l’expression des transcrits diffère considérablement entre les différents gènes.

Pour chaque transcrit testé à l’aide d’échantillons de vers uniques, les coefficients techniques de variabilité étaient inférieurs aux coefficients biologiques de variabilité, ce qui indique que les triplets techniques n’étaient pas nécessaires pour l’estimation des paramètres lorsque la qPCR était effectuée sur des vers uniques. Lors de l’exécution de ce protocole, il est essentiel de pipeter de petits volumes avec précision et de ne pas pipeter en sens inverse dans la puce nanofluidique. Ce protocole peut être utilisé pour obtenir de grands ensembles de données RT-qPCR, qui peuvent ensuite être exportées et traitées à volonté à l’aide de scripts Excel ou R.