Name: Analyse de spectrométrie de masse pour identifier l’ubiquité de cenp-A marqué par EYFP (EYFP-CENP-A) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Découvrez l'analyse de spectrométrie de masse pour identifier l'ubiquitination de CENP-A marqué par EYFP. Cette méthode révèle les sites d'ubiquitination essentiels pour la fonction centromérique et la viabilité cellulaire.

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Nous remercions Chao-Jun Li au Model Animal Research Center de l’Université de Nanjing pour l’analyse de spectrométrie de masse. Nous remercions Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa et les chercheurs actuels du Model Animal Research Center, de l’Université de Nanjing et du Greehey Children’s Cancer Research Institute pour leur discussion utile, leurs conseils expérimentaux et leurs réactifs. Nous remercions Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago et Dawn S. Chandler pour leurs généreux dons de réactifs. Y.N. a été soutenu par le Fonds de construction de la province du Jiangsu , le Fonds des sciences naturelles de la province du Jiangsu (SBK2019021248), la province du Jiangsu16 e Fonds des six grands sommets de talents (TD-SWYY-001), le Fonds « Foreign Expert Hundred Talents Program » (SBK2019010048) et la Fondation nationale des sciences naturelles en Chine (31970665). Cette étude a été en partie soutenue par la subvention R21 CA205659 de l’INC.

<ol><li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HJURP+is+a+cell-cycle-dependent+maintenance+and+deposition+factor+of+CENP-A+at+centromeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres.</a> Cell. 137 (3), 485-497 (2009).</li>
<li>Foltz, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere-specific+assembly+of+CENP-a+nucleosomes+is+mediated+by+HJURP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP.</a> Cell. 137 (3), 472-484 (2009).</li>
<li>Bernad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+HJURP+and+condensin+II+are+required+for+CENP-A+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly.</a> J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).</li>
<li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Inherited+through+Dimerization+between+Cell+Divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions.</a> Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).</li>
<li>Fachinetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Modifications+on+Ser68+and+Lys124+Are+Dispensable+for+Establishment%2C+Maintenance%2C+and+Long-Term+Function+of+Human+Centromeres%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres.</a> Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Indispensable+to+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability.</a> Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).</li>
<li>Srivastava, S., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modifications+of+CENP-A%3A+marks+of+distinction%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction.</a> Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).</li>
<li>Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+mechanisms+controlling+centromere+function+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).</li>
<li>Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+technique+that+allows+detection+of+sumoylation+and+ubiquitination+of+budding+yeast+kinetochore+proteins+Ndc10+and+Ndc80%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), e52482(2015).</li>
<li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+Analysis+of+Endogenous+and+Exogenous+Centromere-kinetochore+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins.</a> Journal of Visualized Experiment. (109), e53732(2016).</li>
<li>Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetratrico+peptide+repeat+interactions%3A+to+TPR+or+not+to+TPR%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR.</a> Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).</li>
<li>Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetically+controlled+protein+kinases+for+regulation+of+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling.</a> Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).</li>
<li>Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Ici, nous avons décrit des méthodes d’analyse de spectrométrie de masse pour identifier l’ubiquité du mutant EYFP-CENP-A K124R suggérant que le marquage EYFP induit l’ubiquité à une lysine différente dans la protéine mutante CENP-A K124R8. Dans nos résultats, nous avons identifié avec succès l’ubiquité sur la lysine 306 (K306) dans EYFP-CENP-A K124R, qui correspond à la lysine 56 (K56) dans l’analyse de spectrométrie de masse cenp-A. L’analyse de spectrométrie de masse décrite ici est une méthode ...

Dans la plupart des eucaryotes, les microtubules de fuseau doivent s’attacher à une seule région de chaque chromosome, appelée centromère. Le kinétochore est un complexe de protéines qui sont situées au centromère. L’étude du moment des mouvements des protéines centromères et kinétochores et de la structure des kinétochores et des centromères est importante pour comprendre l’instabilité chromosomique (CIN) et la progression du cancer. Les questions clés sont de savoir comment l’emplacement chromosomique et la fonction d’un centromère (c.-à-d. l’identité centromère) sont déterminés et comment ils participent à la ségrégation chromosomique exacte. Chez la plupart des espèces, la présence d’un nucléosome spécial contenant une protéine spécifique ressemblant à des histones appelée CENP-A définit l’identité centromère. Par conséquent, il est proposé que le CENP-A soit l’indicateur non ADN (marque épigénétique) de l’identité centromère. Il est important d’élucider le mécanisme de la façon dont le CENP-A définit l’identité centromère chez l’homme.
La protéine de reconnaissance de jonction Holliday (HJURP) est le chaperon spécifique au CENP-A qui dépose le CENP-A dans les nucléosomes centromériques1,2,3. Nous avons déjà signalé que le CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase est nécessaire pour l’ubiquité CENP-A sur lysine 124 (K124) et la localisation centromère4. En outre, nos résultats ont montré que le recrutement centromère de CENP-A nouvellement synthétisé nécessite pré-existant ubiquitylated CENP-A5. Ainsi, un modèle a été fourni suggérant que l’ubiquité cenp-a est héritée par la dimérisation entre les divisions cellulaires.
Contrairement à nos conclusions et à celles de Yu et coll., les résultats négatifs concernant le CENP-A et sa localisation centromérique ont été publiés récemment6. L’article affirmait que les modifications du CENP-A sur la lysine 124 (K124) sont dispensables pour l’établissement, l’entretien et la fonction à long terme des centromères humains, sur la base de leurs résultats négatifs montrant que la mutation de K124R n’a pas affecté la localisation centromere censo6. Cependant, il y a suffisamment de place pour le débat dans leurs résultats et conclusions, et nous avons déjà décrit quel problème il pourrait y avoir dans leur publication précédente7. Il convient de noter qu’ils ont fusionné des protéines avec le CENP-A, qui ont des poids moléculaires beaucoup plus importants que la taille du CENP-A endogène : par exemple, elles ont fusionné la protéine fluorescente jaune améliorée de ~30 kDa (EYFP) à ~16 kDa CENP-A et ont analysé la protéine de fusion EYFP-CENP-A K124R dans leur système RPE-1CENP-A-A-KNOCK. On ne s’attend pas à ce que l’ubiquitine de K124 se lie directement au HJURP basé sur des prédictions structurelles4, cependant, l’addition de mono-ubiquitine devrait avoir un impact sur la conformation de protéine de CENP-A. La protéine de la conformation CENP-A peut être modifiée par la présence d’une grande protéine de fusion, et ce changement conformationnel peut masquer les changements structurels causés par la perte de l’ubiquité. Nous suggérons que la fusion de la protéine de grande taille induit l’ubiquité à une lysine autre que K124 dans EYFP-CENP-A K124R mutant et cette ubiquitylation à un autre site inhibe / masque le phénotype mutant original K124R seul. Des preuves que l’ubiquité se produit à différentes lysine dans la protéine mutante CENP-A K124R avec une grande protéine d’étiquette (EYFP) ont été rapportées dans notre publication précédente8. Il a été constaté que le marquage EYFP induit l’ubiquitination d’un autre site de lysine d’EYFP-CENP-A K124R et que le mutant EYFP-CENP-A K124R se lie à HJURP. En conséquence, cette ubiquitylation à un autre site inhibe /masque le phénotype mutant unique K124R original, et les mutants EYFP-CENP-A WT et K124R ont montré la localisation centromere (nous avons utilisé et comparé pBabe-EYFP-CENP-A WT et K124R mutant, avec pBabe-EYFP contrôle.). Les résultats ont démontré que les mutants CENP-A K124R marqués par le drapeau ou non étiquetés sont mortels, mais peuvent être sauvés par une fusion de monoubiquitine, suggérant que l’ubiquité CENP-A est indispensable à la viabilité cellulaire.
Ces dernières années, de nombreuses études ont développé différents essais pour identifier les modifications posttranslationnelles (PTM) de la protéine CENP-A et d’autres protéines centromere-kinetochore à la fois in vivo et in vitro9,10,11. Analogue aux PTM des protéines histones qui sont un mécanisme majeur régulant la fonction de la chromatine, les PTM des composants centromériques de la chromatine sont également impliqués dans un mécanisme essentiel pour réguler la structure globale et la fonction des centromères. La majorité des sites PTM du CENP-A sont spécifiques aux nucléosomes contenant du CENP-A, bien que quelques-uns d’entre eux soient conservés dans l’histone H3, ce qui suggère que la modification de ces résidus contribue à la fonction spécifique au centromémère. PTMs de CENP-A comprenant la phosphorylation, l’acétylation, la méthylation, et l’ubiquité ont été précédemmentrapportés 9, suggérant que CENP-A est soumis à une variété de PTM et leurs tableaux combinatoires sur son terminus aminé et le domaine de c-terminus histone-fold. L’importance des modifications du CENP-A dans de multiples fonctions a été révélée par de nombreux groupes, y compris le nôtre. Ces fonctions impliquent le dépôt de CENP-A aux centromères, la stabilité des protéines et le recrutement du CCAN (réseau constitutif associé au centromère)9. Cependant, des études limitées et des résultats des PTM du CENP-A sont préformés lorsque des comparaisons sont faites avec l’une des histones canoniques qui régulent directement ou indirectement leur fonction. Les rapports techniques axés sur la méthodologie permettant d’identifier ces PTM du CENP-A sont également limités.
Étant donné que la CENP-A ubiquitylation est nécessaire pour le dépôt cenp-A au centromere12, hérité par dimérisation entre la division cellulaire5, et indispensable à la viabilité cellulaire8, la méthode d’identification de l’ubiquité CENP-A serait essentielle à l’avenir pour étudier l’activité fonctionnelle, le positionnement et la structure du centromere. Par conséquent, nous décrivons ici l’analyse de spectrométrie de masse pour identifier l’ubiquité du mutant EYFP-CENP-A K124R suggérant que le marquage EYFP induit l’ubiquité à une lysine différente dans la protéine mutante CENP-A K124R8. Des protocoles d’autres essais et analyses de contrôle (analyse de l’immunofluorescence, analyse de l’excroissance des colonies et test d’ubiquité in vivo) sont également présentés pour discuter correctement des résultats d’une analyse de spectrométrie de masse majeure.

<table><tbody><tr><td>Equpiments/Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml de tubes à faible liaison protéique</td><td>Eppendorf</td><td>022431064</td><td>Pour l’analyse par spectrométrie de masse</td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire de 10 cm</td><td>BIOFIL/JET, Chine</td><td>700224</td><td>Boîte de culture tissulaire de 10 cm (Yohei lab, PN63)</td></tr><tr><td>Cluster de culture cellulaire à 6 puits</td><td>Fisher/Corning Incorporated</td><td>07-200-83</td><td>Culture à 6 puits plaque</td></tr><tr><td>CentriVap</td><td>LABCONCO-Concentrateur</td><td></td> sous <td>vide de paillasse pour peptides secs sous vide pour l’analyse par spectrométrie de masse</td></tr><tr><td>ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 &mu ; m</td><td>Eksigent Technologies</td><td>805-00120</td><td>Colonne de chromatographie liquide (RPLC) pour l’analyse par spectrométrie de masse</td></tr><tr><td>HCX PL APO 100x lentille à immersion dans l’huile</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td><td>100X Lentille à immersion dans</td></tr><tr><td>l’huile HCX PL APO 63x Lentille à immersion dans l’huile</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td><td>63X Lentille à immersion dans l’huile</td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF Membrane de transfert</td><td>EMD Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Pour western blot</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence motorisé Leica DM IRE2</td><td></td> <td>Microscope à fluorescence motorisé</td><td></td></tr> <tr><td>Leica Source lumineuse compacte Leica</td><td></td><td></td> EL6000 <td>Source lumineuse externe pour l’excitation fluorescente</td></tr><tr><td>Micro Verre de couverture (22 mm x 22 mm)</td><td>Verre de couverture Surgipath</td><td>105</td><td>(22 mm x 22 mm)</td></tr><tr><td>Appareil d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide modèle V16-2</td><td>Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences</td><td>31071010</td><td>Appareil d’électrophorèse sur gel I pour appliquer un plus grand système de chromatographie liquide SDS-PAGE</td></tr><tr><td>gel nanoLC.2D</td><td>Eksigent</td> <td>Technologies-pour</td> <td>l’analyse par spectrométrie de masse</td></tr><tr><td>NuPAGE 4 %-12 % Bis-Tris Protein Gels</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP0335BOX</td><td>Les gels de protéines Bis-Tris 4 %-12 % disponibles dans le commerce pour l’analyse</td></tr> <tr><td>par spectrométrie de masseOlympus FLUOVIEW FV3000 Microscope confocal à balayage laser</td><td></td><td></td> <td>Olympus-Microscope confocal à balayage laser (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ téléchargements/# !dlOpen= %23detail847250519)</td></tr><tr><td>ORCA-R2 Caméra CCD Degital</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600-10B</td><td>Caméra CCD</td></tr><tr><td>PAP Pen</td><td>Binding Site</td><td>AD100.1</td><td>Pour une barrière hydrofuge dans la coloration immunofluorescente</td></tr><tr><td>TISSU BOÎTES DE CULTURE 10CM</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td>Boîte de culture tissulaire de 10 cm</td></tr><tr><td>Électrophorèse verticale pour la course sur gel (grande taille)</td><td>Junyi, Chine</td><td>JY-SCZ6+</td><td>Appareil d’électrophorèse sur gel II pour appliquer un gel SDS-PAGE plus grand (Yohei lab, PE23)</td></tr><tr><td>VWR Micro Slides, Frosted</td><td>VWR International</td><td>48312-013</td><td>Micro lames</td></tr><tr><td><fortes>Anticorps primaires</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-CENP-A</td><td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td><td>KAM-CC006</td><td>Anticorps monoclonal de souris Anticorps</td></tr><tr><td>anti-CENP-B</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>Anticorps monoclonal de souris</td></tr><tr><td>anti-GAPDH</td><td>ABCAM</td><td>ab37168</td><td>Anticorps polyclonal de lapin</td></tr><tr><td>anti-GAPDH</td><td>Invitrogen</td><td>PA1987</td><td>Anticorps</td></tr> <tr><td>polyclonal de lapinanticorps anti-GFP</td><td>ANTI #76 (Anticorps maison)</td><td></td><td>Anticorps polyclonal de lapin</td></tr><tr><td>anti-HA (3F10)</td><td>Roche</td><td>11815016001</td><td>Anticorps monoclonal</td></tr><tr><td>anti-HJURP</td><td>Proteintech Group</td><td>15283&ndash ; 1-AP</td><td>Anticorps polyclonal de lapin</td></tr><tr><td>anti-ubiquitine</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-317A-1</td><td>Anticorps polyclonal de lapin</td></tr><tr><td><réactifs forts></fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Dosage des protéines</td><td>Bio-Rad Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>Réactif de dosage des protéines commercial I pour la mesure de la concentration en protéines (compatible avec 0,1 % SDS)</td></tr><tr><td>Branson SONIFIER 450</td><td></td><td></td><td>Sonicateur</td></tr><tr><td>Branson Ultrasons Sonicateur Microtip Step, solide, fileté 9,5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>33995-325</td><td>Disrupteur pavillon pour sonication</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>33996-185</td><td>Micropointe pour sonication</td></tr><tr><td>Tampon A1</td><td>-</td><td>-</td><td>20 mM Tris-HCl, pH 7,4 ; 50 mM NaCl ; 0,5 % Nonidet P-40 ; 0,5 % désoxycholate ; 0,5 % SDS ; 1 mM EDTA ; réactif complet inhibiteur de protéase sans EDTA</td></tr><tr><td>Cocktail complet d’inhibiteur de protéase sans EDTA Roche</td><td></td><td>11-873-580-001</td><td>Réactif complet inhibiteur de protéase sans EDTA pour tampon A1</td></tr><tr><td>Coomassie bleu brillant R-250</td><td>BBI Life Sciences</td><td>CAS 6104-59-2</td><td>Solution de bleu de Coomassie pour l’analyse par spectrométrie de masse</td></tr><tr><td>Solution de violet cristallin (2,3 % de violet de cristal, 0,1 % d’oxylate d’ammonium, 20 % d’éthanol)</td><td>SigmaI-Aldrich</td><td>HT90132-1L</td><td>Pour la coloration des colonies</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>Pour la coloration nucléaire</td></tr><tr><td>DMEM : F12 Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td>DMEM : F12</td></tr><tr><td>Medium Sérum de veau fœtal, certifié, chaleur inactivé, origine américaine</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS (sérum de bovin fœtal)</td></tr><tr><td>DMEM à haute teneur en glucose (Dulbecco' Eagle modifié' s medium)</td><td>Life Technologies/BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>DMEM à haute teneur</td></tr><tr><td>en glucose Lipofectamin 3000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>L3000</td><td>Réactif de transfection I pour la transfection chimique</td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000, P3000 solution</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>L3000</td><td>Réactif de transfection II pour la transfection chimique</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td>Fixation lait</td></tr><tr><td>écrémé en poudre (substitution approuvée du lait en poudre d’œillet)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9255871 (réapprovisionnement n° 190915 ; Lot # 90629)</td><td>Lait écrémé écrémé</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>31985</td><td>Milieu sérique réduit</td></tr><tr><td>p-phénylènediamine</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6001</td><td>Pour le milieu de montage</td></tr><tr><td>Pénicilline, Streptomycine ; Liquide</td><td>Fisher/Gibco</td><td>15-140</td><td>Pénicilline-streptomycine</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine SOLUTION</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P 8920</td><td>Poly-L-Lysine, 0,1 % p/v, dans l’eau</td></tr><tr><td>Polyéthylèneimine [PEI] ; 1,0 mg/ml</td><td>Polysciences</td><td>23966&ndash ; 2</td><td>Réactif de transfection III pour la transfection chimique</td></tr><tr><td>Particules de sépharose de protéine A CL-4B</td><td>GE Healthcare/Amersham</td><td>17-0963-03</td><td>Billes de sépharose de protéine A CL-4B pour des tests d’ubiquitylation in vivo à l’aide de pQCXIP-EYFP-CENP-A</td></tr><tr><td>Restore Western Blot Stripping Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI21059</td><td>Western Blot Stripping Buffer I</td></tr><tr><td>Trypsine de qualité séquençage</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>Pour l’analyse par spectrométrie de masse</td></tr><tr><td>Substrat SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity</td><td>Thermo</td><td>34095</td><td>Substrat chimiluminescent amélioré (ECL) ultra-sensible</td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td><td>10977</td><td>Eau stérile de culture tissulaire</td></tr><tr><td>Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6,85 ; 2 % SDS ; 50 mM DTT ; 100 mM 2-Mercaptoethanol)</td><td>-</td><td>-</td><td>Western Blot Stripping Buffer II</td></tr><<tr><td>strong>Anticorps secondaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Anticorps secondaire conjugué au fluorophore (anticorps secondaire purifié par affinité)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11005</td><td>anticorps secondaire conjugué au fluorophore (anticorps secondaire purifié par affinité)</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquisition FV31S-SW software</td><td>Olympus-Sofware</td><td></td> <td>C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/# !dlOpen= %23detail847250519)</td></tr><tr><td>Analyse FV31S-DT software</td><td>Olympus</td><td>-</td><td>Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ téléchargements/# !dlOpen= %23detail847250519)</td></tr><tr><td>cellSens Dimension software Ver. 1. 18</td><td></td> <td>Olympus-Sofware</td> <td>C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)</td></tr><tr><td>Image Studio Analysis Software Ver 4.0</td><td>LI-COR Biosciences-Software</td><td></td> D <td></td></tr><tr><td>Molecular Imager Versadoc MP4000 System</td><td>Bio-Rad</td><td>-</td><td>Imageur de chimiluminescence pour la détection d’immunoblot</td></tr> Système <tr><td>d’imagerie infrarouge Odyssey CLx</td><td>LI-COR Biosciences-Système</td><td></td> <td>d’imagerie infrarouge pour la détection d’immunoblot</td></tr><tr><td>OpenCFU saftware</td><td>-</td><td>-</td><td>Pour le comptage de colonies (http://opencfu.sourceforge.net/)</td></tr><tr><td>Openlab version 5.5.2. Logiciel d’imagerie scientifique</td><td>Improvision/PerkinElmer-Software</td><td></td> <td>A</td></tr><tr><td>ProteinPilot Software version 4.5</td><td>AB SCIEX-Software</td><td></td> <td>F pour l’analyse par spectrométrie de masse</td></tr><tr><td>Quantité Un logiciel d’analyse 1-D</td><td>Bio-Rad-Software</td><td></td> <td>E</td></tr><tr><td>TripleTOF 5600+ System</td><td>AB SCIEX-Instrument</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de spectrométrie de masseVolocity version 6.3 Logiciel d’analyse d’images 3D (acquisition de volocité)</td><td>PerkinElmer-Software</td><td></td> <td>B1</td></tr><tr><td>Volocity version 6.3 Logiciel d’analyse d’images 3D (quantification de la volocité)</td><td>PerkinElmer-Software</td><td></td> <td>B2</td></tr></tbody></table>

analyse de spectrométrie de masse pour identifier l’ubiquité de cenp-a marqué par eyfp (eyfp-cenp-a)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

L’étude de la structure et de la dynamique des kinétochores et des centromères est importante pour comprendre l’instabilité chromosomique (CIN) et la progression du cancer. La façon dont l’emplacement chromosomique et la fonction d’un centromère (c.-à-d. l’identité centromère) sont déterminés et participent à une ségrégation chromosomique précise est une question fondamentale. Le CENP-A est proposé pour être l’indicateur non-ADN (marque épigénétique) de l’identité centromère, et l’ubiquité de CENP-A est exigée pour le dépôt de CENP-A au centromère, hérité par la dimérisation entre la division cellulaire, et indispensable à la viabilité cellulaire.
Ici nous décrivons l’analyse de spectrométrie de masse pour identifier l’ubiquité du mutant EYFP-CENP-A K124R suggérant que l’ubiquité à une lysine différente est induite en raison du marquage EYFP dans la protéine mutante CENP-A K124R. L’ubiquité de lysine 306 (K306) dans EYFP-CENP-A K124R a été identifiée avec succès, ce qui correspond à la lysine 56 (K56) dans le CENP-A par l’analyse de spectrométrie de masse. Une mise en garde est discutée dans l’utilisation de GFP/EYFP ou le marquage de la protéine de poids moléculaire élevé comme outil pour analyser la fonction d’une protéine. La limite technique actuelle est également discutée pour la détection des bandes ubiquitylées, l’identification de l’ubiquité(s) spécifiques au site(s), et la visualisation de l’ubiquité dans les cellules vivantes ou une cellule unique spécifique pendant tout le cycle cellulaire.
La méthode d’analyse de spectrométrie de masse présentée ici peut être appliquée à la protéine humaine CENP-A avec différentes étiquettes et autres protéines centromère-kinetocholore. Ces méthodes combinatoires consistant en plusieurs essais/analyses pourraient être recommandées pour les chercheurs qui sont intéressés à identifier les rôles fonctionnels de l’ubiquité.

Le mutant EYFP-CENP-A K124 montre l’ubiquité, l’interaction avec le HJURP, et aucun défaut dans la localisation de centromère ni la létalité cellulaire. Ici, le système signalé par Fachinetti et coll. (2017)6 a été reconstitué : dans les cellules humaines diploïdes (RPE-1) portant une cellule perturbée et une allèle CENP-A (CENP-A-/F),EYFP-CENP-A a été exprimée à partir du vecteur de rétrovirus pBabe-EYFP. Dans ce système, l’expression du CENP-A endogè...

Le CENP-Une ubiquitylation est une exigence importante pour le dépôt de CENP-A au centromère, hérité par dimerisation entre la division cellulaire, et indispensable à la viabilité cellulaire. Ici nous décrivons l’analyse de spectrométrie de masse pour identifier l’ubiquité de la protéine CENP-A (EYFP-CENP-A) marquée par EYFP.

Analyse de spectrométrie de masse pour identifier l’ubiquité de cenp-A marqué par EYFP (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Cette méthode permet d’identifier l’ubiquité de la protéine CENP-A taguée EYFP. Il peut également être appliqué sur la protéine CENP-A humaine avec différents tests et autres protéines. Le principal avantage de ceci est qu’il peut être employé pour identifier les emplacements omniprésents d’EYFP CENP-A K124R avec l’importance biologique cruciale.Il pourrait être étendu pour étudier les modifications post-translationnelles d’un large éventail de protéines fonctionnelles. Commencez par préparer des perles de protéine A liées à des anticorps anti-GFP. Laver 25 microlitres de protéines A perles par réaction d’immunoprécipitation avec tampon A1 au moins trois fois pour enlever l’éthanol.Ensuite, faire une solution de perles à 50% avec tampon A1. Ajouter deux microlitres d’anticorps anti-GFP aux perles. Ajouter ensuite le tampon A1 à 20 fois le volume net de perles. Effectuez une rotation de bout en bout à quatre degrés Celsius pendant quatre à 18 heures.La durée optimale de la rotation doit être déterminée empiriquement en fonction de l’efficacité de l’immunoprécipice. Après la rotation, centrifuger les perles à 100 fois g pendant une minute et enlever le surnatant non lié. Ajoutez le tampon A1 pour faire une solution de 50% de perles et utilisez 25 microlitres de cette solution pour chaque réaction d’immunoprécipitation.Pour effectuer l’immunoprécipitation, lyse cellules dans le tampon A1 par sonication et gel / dégel. Mesurer les concentrations de protéines et normaliser les quantités de protéines parmi les différents échantillons de propriété intellectuelle. Retirez ensuite 5 % de l’échantillon de chaque tube pour l’exécuter dans la page SDS.Mélanger le reste du lysate avec 25 microlitres de perles de protéine A liées à l’anticorps anti-GFP et effectuer une rotation de bout en bout à quatre degrés Celsius pendant quatre à 18 heures. Après avoir lysé les cellules dans le tampon A et effectué l’immunoprécipitation comme décrit précédemment, garder 10% du total des immunoprécippitants pour confirmer l’ubiquité EYFP CENP-A et de déterminer avec précision la position de l’UBIQUITYLATED EYFP CENP-A. Utilisez l’autre 90% pour l’analyse de spectrométrie de masse.Exécutez l’échantillon de spectrométrie de masse dans un gel protéique 4-12%Bis-Tris disponible dans le commerce. Effectuez ensuite la coloration bleue Coomassie et excisez la région de gel de 50 à 70 kilodaltons pour l’analyse de spectrométrie de masse. Couper chaque tranche de gel en petits morceaux et les placer dans un tube de liaison à faible teneur en protéines de 0,5 millilitre.Lavez les morceaux de gel avec 100 microlitres de 50% d’acétyonitrile en bicarbonate d’ammonium millimolaire. Vortex pendant 10-15 minutes. Ensuite, tournez-les vers le bas et jetez le surnatant.Après le dernier lavage, sécher les morceaux de gel à l’l’œur d’un concentrateur à vide sur le dessus du banc pendant 30 minutes. Ajouter 10 microlitres de 10 nanogrammes par trypsine de qualité séquençage microliter et laisser les morceaux de gel se réhydrater pendant cinq minutes. Ajouter ensuite 25 millimolaires de bicarbonate d’ammonium, juste assez pour couvrir les morceaux de gel et les digérer à 37 degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, transférez le supernatant digéré dans un tube siliconisé propre de 0,65 millilitre et ajoutez 50% d’acétylonitrile et 5% de solution acide formique. Vortex l’échantillon pendant 10 minutes. Ensuite, tournez-le vers le bas et transférer le supernatant dans un tube d’extraction.Concentrez l’échantillon à nouveau sur deux microlitres. Ajouter ensuite huit microlitres de 3% d’acétylonitrile et 2% de solution acide formique. Vortex pendant 15 minutes et tourne-le à 16 000 fois g pendant 30 minutes.Effectuer l’acquisition de données sur la SP avec LC-MS/MS à l’aide d’un système de chromatographie liquide couplé à un instrument de spectrométrie de masse. Injecter huit microlitres de l’échantillon dans une colonne de chromatographie liquide de phase inverse et séparer les peptides avec un gradient de 2 à 80 % du solvant B en 60 minutes suivant les instructions manuscrites. Recueillir des données de spectrométrie de masse à l’aide du mode d’acquisition dépendant des données.Ouvrez le logiciel commercial pour analyser les données de spectrométrie de masse sur le bureau. Pour démarrer une nouvelle recherche, cliquez sur le bouton LC sur le menu supérieur. Cliquez ensuite sur le bouton ajouter pour télécharger les fichiers de données brutes MS originaux.Sélectionnez l’ID de protéine humaine dans la méthode parangon comme méthode de recherche de base de données et recherchez les fichiers de données brutes originaux de MS contre la base de données UniProt homo sapiens. Sélectionnez la trypsine comme enzyme de digestion et définissez le reste des paramètres selon les instructions manuscrites. Entrez le nom de fichier des résultats et cliquez sur l’enregistrer comme bouton sur la droite du menu.Sélectionnez ensuite un dossier pour stocker les résultats de recherche et cliquez sur le bouton enregistrer. Cliquez sur le bouton processus pour démarrer la recherche. Une fois la recherche terminée, les données avec le nom de recherche saisi seront automatiquement stockées dans le dossier sélectionné.Pour obtenir des spectres MS/MS de tout peptide spécifique, ouvrez les résultats de recherche dans le logiciel F.Then cliquez sur la protéine dans la liste des protéines dans le menu supérieur et cliquez sur le peptide dans le menu du milieu. Le MS/MS de ce peptide apparaîtra en bas du menu. Pour exporter et enregistrer les spectres MS/MS, copiez les spectres et coller à un format de fichier approprié.Les constructions génétiques d’EYFP CENP-A de type sauvage ou mutant K124R qui sauve la perte de CENP-A endogène ont été habilement exprimées lorsque l’intégration rétrovirale a été effectuée. L’expression du CENP-A endogène n’a pas été détectée sept jours après l’induction de Cre recombinase. Le type sauvage EYFP CENP-A et l’expression des protéines K124R se sont révélés à un niveau similaire à celui de la protéine endogène initiale CENP-A.Les mutants de type sauvage EYFP CENP-A et K124R ont montré une localisation centromère à sept jours après la perturbation de l’expression restante du CENP-A endogène. Le type sauvage EYFP CENP-A et le mutant K124R ont montré l’ubiquité et l’interaction avec HJURP contrairement au cas pour le type sauvage marqué ou non marqué CENP-A et le mutant K124R. La viabilité cellulaire a été évaluée en effectuant l’essai de croissance de colonie 14 jours après la perturbation de l’allèle endogène restant de CENP-A.Les mutants de type sauvage EYFP CENP-A et K124R ont montré un nombre similaire de colonies sauvées 14 jours après la perturbation de l’allèle endogène cenp-A restant. La spectrométrie de masse ip a indiqué l’ubiquité à la lysine 306 dans EYFP CENP-A K124R dans les cellules de CENP-A moins F. Tous ensemble, ces résultats ont suggéré que la fusion de la protéine de grande taille induit l’ubiquité à une lysine autre que K124R dans CENP-A qui inhibe le phénotype mutant simple original de K124R.Lorsque vous essayez ce protocole, utilisez les gels protéiques Bis-Tris disponibles dans le commerce à 4 %12 % pour exécuter les échantillons de spectrométrie de masse. Ajouter une trypsine adéquate aux morceaux de gel et les réhydrater jusqu’à ce que toutes les enzymes aient été absorbées. Une technique d’étiquetage ou d’enquête moléculaire plus faible est en fait nécessaire pour visualiser l’ubiquité et étudier la signalisation de l’ubiquité des protéines temporelles spatiales aux niveaux et à l’ensemble de l’organisme.

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Analyse de spectrométrie de masse pour identifier l’ubiquité de cenp-A marqué par EYFP (EYFP-CENP-A)

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