Name: Détection simple des cils primaires par immunofluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Apprenez la détection des cils primaires par immunofluorescence dans les fibroblastes. Cette méthode permet d'étudier les troubles associés aux corps basaux et d'explorer le rôle des cils dans la signalisation cellulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par le Ministère de la défense de la République tchèque - Plan de développement d’organisations à long terme Aspects médicaux des armes de destruction massive de la Faculté des sciences de la santé militaire de l’Université de la Défense; le Ministère de l’éducation, de la jeunesse et des sports, République tchèque (Projet de recherche spécifique no : SV/ FVZ201703) et PROGRES Q40/06. Merci aussi à Daniel Diaz pour son aimable aide à la révision de la langue anglaise.

1. Préparation des supports culturels, des solutions et des plats
<ol><li>Autoclavez les couvercles (22 x 22 mm). Préparer 6 assiettes de puits. Décongeler le sérum bovin fœtal (FBS) et la pénicilline/streptomycine antibiotique et réchauffer la température moyenne à ambiante (RT). Utiliser trypsin-EDTA (0.25%) et 1x PBS (saline tamponnée de phosphate avec calcium et magnésium) pour passer les cellules.</li>
	<li>Préparer du paraformaldéhyde frais à 4 % (PFA) en dH2O (800 mg de PFA dans 20 mL de dH2O). La PFA doit être fraîchement préparée pour chaque expérience. Remuer et chauffer la solution à 55 °C pendant 30 min dans le capot. Refroidir à RT. Ajouter 1 M d’hydroxyde de sodium jusqu’à ce que la solution devienne claire (pH = 7,2–7,4). Conserver à 4 °C jusqu’à 1 semaine. Note: PFA est toxique; toujours porter un équipement de protection individuelle adéquat et se préparer dans le capot chimique.</li>
	<li>Préparer 500 mL de supports de culture, DMEM (le milieu de l’aigle modifié de Dulbecco) contenant 10% FBS, 1% de pénicilline/streptomycine, et 2% de glutamine.</li>
	<li>Préparer 13 mL de 1% de solution de gélatine en dH stérile2O (130 mg de gélatine dans 13 mL de dH2O). Utilisez 2 mL de gélatine de 1% pour chaque puits dans une assiette de 6 puits. Restez stérile.</li>
	<li>Nettoyez le capot d’écoulement laminaire à l’aide de 70 % d’éthanol. Placez le matériau requis à l’intérieur du capot d’écoulement laminaire avant de commencer l’expérience.</li>
</ol>2. Culture cellulaire pour la coloration immunocytochimie
<ol><li>Décongeler les cellules (dans cette étude C2C12, MEF, NHLF, et fibroblastes de la peau) en utilisant des techniques standard et les plaquer dans une fiole T75 complétée par ~10–12 mL des médias préparés. Incuber à 37 °C/5% CO2 /90%d’humidité relative (RH) jusqu’à ce que les cellules atteignent 70% confluence.</li>
	<li>Retirez les cellules de l’incubateur et placez-les dans le capot d’écoulement laminaire. Retirez le support de culture et rincez brièvement les cellules 2x avec 1x PBS. Ajouter ~2 ml de 0,25% trypsin-EDTA dans la fiole T75 et incuber à 37 °C pendant ~5 min. Vérifiez périodiquement sur le microscope inversé pour surveiller le détachement cellulaire. REMARQUE : Le temps d’incubation dépend de la ligne cellulaire et doit donc être déterminé empiriquement.</li>
	<li>Resuspendez doucement les cellules dans 10 mL de supports de culture, en pipeting soigneusement pour créer une suspension à cellule unique. Rincer à nouveau la fiole si nécessaire.</li>
	<li>Placez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 mL et une centrifugeuse pendant 5 min à ~200 x g. Décanter le supernatant, ajouter 10 mL de supports de culture, et resuspender doucement le granulé. Prenez 20 μL de la suspension cellulaire et mélangez-les dans un rapport de 1:1 avec le bleu trypan et comptez dans un cytomètre suivant la méthode standard.</li>
	<li>Placez un couvercle à l’intérieur de chaque puits d’une plaque de 6 puits à l’aide de pinces à épiler. Enrober les couvercles de gélatine en versant ~2 mL dans les puits. Cela aidera les cellules à s’attacher aux couvercles. Retirer la solution de gélatine et laisser sécher à l’air pendant quelques minutes. Les couvercles sont maintenant prêts pour la culture des cellules. Commencez la culture immédiatement.</li>
	<li>Détemêlez 100 000 fibroblastes dans chaque puits et ajoutez 2 mL de supports culturels. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C/5% CO2/90% RH. À ce stade, les cellules peuvent être traitées en fonction des besoins de l’utilisateur. Les traitements pour induire la ciliation ont été précédemmentdécrits 4,5. REMARQUE : Le nombre initial d’ensemencement dépend du temps de doublement des cellules et doit être déterminé en conséquence.</li>
</ol>3. Coloration immunofluorescente des cils primaires in vitro
<ol><li>Chauffer le paraformaldéhyde à 4 % à RT. Préparer les pipettes Pasteur, 1x PBS (RT), le contenant de déchets, les tubes coniques de 15 mL, les micropipettes (0,5–10 μL, 20–200 μL et 100–1 000 μL) et les pointes. Prenez les cellules de l’incubateur et placez-les sur le banc. REMARQUE : La procédure de coloration n’a pas besoin d’être effectuée dans des conditions stériles. Toutes les solutions doivent être à RT.</li>
	<li>Retirez les supports de chaque puits. Laissez le couvercle à l’intérieur du puits. Laver très doucement les cellules 3x avec 2 mL de 1x PBS. À l’aide d’une pipette Pasteur, ajouter 2 mL de 4 % de PFA dans chaque puits pour fixer les cellules. Incuber pendant 10 min à RT. Retirer la PFA et laver 3x avec 1x PBS. REMARQUE : Utilisez toujours un volume suffisant pour couvrir l’intégralité du couvercle pendant les périodes d’incubation. Ne laissez jamais sécher les cellules. Ne versez jamais aucune des solutions directement sur le couvercle.</li>
	<li>Préparer 0,5% Triton X-100 en 13 mL de 1x PBS 10 min avant utilisation. Ajouter 2 mL dans chaque puits. Incuber pendant 15 min. Laver doucement 4x avec 1x PBS. REMARQUE : Triton X-100 est insoluble dans PBS à RT. Chauffer la solution Triton X-100 de 0,5 % à 37 °C dans un bain d’eau pour la dissoudre.</li>
	<li>Décongeler le sérum de chèvre 5 min avant utilisation. Diluer le sérum de chèvre en 1x PBS dans un rapport de 1:20 comme solution de blocage. Ajouter 150 μL à chaque couvercle et incuber pendant 20 min à RT. REMARQUE : Prolongez la période de blocage jusqu’à 60 min si nécessaire. Ne pas laver les cellules après le blocage avec du sérum de chèvre.</li>
	<li>Décongeler les anticorps primaires (c.-à-d. alpha tubuline anti-acétylée et tubuline anti-gamma) 5 min avant utilisation. Diluer les anticorps séparément dans 1x PBS comme suit: souris anti-acétylated alpha tubuline dans un rapport de 1:800 et lapin anti-gamma tubuline dans un rapport de 1:300. Supprimez la solution de blocage. Ne vous lavez pas. Ajouter 150 μL des deux dilutions d’anticorps aux couvercles et incuber pendant 60 min à RT. REMARQUE : Si vous couverez pendant la nuit utiliser 500–1 000 μL des solutions d’anticorps primaires, sceller la plaque de 6 puits avec du film de paraffine, et stocker à 4 °C. Sinon, utilisez 150 μL d’anticorps et incuber dans une chambre d’humidité.</li>
	<li>Retirez les anticorps primaires. Laver les couvercles très doucement 3x avec 2 mL de 1x PBS. Préparer les anticorps secondaires en 1x PBS en diluant séparément l’anti-souris de mouton Cy3 et l’anti-lapin de chèvre Alexa Fluor488 dans un rapport de 1:300. Ajouter 150 μL des deux dilutions d’anticorps secondaires aux couvercles. Incuber pendant 45 min à RT dans l’obscurité. REMARQUE : Incuber dans l’obscurité pour éviter le photobleaching. D’autres combinaisons d’anticorps secondaires peuvent être utilisées au besoin.</li>
	<li>Préparer une solution DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) selon les instructions du fabricant. Conserver l’excédent d’aliquots à -20 °C. Diluer 10 μL à partir d’un aliquot de stock (1:5,000) dans 50 mL de 1x PBS. Ajouter 2 mL de cette dilution aux couvercles. Incuber pendant 5 min à RT dans l’obscurité. REMARQUE : Il est important d’incuber les cellules dans l’obscurité pour éviter le photobleaching. La dilution du DAPI peut être stockée à 4 °C jusqu’à 1 mois.</li>
	<li>Préparez 2 aiguilles, toboggans, pinces à épiler et supports de montage. Étiqueter les diapositives.</li>
	<li>Retirez la solution DAPI des puits. Laver 3x avec 1x PBS. Mettez une goutte de support de montage sur chaque diapositive. Utilisez l’aiguille pour soulever doucement le couvercle du fond du puits. Retournez le couvercle à l’aide de la pince à épiler et placez-le doucement sur la goutte de support de montage. Retirez soigneusement les bulles.</li>
	<li>Protégez les lames de la lumière et rangez-les toute la nuit à 4 °C.</li>
	<li>Utilisez un microscope fluorescent ou confocal avec un grossissement élevé pour visualiser les cils primaires. REMARQUE : Les lames peuvent être stockées dans l’obscurité à 4 °C pendant jusqu’à 2 mois.</li>
</ol>

<ol><li>Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+primary+cilia%3A+a+sensory+part+of+centrosomal+complex+in+tissue+cells%2C+but+a+%22sleeping+beauty%22+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells.</a> Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Primary+cilia%22">Primary cilia</a>. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).</li>
<li>Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+levels+of+cytosolic+tubulin+regulate+ciliary+length+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).</li>
<li>Filipová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation+increases+primary+cilia+incidence+and+induces+multiciliation+in+C2C12+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts.</a> Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).</li>
<li>Filipová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxic+effect+of+cytostatics+on+primary+cilia+frequency+and+multiciliation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).</li>
<li>Gadadhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+glycylation+controls+primary+cilia+length%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tubulin glycylation controls primary cilia length.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).</li>
<li>Shamloo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Hypobaric+Hypoxia+Modulates+Primary+Cilia+Differently+in+Adult+and+Fetal+Ovine+Kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys.</a> Frontiers in Physiology. 8, 677(2017).</li>
<li>Malone, A. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+mediate+mechanosensing+in+bone+cells+by+a+calcium-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).</li>
<li>Luesma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neurons+show+a+primary+cilium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Enteric neurons show a primary cilium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).</li>
<li>Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEF1-dependent+Aurora+A+activation+induces+disassembly+of+the+primary+cilium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium.</a> Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+transition+zone+activation+of+phosphorylated+Tctex-1+controls+ciliary+resorption%2C+S-phase+entry+and+fate+of+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).</li>
<li>Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+reciliation+of+RPE1+cells+in+late+G1+phase%2C+and+ciliary+localisation+of+cyclin+B1%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1.</a> FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).</li>
<li>Malicki, J. J., Johnson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cilium%3A+Cellular+Antenna+and+Central+Processing+Unit%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit.</a> Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).</li>
<li>Morleo, M., Franco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Autophagy-Cilia+Axis%3A+An+Intricate+Relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship.</a> Cells. 8 (8), 905(2019).</li>
<li>Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOtt%2C+C+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).</li>
<li>Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+epithelial+primary+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).</li>
<li>Lauring, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+software+for+automated+cilia+detection+in+cells+%28ACDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">New software for automated cilia detection in cells (ACDC).</a> Cilia. 8 (1), 1(2019).</li>
<li>Conroy, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-NAP1+and+rootletin+restrain+DNA+damage-induced+centriole+splitting+and+facilitate+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).</li>
<li>Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKim%2C+JH+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22">Biochimica et Biophysica Acta</a>. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).</li>
<li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+are+decreased+in+breast+cancer%3A+analysis+of+a+collection+of+human+breast+cancer+cell+lines+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).</li>
<li>Smith, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+HDAC6+Activity+Modulates+Ciliogenesis+and+Subsequent+Mechanosensing+of+Endothelial+Cells+Derived+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).</li>
<li>Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilium+loss+in+mammalian+cells+occurs+predominantly+by+whole-cilium+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding.</a> PLOS Biology. 17 (7), 3000381(2019).</li>
<li>Hua, K., Ferland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+methods+can+differentially+affect+ciliary+protein+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling.</a> Cilia. 6 (1), 5(2017).</li>
<li>Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+detection+of+primary+cilia+in+endothelial+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models.</a> Cilia. 4, 11(2015).</li>
<li>DiDonato, D., Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+methods+for+the+study+of+lipid+droplets+by+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Plusieurs auteurs ont décrit diverses méthodes pour la détection des cils primaires, décrivant parfois également diverses méthodes de fixation qui peuvent affecter leur détection6,20,21,22. Quoi qu’il en soit, il est difficile de trouver un protocole complet et simple pour la détection. La disponibilité immédiate d’une telle méthode serait sans aucun doute d’une grande aide à l’étude de l’étude...

Les cils primaires sont des structures sensorielles, solitaires, liées à la membrane, non-motiles associées au centriole mère de la cellule. Les cils primaires se trouvent sur la plupart des cellules vertébrées, à l’exception des globules rouges, des adipocytes1et des hépatocytes2. Les cils primaires sont formés sous forme d’axoneme allongé composé de microtubules, dont le principal composant est l’α-tubuline. L’axoneme pousse à partir du corps basal, qui est structuré à partir de γ-tubuline. La longueur des cils primaires varie entre 2 et 10 μm; cependant, ses dimensions peuvent changer pendant la glycylation, la famine, l’hypoxie, le stress cytotoxique, ou après exposition au rayonnement ionisant3,4,5,6,7. Habituellement, les cellules n’ont qu’un seul cilium primaire, qui est impliqué dans la morphogenèse et les voies de signalisation cellulaire importantes pour la prolifération cellulaire et la différenciation8,9.
Les cils primaires sont régulés dynamiquement au cours de la progression du cycle cellulaire, en particulier pendant les phases G0/G1, et résorbés avant d’entrer dans la mitose dans un processus associé à la déacétylation de tubuline médiée par HDAC6 (histone deacetylase 6)10. Le moment exact de la résorption primaire des cils dépend du type de cellule et de l’expression des gènes directement impliqués dans ce processus, tels que Aurora A, Plk1, TcTex-111,12,13. Selon le type de cellule, les cils primaires expriment différents types de récepteurs, canaux ions et voies de signalisation actives. Il s’agit notamment des récepteurs de signalisation les plus importants affectant la prolifération et la survie, EGFR, PDGFR, et FGFR. Sont également inclus quelques-unes des voies de signalisation qui peuvent affecter la fonction d’un ou plusieurs organes, y compris hedgehog, Notch, et Wnt. Grâce à ces récepteurs et voies de signalisation, les cils primaires effectuent également une fonction chimiosensorielle. Cette fonction permet aux cils primaires de détecter des ligands spécifiques pour Notch, les hormones et les substances biologiquement actives comme la sérotonine ou la somatostatine. D’autres fonctions spécifiques exposées par des cils primaires de différentes longueurs incluent la réaction aux changements de température, de gravité et d’osmolalité14.
Les cils primaires peuvent être visualisés par diverses méthodes, telles que la visualisation en direct, la microscopie électronique de transmission, l’imagerie 3D, ou par logiciel pour la détection automatique des cils primaires5,15,16,17. Cependant, ces méthodes sont hautement spécialisées et la recherche continue a besoin de méthodes de base, rapides et faciles pour tacher les cils primaires à chaque étape de la recherche. Décrit est une méthode facile et utile pour la détection des cils primaires dans les cellules cultivées.

<table><tbody><tr><td>Plaque 6 puits</td><td>TPP</td><td>92406</td><td>Dimensions 128x86x22 mm</td></tr><tr><td>Alexa Fluor488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-546-047</td><td>AffiniPure F(ab' ? Fragment de chèvre Anti-Lapin IgG</td></tr><tr><td>Anti-Tubuline &gamma ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td><td>Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a</td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td>Myoblast (souris)</td></tr><tr><td>Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2181</td><td>Anti-Mouse IgG (molécule entière) F(ab&prime ;)2 fragments&ndash ; Anticorps Cy3 produit chez le mouton</td></tr><tr><td>Dapi (4&prime ;,6-Diamidino-2-dichlorhydrate de phénylindole)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute ; s Aigle modifié&acute ; s moyen</td><td>Thermo Scientific</td><td>11960044</td><td>Glycémie élevée, pas de glutamine, Gibco</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>avec MgCl2 et CaCl2, filtrée stérile, adaptée à la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Thermo Scientific</td><td>16000044</td><td>Filtrée stérile, Gibco</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>MEF</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1039</td><td>Fibroblaste embryonnaire de souris</td></tr><tr><td>Tubuline monoclonale anti-acétylée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td>Anticorps monoclonal anti-acétylé de tubuline produit chez la souris</td></tr><tr><td>NHLF</td><td>Lonza</td><td>CC-2512</td><td>Fibroblastes pulmonaires primaires (humain)</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normale</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td>Poudre</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>10 000 unités de pénicilline et 10 mg de streptomycine par mL dans 0,9 % de NaCl, filtré stérilement</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastes cutanés</td><td>Gracieuseté de l’Université Charles, Faculté de médecine de Hradec Kr&aacute ; amour&eacute ;.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Couvercles carrés</td><td>Thermo Scientific</td><td>22X22-1.5</td><td>Verre borosilicaté, 22x22mm,</td></tr><tr><td>Carré Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0.25 %)</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200072</td><td>Stérile-Filtré, Gibco</td></tr></tbody></table>

détection simple des cils primaires par immunofluorescence

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Les cils primaires sont régulés dynamiquement au cours de la progression du cycle cellulaire, en particulier pendant les phases G0/G1 du cycle cellulaire, étant résorbés avant la mitose. Les cils primaires peuvent être visualisés avec des méthodes très sophistiquées, y compris la microscopie électronique de transmission, l’imagerie 3D, ou en utilisant un logiciel pour la détection automatique des cils primaires. Cependant, la coloration immunofluorescente des cils primaires est nécessaire pour effectuer ces méthodes. Cette publication décrit un protocole pour la détection facile des cils primaires in vitro en tachant la tubuline alpha acétylée (axoneme) et la tubuline gamma (corps basal). Ce protocole de coloration immunofluorescente est relativement simple et donne des images de haute qualité. Le présent protocole décrit comment quatre lignées cellulaires (C2C12, MEF, NHLF et fibroblastes cutanés) exprimant des cils primaires ont été fixées, immunostainées et imageuses à l’aide d’un microscope fluorescent ou confocal.

La coloration immunofluorescente des cils primaires est une procédure relativement simple qui se traduit par des images de haute qualité. Dans ces expériences, les fibroblastes exprimant les cils primaires ont été fixés, immunostained, et photographiés dans un microscope fluorescent ou confocal suivant le protocole décrit ci-dessus. Le cilium primaire a été détecté à l’aide d’acétylated α-tubuline et γ-tubuline. L’évaluation des cils primaires peut être effectuée à divers niveaux et tout changement à cet égard peut être ...

Les cils primaires sont des structures extracellulaires associées au centriole. La détection primaire des cils par coloration immunofluorescente est une procédure relativement simple qui se traduit par des images de haute qualité. Dans ce protocole, les fibroblastes exprimant des cils primaires ont été fixés, immunostained, et photographiés dans un microscope fluorescent ou confocal.

Détection simple des cils primaires par immunofluorescence

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Ce protocole permet une détection rapide et facile des cils primaires dans les cellules de culture, dans une variété d’efforts de recherche. La méthode pourrait être utilisée dans le désordre qui affectent les corps basiques des cils primaires. Cette procédure peut également être appliquée pour colorer les cils primaires dans les tissus incorporés paraffine ou pour d’autres expériences où la fluorescence est nécessaire.Commencez par autoclaving 22 par 22 millimètres de glissements de couverture, et la préparation des matériaux pour l’expérience. Décongeler le FBS et la streptomycine de pénicilline, et réchauffer la culture à température moyenne à ambiante. Passer les cellules avec trypsine EDTA et PBS.Préparez du paraformaldéhyde frais à 4 %, un milieu de culture et une solution de gélatine à 1 %, selon les directives manuscrites. Nettoyez ensuite le capot d’écoulement laminaire avec 70 % d’éthanol et placez tous les matériaux nécessaires à l’intérieur. Le paraformaldéhyde est extrêmement dangereux.L’EPI approprié doit être porté en tout temps, et il ne doit être manipulé que dans une hotte chimique. Après avoir augmenté les cellules désirées à 70%confluence les enlever de l’incubateur, et les placer dans le capot d’écoulement laminaire. Retirer le milieu de culture et rincer les cellules deux fois avec PBS.Ajouter environ deux millilitres de 0,25% trypsine EDTA à la fiole de culture, et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Vérifiez périodiquement les cellules sur le microscope inversé pour surveiller le détachement. Lorsque les cellules se sont détachées doucement les resuspendre en 10 millilitres de milieu de culture, pipetting soigneusement pour créer une suspension à cellule unique.Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres et la centrifuger à 200 fois G’pendant cinq minutes. Décanter le supernatant puis ajouter 10 millilitres de milieu de culture, et doucement resuspendre la pastille. Prenez 20 microlitres de la suspension cellulaire et mélangez-le avec du bleu trypan à un rapport volume un pour un.Comptez ensuite les cellules à l’aide de l’hémocytométrie standard. Placez un glissement de couvercle à l’intérieur de chaque puits d’une plaque de six puits, et enrober le bordereau de couverture de deux millilitres de la solution de gélatine, ce qui aidera les cellules attachées à la feuille de couverture. Retirer la gélatine et laisser sécher l’assiette à l’air libre pendant quelques minutes.Ensemencer 100 000 fibroblastes dans chaque puits et ajouter deux millilitres de milieu de culture. Puis incuber les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius, cinq pour cent de dioxyde de carbone, et 90% d’humidité relative. Après l’incubation traiter les cellules pour induire la ciliation.Réchauffez le paraformaldéhyde de 4% à température ambiante, et préparez une pipettes de pâturage, ABS, un récipient de déchets, tubes coniques de 15 millilitres, micro pipettes, et bouts. Prenez les cellules de l’incubateur, et placez-les sur le banc du laboratoire. Retirez les supports de chaque puits, en laissant le bordereau de couverture.Lavez doucement les cellules trois fois avec deux millilitres de PBS. Ajoutez ensuite deux millilitres de la PFA de 4% dans chaque puits pour fixer les cellules. Incuber la plaque pendant 10 minutes à température ambiante, puis retirer le PFA, et répéter les lavages avec PBS.Ajouter deux millilitres de 0,5% Triton X-100 à chaque puits, et incuber la plaque pendant 15 minutes. Ensuite, lavez les puits quatre fois avec PBS. Pour faire la solution de blocage, décongeler un sérum de chèvre pendant cinq minutes, et le diluer dans PBS à un rapport d’un à 20.Ajouter 150 microlitres de cette solution à chaque glissement de couvercle, et incuber la plaque pendant 20 minutes. Décongeler les anticorps primaires pendant cinq minutes, et les diluer séparément dans PBS, tel que décrit dans le manuscrit du texte. Retirez la solution de blocage des feuillets de couvercle et ajoutez 150 microlitres des deux solutions d’anticorps.Ensuite, incuber la plaque pendant 60 minutes à température ambiante. Retirez les anticorps primaires et lavez doucement les feuillets de couverture trois fois avec deux millilitres de PBS. Diluer cy3 mouton anti-souris et Alexa fluor 488 chèvre anti-lapin en PBS, à un rapport de un à 300, et ajouter 150 microlitres des deux solutions d’anticorps secondaires à la feuille de couverture.Préparez une solution DAPI de travail en diluant 10 microlitres du stock en 50 millilitres de PBS, et ajoutez deux millilitres de cette dilution aux glissements de couverture. Incuber la plaque pendant cinq minutes dans l’obscurité, à température ambiante. Avant de placer les feuillets de couverture sur les glissières, préparez deux aiguilles, pinces à épiler et supports de montage, et étiquetez toutes les diapositives.Retirez la solution DAPI des puits et lavez-les trois fois avec du PBS. Mettez une goutte de supports de montage sur chaque diapositive. Utilisez l’aiguille pour soulever doucement le glissement du couvercle du fond du puits.Ensuite, retournez-le et placez-le doucement sur la goutte de supports de montage à l’aide de la pince à épiler. Retirez soigneusement les bulles. Protégez les glissières de la lumière et rangez-les toute la nuit à quatre degrés Celsius.Le lendemain, utilisez un microscope fluorescent ou confocal avec un grossissement élevé pour visualiser les cils primaires. Ce protocole a été utilisé pour fixer l’immunostain, et l’image de diverses lignées cellulaires exprimant des cils primaires. Quand les myoblastes de souris ont été exposés au rayonnement ionisant à diverses doses, il a été constaté que des doses plus élevées induisent l’aspect des cils primaires multiples.Tandis que de faibles doses ont eu comme conséquence l’aspect des cils primaires simples. De même, quand les fibroblastes humains de poumon ont été rayonné à une basse dose, les cils primaires simples ont été détectés par immunofluorescence. Une augmentation des cils primaires a été observée chez les fibroblastes embryonnaires de souris qui étaient affamés, démontrant que le stress métabolique affecte les incidents des cils primaires.Quand les fibroblastes de peau ont été traités avec 120 doxorubicine nanomolaire, ils ont exprimé un cil primaire simple. Des doses plus élevées induisent l’apparition de cils primaires multiples. Les fibroblastes traités avec 1,25 nanomolaire Taxol ont également exprimé un seul cil primaire.Mais les cils multiples n’ont pas été détectés après traitement avec des doses plus élevées. Lors de l’ouverture de ce protocole assurez-vous de suivre tous les règlements PPE. Gardez à l’esprit les besoins culturels de votre lignée cellulaire de choix et choisissez soigneusement vos anticorps.Cette procédure ne peut pas être suivie directement par d’autres procédures, puisque les cellules sont irrécupérables. Au lieu de cela, des expériences parallèles devraient être programmées.

simple-detection-of-primary-cilia-by-immunofluorescence

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

L'analyse de l'interaction des nanoparticules avec des sous-populations de cellules immunitaires définies par cytométrie de flux.

Détection de nanoparticules fluorescentes Interactions avec immunitaire primaire sous-populations de cellules par cytométrie en flux

Les cils des neurones sensoriels olfactifs contiennent des protéines de la cascade de transduction du signal, mais une analyse spatiale détaillée de leur distribution est difficile dans les cryosections. Nous décrivons ici une approche optimisée pour le marquage de l’ensemble du montage et la visualisation en face des protéines ciliaires.

Mont entiers étiquetage des Cilia dans le système olfactif principal de souris

Ici, nous présentons un protocole basé sur la détection immunohistologique de la protéine c-FOS, une technique classique utilisée pour l’identification de populations neuronales impliquées dans des réponses physiologiques spécifiques in vivo et ex vivo.

La protéine c-FOS détection immunohistologique: Un outil utile comme marqueur des voies centrales impliquées dans les réponses physiologiques spécifiques<em&gt; In Vivo</em&gt; et<em&gt; Ex Vivo</em

Récemment, nous avons cartographié les emplacements de spatiales en trois dimensions (3D) de voies de transport pour différentes protéines translocation à l’intérieur des cils primaires dans des cellules vivantes. Ici ce détails papier expérimental, le processus d’échantillons biologiques et les analyses de données pour la fluorescence 3D Super-resolution imaging approche nouvellement appliqués en live cils primaires.

Application de la microscopie vitesse haut débit Super-résolution en direct cil primaire

Nous décrivons l’isolement immunomagnetic des oligodendrocytes principal de la souris, qui permet d’isoler des cellules in vitro culture rapide et spécifique.

Isolation de Immunomagnetic rapide et spécifique de souris primaire Oligodendrocytes

L’utilisation de l’intelligence artificielle (IA) pour analyser les images émerge comme une approche puissante, moins biaisée et rapide par rapport aux méthodes couramment utilisées. Ici, nous avons formé Ai à reconnaître un organite cellulaire, des cils primaires, et à analyser des propriétés telles que la longueur et l’intensité de la coloration de manière rigoureuse et reproductible.

Approches de l’intelligence artificielle pour évaluer les cils primaires

Nous présentons des protocoles détaillés pour la génération et la caractérisation de modèles de développement néocortical basés sur des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hIPSC) 2D et 3D, ainsi que des méthodologies complémentaires permettant une analyse qualitative et quantitative de la biogenèse et de la fonction du cilium primaire (PC).

Modèles 2D et 3D à base de cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour disséquer l’implication du cilium primaire au cours du développement néocortical

Nous présentons ici un protocole d’électroporation in vitro reproductible pour la manipulation génétique des précurseurs de cellules granulaires cérébelleuses primaires (GCP) qui est rentable, efficace et viable. De plus, ce protocole démontre également une méthode simple pour l’étude moléculaire des voies de signalisation primaires du hérisson dépendantes du cilium dans les cellules GCP primaires.

Méthode d’électroporation efficace et rentable pour étudier les voies de signalisation primaires dépendantes du cilium dans le précurseur de cellules granulaires

L’analyse par microscopie vidéo à haute vitesse est un outil relativement facile à réaliser, rapide, rentable et, entre des mains expérimentées, un outil considérablement fiable pour le diagnostic de première ligne de la dyskinésie ciliaire primaire, qui devrait être disponible dans tous les centres impliqués dans le diagnostic et le traitement des maladies pulmonaires graves.

Analyse par microscopie vidéo à grande vitesse pour le diagnostic de première ligne de la dyskinésie ciliaire primaire

Cette méthode décrit l’exploitation du signal endogène dans un modèle murin transgénique ARL13B-CENTRIN-2 pour imager des cils primaires in situ, en trois dimensions sur de grandes surfaces de tissu minéralisé, de la collecte de tissus à l’analyse de l’organisation des cils. Ce protocole peut également être appliqué à d’autres types de tissus.

Imagerie volumétrique et analyse des cils primaires dans le tissu musculo-squelettique à l’aide du modèle murin ARL13B-CENTRIN-2

Les troubles de la laminopathie entraînent souvent des modifications de l’enveloppe nucléaire, ce qui peut provoquer des bulles et des fuites nucléaires. Cette étude présente une méthode d’immunofluorescence pour visualiser la lame nucléaire avec de l’ADN double brin (ADNdb), fournissant un moyen d’évaluer la structure et l’intégrité nucléaires dans les cellules de mammifères.

Détection de la bulle nucléaire et de la fuite d’ADN dans les cellules de mammifères par immunofluorescence

Apprenez la détection des cils primaires par immunofluorescence dans les fibroblastes. Cette méthode permet d'étudier les troubles associés aux corps basaux et d'explorer le rôle des cils dans la signalisation cellulaire.

Détection simple des cils primaires par immunofluorescence

Explorer plus de vidéos